Transfektion - die Übertragung von genetischem Material in Säugetierzellen - ist ein wertvolles Hilfsmittel, das den Wissenschaftlern ermöglicht, Neuronen und Nervengewebe genetisch zu manipulieren. Die einzigartigen Eigenschaften der empfindlichen Zellen machen die Transfektion anspruchsvoll und erfordern spezielle Techniken. Dieses Video bespricht die Grundlagen hinter der Transfektion von Neuronen und stellt Strategien vor, die häufig bei diesen Zellen verwendet werden, einschließlich der Nukleofektion, der biolistischen Transfektion und der viralen Transduktion. Schließlich werden wir Anwendungen der Transfektionstechniken in der zell- und molekular neurowissenschaftlichen Forschung diskutieren.
Nun wollen wir mit dem Überblick beginnen, wie die Transfektion funktioniert. Obwohl genetisches Material in unmittelbarer Nähe zu einer kultivierten Zelle geliefert werden kann, indem es zum umgebenden Medium dazu gefügt wird, können Nukleotide die Zellmembranen nicht effizient durchdringen.
Alle Transfektionsprotokolle sind entworfen, um genetisches Material zu ermöglichen, diese Schranke zu umgehen. Nukleotide, die die Proteinproduktion blockieren, wie Silencing RNAs, können sofort ihre Funktion ausüben, sobald sie in das Zytoplasma gelangen. Allerdings müssen DNA-basierte Konstrukte für die Translation in den Zellkern transportiert werden, bevor die Proteinsynthese beginnen kann. In teilenden Zellen kann der Aufbruch der Kernhülle während der Mitose zur Aufnahme von transfizierter DNA in den bildenden Tochterzellkernen führen. Da die meisten kultivierten Neuronen postmitotische - oder nicht teilende - Zellen sind, sind spezialisierte Transfektionsprotokolle erforderlich, um erfolgreich die Genexpression zu induzieren.
Beginnen wir unsere Übersicht über diese Protokolle mit der Nukleofektion. Diese Technik verwendet eine Kombination von einem induzierten elektrischen Feld und chemischen Reagenzien, die zusammenwirken, um vorübergehend transiente, porenartige Strukturen in den Zell- und Kernmembranen zu erzeugen. Da Nukleotide geladen sind, lenkt das elektrische Feld auch die Bewegung der DNA durch die Poren.
Um dieses Verfahren durchzuführen, werden Nervenzellen in einer Suspension zuerst durch Zentrifugation in einem Pellet gesammelt bevor sie in einem kommerziellen Nukleofektionsreagenz resuspendiert werden. Das Zellgemisch wird dann mit gereinigter DNA vereinigt und in eine Elektroporationsküvette transferiert, die zwei Aluminiumplatten hat, die den elektrischen Kontakt mit dem Nucleofector Apparat herstellen. Dieser Apparat liefert eine Reihe von schnellen elektrischen Impulsen, dessen Anzahl und Dauer basierend auf dem Zelltyp angepasst wird. Nach der Nukleofektion können die Zellen mit Kulturmedium verdünnt werden und für weiteres Wachstum ausplattiert werden.
Alternativ schießt die Genkanonen-Technik durch die Transfektionsbarrieren, durch das schießen von Kugeln, die genetisches Material enthalten, durch Zell- und Kernmembranen.
Um Kugeln für die Genkanone herzustellen, wird DNA, die das Gen von Interesse kodiert, auf Mikrometermaßstab Perlen ausgefällt, in der Regel aus Gold. Nach einer 10-minütigen Inkubation werden die Perlen gewaschen und in einen Schlauch transferiert. Der Schlauch wird dann gedreht bis die Lösung trocknet, dies führt zu einer gleichmäßigen Beschichtung der Perlen. Als nächstes wird der Schlauch in Patronen geschnitten und in die Kanone geladen. Die gasbetriebene Lieferung der genetischen Ladung kann bei Zellen angewendet werden, die in Standard-Kulturplatten wachsen, durch ein einfaches Ziehen des Auslösers.
