Die NSF-MRT-Programm (CHE: 1229103) ist für die Finanzierung des Kaufs von neuen Steuerelektronik, Software, Flüssigkeitszellen und andere Geräte benötigt, um eine Dual-AFM / STM zusammen anerkannt. Wir erkennen die gemeinsamen Einrichtungen an der Universität von Chicago NSF-MRSEC Programm (DMR-0820054) für die Unterstützung bei AFM Instrumentierung, Ausbildung und Bildgebung, und für Systemzeit von der Materialforschung Einrichtungen Network (DMR-0820054) zur Verfügung gestellt. Wir danken besonders Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, und Prof. Ka Yee Lee für vor die Finanzierung des NSF-MRT Vorschlag, dass die notwendige Messtechnik, um unsere Campus gebracht begrüßen unsere Studenten. Wir erkennen die Finanzierung aus einem Titel III STEM Grant (ID: P031C110157) Northeastern Illinois University verliehen, die Forschungsstipendien Sommer für Studierende und Lehr sowie Unterstützung für Verbrauchsmaterialien zur Verfügung gestellt. Schließlich erkennen wir Bruker-Nano, Inc. für die weitere instrumentale Unterstützung und für die Erlaubnis, reproduce ein Diagramm, das den Mechanismus der Peakforce QNM und das Wort ScanAsyst verwenden, um die automatische Software zu beschreiben.

1. Computer und Mikroskop Set Up <ol><li> Öffnen Sie das Ventil der N 2-Zylinder, und stellen Sie die Regler, um sicherzustellen, dass die Lufttisch schwimmt und Niveau. </li><li> Schalten Sie den Computer, Controller und Faseroptik-Licht in dieser Reihenfolge. </li><li> Stellen Sie den Scanner an AFM / LFM-Modus und in der Mitte der Kamera über der AFM Kopf. </li><li> Offene Software. Wählen Experiment Kategorie &quot;Nanomechanische Eigenschaften&quot;, &quot;Quantitative Nano Mapping&quot; unter Experiment-Gruppe und &quot;Peakforce QNM in Fluid&quot; unter Experiment. Klicken Sie auf Laden Experiment und dann einrichten. </li><li> Fokussieren Sie die Kamera mit dem Ziel, den Z Oberfläche der Bühne zu sehen. Verwendung des groben oben / unten bewegen Piezos die Bühne etwa 1 mm unter der Oberfläche des AFM Kopföffnung. </li></ol> 2. Herstellung von Glimmer-Oberfläche <ol><li> Drücken eines Aufklebers auf das Gesicht eines sauberen Probenträgerplatte (15 mm Durchmesser, 0,8 mm dick). Schieben Sie einen Glimmer V-4Grade Platte (25 x 25 x 26 mm) auf die Klebe bis fest angeschlossen ist. </li><li> Reiben ein Stück Tesafilm auf das Glimmer gewährleisten sie vollständig ohne Luftblasen eingehalten werden. Ziehen Sie das Band vor der Glimmer von einer Seite zur gleichmäßig spalten. Bei Bedarf wiederholen, um sicherzustellen, der Glimmer ist flach. </li><li> Fassen Sie die Stützscheibe, sauber Glimmer Seite nach oben, mit einem Paar von Kreis Pinzette (Plattengreifer) und legen Sie den Scanner ein. Der Glimmer sollte unter dem Niveau des AFM Kopföffnung sein. </li></ol> 3. Flüssigkeitszelle Versammlung und Imaging von Glimmeroberfläche <ol><li> Spülen der Fluidzelle, O-Ring, Spritzenadapter, Schlauch-Adapter, und die Ausstoßschlauch in 100% Ethanol. Spülen Sie die Flüssigkeitszelle in DI-Wasser. Lassen Sie alle Teile Luft vollständig trocknen. </li><li> Schieben Sie den Schlauchadapter in den Anschluss auf der sauberen Flüssigkeitszelle. O-Ring drücken Sie vorsichtig in die Mitte der Vertiefung Fluidzelle mit Flachkopf Pinzette. </li><li> Drücken Sie die Feder leicht auf die Sonde Halteclip und drehen Sie es weg von der Groove für den Tipp. </li><li> Fassen Sie die Sonde am langen Ende von der Spitze mit Flachkopf Pinzette. Die Sonde in die Nut mit der Spitze zur Mitte der Zelle. Schieben Sie den Frühling in und stellen Sie die Halteklammer über die Sonde, um sie (Abbildung 1B) zu sichern. </li><li> Überprüfen Sie die Klemme an der AFM, um sicherzustellen, es ist vollständig eingefahren (Abbildung 1c). </li><li> Legen Sie die Flüssigkeitszelle, O-Ring und die Sonde nach unten, oben auf dem Glimmer Probe. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle, um auf die Bolzen des AFM Ruhe. Senken Sie die Klammer zur Stabilisierung der Zellflüssigkeit auf der Bühne. Drücken Sie die Down-Schalter auf dem Mikroskop, bis eine visuelle Inspektion zeigt die O-Ring fest zwischen der Trägerscheibe und der Fluidzelle zusammengedrückt. </li><li> Während Sie den Monitor, konzentrieren sich die Grobtrieb, um die Spitze der Fluidzelle auf dem Bildschirm sichtbar zu machen. </li><li> Bewegen Sie den Mikroskop, bis es ein klares Bild von der Spitze über die X / Y-Stellknöpfe und die Z-Ziel. Die Spitze wird AppOhr wie eine metallische, goldene Dreieck. Bewegen der Spitze näher an die Probenoberfläche unter Verwendung der unten piezoHebel am Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf die Reflexion der Spitze. Verfolgen Sie die aktuellen Freischwinger in Beziehung zu seinen Überlegungen. In diesem Stadium sollten sie aneinander ausgerichtet werden, jedoch nicht vollständig überlappen. </li><li> Befestigen Sie den Spritzenadapter in eine sterile 1 ml Spritze. Ein Ende des Ausstoßschlauch mit dem Spritzenadapter und das andere Ende des Schlauchs in den Behälter der Pufferlösung. Ziehen Sie die Kolben der Spritze. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch an den Schlauchadapter an der Fluidzelle. Drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit die mittlere Kammer vollständig ausfüllt. Prüfen Sie die Zelle, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen. Überprüfen, um zu sehen, gibt es keine Flüssigkeit auslaufen aus der Fluidzelle auf das Mikroskop. Legen Sie die Spritze auf einem festen Träger angehoben. </li><li> Verwenden Sie die Kamera-Feed und die X / Y-Knöpfe Übersetzung, um den Laser auf dem Bildschirm (ein diffuser roter Punkt) zu lokalisieren. Mit dem Laser movement Bedienknöpfe, bewegen Sie den Laser auf die Spitze. </li><li> Feineinstellung der Laser und Spiegel kontrolliert, bis das Summensignal auf dem Mikroskop angezeigt wird maximiert (Wert = 4 - 6). </li><li> Stellen Sie den Winkel des Quadranten-Diode mit den Knöpfen an der linken hinteren Seite und der linken oberen Seite der Scankopf an die vertikalen und horizontalen Auslenkungen am Mikroskop so nahe wie möglich bei Null (± 0,1) angezeigt senken. </li><li> In der Software, wählen Akquisitionsmöglichkeiten. Auf ein Minimum, wählen Höhe (Spur und Rück), Spitzenkraft Fehler und Deformation. Die anderen Optionen sind benutzerabhängig und kann auf der Grundlage der von der Experimentator gewünschten spezifischen Informationen angepasst werden. </li><li> Wählen Sie &quot;Linie&quot; für RT Flugzeug Fit in jedem Aufnahmefenster. Wählen Sie &quot;None&quot; für die OT Flugzeug Fit in den hohen Fenstern. Stellen Sie die X und Y-Offset und Scanwinkel auf Null, wenn nicht bereits geschehen. </li><li> Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz, der Probe pro Zeile bis 256, die ScanAsyst Selbststeuerungeinzelne, und ScanAsyst Auto Z Grenze ab. Ändere die Z Grenze bis 500 nm aufweist. Stellen Sie Scangröße bis 1 um. </li><li> Klicken einrasten. An diesem Punkt ist die Spitze der Oberfläche nähert. Während die Spitze nähern, beobachten Z Piezo Spannungsänderung in der unteren linken Ecke des Bildschirms. Wenn die Spitze außerhalb des Bereichs liegt, ziehen Sie die Spitze und Re-Ansatz. Wenn dies nicht erfolgreich ist, muss die Spitze, um einen erfolgreichen Ansatz umgestellt werden. Sobald die Spitze eingeschaltet ist, werden die Linien beginnen, sich auf jede der Erwerb Fenster, die ein Bild zu komponieren erscheint. </li><li> Nehmen Sie Bilder von Glimmer mit 1 x 1 um und vergrößern sich langsam, um zu gewährleisten, dass die Glimmeroberfläche eben und sauber ist. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme das Speichern von Bildern, wie sie erscheinen. Vergrößern und bewegen sich um die Oberfläche nach Wunsch. </li></ol> 4. Proteinablagerung und Herstellung der Probe für Imaging <ol><li> Erhalten gereinigtes Protein Probe 38 und auf Eis zu halten. Wenn in einem Gefrierschrank gelagert, aufgetaut Probe aufEis für 5 min. </li><li> Verdünnen das Protein zu 0,0010 mg / ml unter Verwendung von Kühl Bildgebung Pufferlösung. Die Abbildungspuffer verwendet hier 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl und 15 mM MgCl 2. </li><li> Füllen Sie ein 4-Kammer (100 x 15 mm) Petrischale mit Kühl Bildgebung Pufferlösung. Füllen Sie jede Kammer mit mindestens 5 ml Lösung. Vorsichtig mischen die verdünnte Proteinlösung mit der