Zum Schluß, die virale Transduktion nutzt den Vorteil des viralen Lebenszyklus, um genetisches Fremdmaterial in den Zellkern zu liefern. RNA, die das Gen von Interesse codiert, wird in modifizierten Retroviren bekannt als lentivirale Vektoren verpackt, die Zugang durch die Bindung an spezifischen Membranproteinen in den Zielzellen erhalten, welches ein Membranfusionsereignis auslöst. Die virale RNA wird dann in einen komplementären DNA-Strang reverse transkribiert, der in den Zellkern transportiert wird.
Vor dem Beginn dieses Verfahrens, muss beachtet werden, dass Viren die Zellen in unserem Körper als auch die in der Schale infizieren können, deswegen sind folgende Sicherheitsrichtlinien äußerst wichtig.
Der erste Schritt ist das Erzeugen der lentiviralen Partikel, die das Gen von Interesse enthalten. Dies wird durch die Expression der Bausteine des Virus in einer humanen Zelllinie, die für die virale Produktion optimiert wurde, wie 293T-Zellen durchgeführt. Um eine unnötige Ausbreitung der erzeugten Viren zu vermeiden, werden die erforderlichen Gene für den Zusammenbau getrennt von dem Transfervektor gehalten, dessen Sequenz in den infektiösen Partikeln eingeschlossen wird. Es dauert etwa 2 Tage für die vollständig zusammengebauten Viren, um in das Kulturmedium freigesetzt zu werden, in dem sie gesammelt und durch Ultrazentrifugation konzentriert werden können. Als Nächstes wird die geeignete Konzentration oder Titer an Virus durch die Ermittlung des Transduktionserfolgs in einer Testzelllinie ermittelt. Der lentivirale Vektor wird dann zu der neuronalen Zielkultur gegeben und in der Regel 24 bis 48 Stunden inkubiert, um sicherzustellen, dass eine Infektion stattgefunden hat.
Da wir nun mit den gebräuchlichen Transfektionstechniken vertraut sind, die, die verwendet werden, hängen von den spezifischen Zielen der Experimente ab. Schauen wir uns einige Beispiele an.
Zu Beginn, die Beobachtung der Reifung von Neuronen in der Kultur, ermöglicht die detaillierte Analyse der morphologischen Veränderungen, die wichtig für die neuronale Konnektivität sind, wie die Bildung der dendritischen Dornen. Um die Zellmorphologie im Laufe der Zeit sichtbar zu machen, haben diese Forscher Gebrauch von der Nukleofektion gemacht, um ein fluoreszierendes Protein in kultivierten Neuronen zu liefern. Hier wurde ein fluoreszenzmarkiertes Tubulin-Protein in eine Untergruppe von Zellen transfiziert, sodass eine detaillierte Analyse der Zellprozesse über Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht wird. Weil das Expressionslevel während der gesamten Lebensdauer des Neurons aufrechterhalten wurde, konnten morphologische Analysen für mindestens einen Monat lang in der Kultur durchgeführt werden.
Die Transfektion kann auch verwendet werden, um den Einfluss von bestimmten Genmutationen auf die Neuronenfunktion zu testen. Eine Genkanone kann verwendet werden, um DNA bereitzustellen, die den Wildtyp- oder mutierte Versionen eines Proteins kodiert und dadurch können kurzfristige Auswirkungen auf die Zellbiologie beurteilt werden, beispielsweise durch die Patch-Clamp-Aufzeichnung der Neuronenaktivierung.
Schließlich eine übliche Strategie für das Testen einer Genfunktion, ist zu beobachten, was mit Zellen passiert, wenn die Expression blockiert ist. Für diese Experimente können lentivirale Vektoren verwendet werden, um Silencing RNA-Konstrukte bereitzustellen, die die Proteinsynthese verhindern. In diesem Experiment führt der Knockdown von Genen, die mit der Parkinson-Krankheit assoziiert sind, zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen.
Das war die JoVE Einleitung zur Transfektion von Neuronen. In diesem Video haben wir Prinzipien der Transfektion von Neuronen sowie Verfahren und Anwendungen für drei häufige Transfektionsstrategien eingeführt. Danke für das zuschauen!