Spitze auf Mikropipette befestigt. </li><li> Anwenden 200 ul der verdünnten Proteinlösung auf der Oberfläche von Glimmer bereits vorbereitet. Nach 30 sec, holen die Protein / Glimmer-Oberfläche mit den kreisförmigen Pinzette (Plattengreifer). Halten Sie die Probe parallel zu dem Labortisch. </li><li> Während die Probe hält, tauchen sofort die Probe in der im ersten Quadranten der Petrischale (Schritt 4.2) enthaltenen Pufferlösung, während sichergestellt wird, dass die Probe parallel zum Becken der Petrischale ist. Nach 1 sec, entfernen Sie die Probe. </li><li> Weiter, um die Probe parallel zum Becken haltender Petrischale, wiederholen Sie Schritt 4.5 für die restlichen drei Quadranten. </li><li> Legen Sie die Festplatte auf einem trockenen staubfreien Tuch zu tanken überschüssige Feuchtigkeit und übertragen Sie die Festplatte auf die Bühne des Mikroskops. Die eigentliche Oberfläche nicht berühren mit dem Tuch. Erlauben nicht die Probe zu trocknen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,16. </li></ol> 5. Imaging Proteine ​​auf Glimmer- <ol><li> Klicken Sie auf Prüfparameter-Box auf der linken Seite des Bildschirms. Frühling Größe und Spitzenradius sollte basierend auf der Spitze eingesetzt eingestellt werden. </li><li> Klicken einrasten. Ähnlich wie bei der bildgebenden Verfahren Glimmer (Schritt 3.17), beobachten die z-Piezo-Fenster, wie die Spitze Ansätze. </li><li> Lassen Sie den Scanner, um Bild die gleiche Fläche für mindestens zwei aufeinander folgenden Durchgängen. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme, jede gesammelt Bild zu speichern. </li><li> Bewegen Sie den Scanner an einen neuen Region und / oder ändern Sie die Bildgröße nach Wunsch. </li><li> Nach der automatisierten Software Einstellen des fertig istScan-Parameter für eine bestimmte Bildgröße, drehen Sie die Software aus. </li><li> Manuell einstellen Scanrate, Z-Limit, die Anzahl der Zeilen und die Spannung, um die Feineinstellung des Fokus des Bildes. Wenn das Bild wird zu weit aus dem Fokus, drehen Software zurück auf die ursprüngliche Ausgangsposition zurück. Um die Auflösung eines Bildes beim Zoomen auf einem Protein zu erhöhen, verringern Sie die Scan-Rate und erhöhen die Anzahl der Linien proportional. </li><li> Nach dem Versuch, reinigen Sie die Flüssigkeit-Zelle mit 100% Ethanol und spülen Sie mit DI H 2 O. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle vollständig trocken. </li><li> Öffnen Sie die Daten Software, um Rohdaten-Bilder verarbeiten. Erste, glätten Sie das Bild durch Klicken auf die Flatten-Symbol. Wählen Sie Null-ter Ordnung und klicken Sie auf Ausführen. Je nach Bild kann eine Ebene passen notwendig sein, eine entsprechend flache Bild zu erhalten. In diesem Fall wählen Sie die Ebene fit Symbol und ziehen Sie eine Ebene einer flachen Bereich des Bildes mit dem Cursor. Klicken Sie auf Ausführen. Bei Bedarf wiederholen </li><li> Select die Registerkarte Querschnitt, um die Dimensionen des Proteins messen. Ziehen Sie eine Linie mit dem Cursor bewegen Sie ihn über das Molekül oder Bereich analysiert werden. Wiederholen für mehrere Bereiche und die Software wird eine Überlagerung zu erzeugen. Exportieren Sie das Bild oder die verwendet werden, um Bild in einem Format kompatibel zu anderen Software-und Zeichenprogrammen erzeugen Daten. </li></ol>

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	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-Resolution+Microscopy+in+Water+Science.">Atomic-Resolution Microscopy in Water Science.</a> 232, 211-213 (1986).</li><li>Nikiforov, M. P., Darling, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Quantitative+Conductivity+and+Mechanical+Properties+Measurements+of+Organic+Photovoltaic+Materials+using+AFM.">Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM.</a> J. Vis. Exp. 71, (2013).</li><li>Bahatyrova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Native+Architechure+of+a+Photosynthetic+Membrane.">The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane.</a> Nature. 430, 1058-1061 (2004).</li><li>Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Studies+of+Native+Photosynthetic+Membranes.">Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes.</a> Biochem. 48, 3679-3698 (2009).</li><li>Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+visualization+and+characterization+of+Myxococcus+xanthus+cells+with+atomic+force+microscopy.">Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).</li><li>Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Protein-Protein+Interactions+in+Real-Time.">Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time.</a> Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).</li><li>Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Biological+Surface+Science,+Challenges+and+Recent+Advances.">Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances.</a> ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).</li><li>Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Mechanical+Properties+of+Living+Cells+Using+Atomic+Force+Microscopy.">Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (76), (2013).</li><li>Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Recombinant+DNA+and+Protein+Complexes+Using+Atomic+Force+Microscopy.">Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li><li>Poggi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe+Microscopy.">Scanning Probe Microscopy.</a> Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).</li><li>Rico, F., Su, C., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Mapping+of+Single+Membrane+Proteins+at+Submolecular+Resolution.">Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution.</a> Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).</li><li>Foster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Microscopy+for+2012.">The State of Microscopy for 2012.</a> Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).</li><li>Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+Forces+in+High-Resolution+Imaging+of+Soft+Matter+in+Liquid.">Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid.</a> ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).</li><li>Kaemmer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Bruker&#8217;s+ScanAsyst+and+PeakForce+Tapping+AFM+Technology.">Introduction to Bruker&#8217;s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology.</a> , (2011).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+imaging+of+biological+systems+by+force-distance+curve-based+AFM.">Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM.</a> Nature Methods. 10, 847-854 (2013).</li><li>Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+high-resolution+imaging+of+native+proteins+by+force-distance+curve&#8211;based+AFM.">Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve&#8211;based AFM.</a> Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).</li><li>Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Chemical+Groups+while+Imaging+Single+Native+Proteins+by+High-Resolution+Atomic+Force+Microscopy.">Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy.</a> Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).</li><li>Berquanda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+of+Living+Cells.">Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells.</a> Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).</li><li>Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyphosate-induced+Stiffening+of+HaCaT+Keratinocytes,+a+Peak+Force+Tapping+Study+on+Living+Cells.">Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells.</a> J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).</li><li>Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Mechanical+Heterogeneity+of+the+Erythrocyte+Membrane+Reveals+Hallmarks+of+Membrane+Stability.">Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability.</a> ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).</li><li>Tobias, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe+Microscopy+of+Bacterial+Red-Light.">Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light.</a> Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).</li><li>Sorenson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Structure+of+a+Unique+Bacterial+Red+Light+Photoreceptor+as+Revealed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy.</a> Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).</li><li>Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+phytochrome:+a+picture+is+worth+a+thousand+spectra.">The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra.</a> Plant Cell. 18, 4-14 (2006).</li><li>Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+classes+of+red/far-red+photochemistry+within+the+phytochrome+superfamily.">Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).</li><li>Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformational+changes+of+Agrobacterium+phytochrome+Agp1+during+chromophore+assembly+and+photoconversion.">Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion.</a> Biochem. 46, 4164-4176 (2007).</li><li>Noack, S., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+modulation+of+histidine-kinase+activity+in+bacterial+phytochromes+monitored+by+size+exclusion+chromatography,+crosslinking,+and+limited+proteolysis.">Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis.</a> Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).</li><li>Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+structure+and+signaling+mechanisms.">Phytochrome structure and signaling mechanisms.</a> Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).</li><li>Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophytochromes+Are+Photochromic+Histidine+Kinases+Using+a+Biliverdin+Chromophore.">Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore.</a> Nature. 414, 776-779 (2001).</li><li>Takala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+amplification+and+transduction+in+phytochrome+photosensors.">Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors.</a> Nature. 509, 245-248 (2014).</li><li>Filonov, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Near-Infared+Fluorescent+Protein+for+in+vivo+Imaging.">Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging.</a> Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).</li><li>Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Fluorescence+in+Bacteriophytochrome+Infrared+Fluorescent+Proteins.">On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins.</a> J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).</li><li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans.">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li><li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy.">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li><li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

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AFM ist ein Rastersondenmikroskopie Verfahren vollständig in der Lage Abbildung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in physiologisch relevanten Bedingungen. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie und NMR, eine Begrenzung der AFM ist ihre Unfähigkeit, die gleiche Auflösung, insbesondere die laterale Auflösung zu erzielen. Bei der Verwendung von AFM, ein Molekül auf einer Oberfläche zu analysieren, müssen die Auswirkungen der Oberfläche und der Sonde auf dem Bild des Moleküls auch bei der Dat...

Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein sehr wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der strukturellen und mechanischen Eigenschaften von Oberflächen, dünne Filme und Einzelmoleküle seit seiner Erfindung im Jahr 1986 (Abbildung 1). 1-3 Verwendung einer flüssigkeits Zelle hat das Verfahren werden in einem physiologisch relevanten Umwelt besonders nützlich in Studien von biologischen Makromolekülen und sogar lebende Zellen. 4-10 Tapping-Mode-AFM ist traditionell für die Abbildung von weichen Materialien oder locker gebundenen Moleküle an die Oberfläche, da der Kontakt-Modus AFM verwendet worden ist in der Regel nicht geeignet aufgrund auf die Schäden, die durch die seitlichen Kräfte verursacht auf die Probe ausgeübt durch den Freischwinger. Tapping-Modus 11 AFM wesentlich reduziert diese Kräfte, indem er die Spitze weise die Oberfläche berühren und nicht in ständigem Kontakt. In diesem Modus wird der Ausleger an oder nahe seiner Resonanzfrequenz normal zu der Oberfläche in Schwingungen versetzt. Ähnlich wie bei Kontaktmodus AFM ist Topographie analdurch Auftragen der Bewegung der Z-Piezo als eine Funktion der xy-(Abstand) yzed. Die Ausleger Dynamik bei oder nahe der Resonanz sehr instabil; daher sind sie sehr schwierig, außerhalb eines &quot;steady-state&quot; Situation zu automatisieren. Genauer gesagt, diese Dynamik hängen sowohl von der Probeneigenschaften und Scan-Umgebung. Für eine weiche Molekül auf eine Fest (er) Oberfläche adsorbiert, kann eine gut abgestimmte Rückkopplungsschleife für das Molekül zu Rückkopplungsschwingung für die Oberfläche führen. Betrieb in Fluid erschwert die Abstimmung des Auslegers. Änderungen der Temperatur oder Flüssigkeitsstände erfordern ständige Nachjustierung der Sollwert, Gewinne und andere Bildparameter. Diese Anpassungen sind in der Regel sehr zeitaufwendig und anspruchsvoll für die Nutzer. Spitzenkraft Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM), wie Tapping Mode AFM, vermeidet lateralen Wechselwirkungen von intermittierend Kontaktieren der Probe (Abbildung 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt;, arbeitet jedoch PF-QNM in nicht-resonanten Modus und Frequenzen viel niedriger als Tapping-Mode-AFM. Dadurch entfällt die Abstimmung Herausforderungen Tapping-Mode-AFM, insbesondere durch das Vorhandensein der Flüssigkeit verstärkt. Mit PF-QNM werden Bilder, indem sie eine Kraft-Antwort-Kurve an jedem Kontaktpunkt gesammelt. Mit dem Zusatz von ScanAsyst Software können 15 Einstellung der Scan-Parameter automatisiert werden und ein hochauflösendes Bild in einer Angelegenheit von Minuten mit dem auch unerfahrene Benutzer erhalten. Sobald der Benutzer mehr mit dem AFM wird, können einige oder alle der automatisierten Parameter zu jeder Zeit, die die Bildqualität der Experimentator manuell ermöglicht die Feineinstellung deaktiviert. Seit seiner Gründung PF-QNM wurde angewandt, um Bakteriorhodopsin, ein Membranprotein und andere native Proteine ​​auf der submolekularen Ebene abzubilden. 16-18 Für Bakteriorhodopsin, gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinflexibilität und Röntgenkristallstrukturen. PF 12 -QNM ist verwendet worden, lebende Zellen mit einer hohen Auflösung zu untersuchen. 19,20 Darüber hinaus hat PF-QNM Daten aufgeklärt wichtige Verbindungen zwischen Struktur und Mechanik in der Erythrozytenmembran, die für die Zellintegrität und Funktion sind. 21. Wir haben Rastersondenmikroskopie (SPM) Verfahren eingesetzt, darunter 22 AFM, 23, um die Struktur der Rotlicht-Photorezeptoren genannt Bakteriophytochrome (BphPs) zu studieren. 24,25 Sie bestehen aus einer Lichtsensormodul kovalent an eine Signal-Effektor-Modul verlinkten Histidin-Kinase (HK). 26 Die Lichterfassungsmodul enthält typischerweise einen Bilin-Chromophor, der bei der Absorption eines Photons strukturelle Umwandlung erfährt, mit einer Reihe von strukturellen Veränderungen Erreichen der Signal-Effektor-Modul und die zu einer globalen Transformation des gesamten Proteins . 24,27-29 Basierend auf dieser Transformation gibt es zwei unterschiedliche Lichtabsorptions sTates von BphPs, einem roten und dunkelrotem Licht absorbierenden Zustand, als Pr und Pfr bezeichnet. Pr ist thermisch stabil, dunkeladaptierten Zustand für die meisten BphPs. 28. Die molekularen Grundlagen der Pr / Pfr-Photo nicht vollständig aufgrund der begrenzten Strukturwissen dieser Proteine ​​zu verstehen. Mit Ausnahme einer Struktur von D. durans, sind 30 alle veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen dieser Proteine ​​in der dunkeladaptierten Zustand und Effektor-Domäne fehlt. Die intakten BphPs sind zu groß, um wirksam durch Kernspinresonanz (NMR) untersucht werden und sind notorisch schwierig in ihrer intakten Form kristallisieren (insbesondere in der Licht adaptierten Zustand) für Röntgen-Kristallographie. BphPs wurden vor kurzem als Infrarot-Fluoreszenzproteinmarker entwickelt worden (IFP). 31. Strukturelle Charakterisierung dieser Proteine ​​kann Hilfe in effektive IFP Design zu fördern. 32-36 Der Schwerpunkt dieses Artikels ist es, ein Verfahren für präsentierenAbbildung BphPs mit Flüssig-Zelle über AFM PF-QNM. Das Verfahren wird durch Untersuchungen der licht adaptierten Zustand des Bakteriophytochrom RpBphP3 (P3) aus dem Photosynthesebakterium R. nachgewiesen palustris. Das hier vorgestellte Verfahren AFM ist bequem und einfacher Ansatz zur Darstellung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Mit diesem Verfahren können strukturelle Einzelheiten der einzelnen Moleküle in einem kurzen Zeitraum, ähnlich einer oberen Ebene Wissenschaft natürlich Laborsitzung gesammelt werden. Über Messquerschnitte und Erfüllen weiteren eindimensionalen Analysen können experimentelle Daten, um nützliche Rechenmodelle verglichen werden. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Tapping Mode Fluid Cell</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grade</td><td>SPI supplies</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Sample support disk</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>micropipettors</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Prepared according to cited references</td></tr><tr><td>Nanoscope software</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disc Gripper</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet eine Pyramidenspitze auf einem Ausleger angebracht ist, um die Kraftantwort der Oberfläche zu untersuchen. Die Auslenkungen der Spitze kann durch einen Laser und Detektor in Sektoren, die Topographiebild umgerechnet werden können gemessen werden, um ~ 10 pN. Amplitudenmodulation oder &quot;Tapping Mode&quot; AFM umfasst die Sonde so intermittierenden Kontakt mit der Oberfläche beim Oszillieren bei seiner Resonanzfrequenz, um ein Bild zu erzeugen. In Verbindung mit einer Fluidzelle verwendet, Tapping-Mode-AFM ermöglicht die Abbildung von biologischen Makromolekülen, wie Proteinen in physiologisch relevanten Bedingungen. Tapping-Mode AFM erfordert manuelle Abstimmung der Sonde und häufige Anpassungen aus einer Vielzahl von Scan-Parameter, die schwierig sein kann für unerfahrene Anwender. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, sind diese Anpassungen die meiste Zeit. Peakforce Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM) erzeugt ein Bild durch die Messung einer Kraft Verantse Kurve für jeden Berührungspunkt mit der Probe. Mit ScanAsyst Software können PF-QNM automatisiert werden. Diese Software passt den Sollwert, Antriebsfrequenz, Abtastrate, Gewinne und andere wichtige Scan-Parameter automatisch für eine bestimmte Probe. Nicht nur, dass dieses Verfahren zum Schutz sowohl zerbrechlich Sonden und Proben, es reduziert die erforderliche Zeit, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. PF-QNM ist für AFM in Flüssigkeit kompatibel; Daher war es umfangreiche Anwendung zur Abbildung biologisch relevanten Materialien. Die in diesem Papier vorgestellte Methode beschreibt die Anwendung von PF-QNM, um Bilder von einer bakteriellen Rotlicht-Photorezeptor, RpBphP3 (P3) zu erhalten, aus photo R. palustris in seinem Licht-adaptierten Zustand. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden einzelne Protein Dimere von P3 und Aggregate von Dimeren auf einer Glimmer-Oberfläche in Gegenwart eines bildgebenden Puffer beobachtet. Mit entsprechenden Anpassungen an die Oberfläche und / oder der Konzentration der Lösung, wobei dieses Verfahrenkann allgemein auch für andere biologisch relevante Makromoleküle und weichen Materialien angewendet werden.

Vertreter AFM-Bilder von einem Photorezeptor-Protein, P3, in seinem Licht-adaptierten Zustand sind in den 3 und 4 dargestellt. Ein frisch geschnittenen Glimmer-Substrat (3A) ist eine geeignete, ebene Fläche für Protein-Adsorption. Sammeln eines Bildes saubere Glimmer als Negativkontrolle ist aus mehreren Gründen wichtig. Zunächst versichert es der Flüssigkeitszelle ist sauber und keine Reststoffe aus früheren Experimenten wird die Oberfläche verunreinigen. Zweite...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

11.7K Aufrufe.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

Serie: Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Forschung

Biochemie

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Biotechnik

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Entwicklungsbiologie

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Immunologie und Infektion

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...