Il programma NSF-MRI (CHE: 1.229.103) è riconosciuto per finanziare l&#39;acquisto di nuovi elettronica di controllo, software, cellule, liquidi e altre attrezzature necessarie per assemblare un doppio AFM / STM. Riconosciamo i servizi in comune presso l&#39;Università di Chicago programma NSF-MRSEC (DMR-0.820.054) per l&#39;assistenza con AFM strumentazione, formazione, e di imaging, e per il tempo dello strumento messo a disposizione da parte del Materials Research Facilities Network (DMR-0.820.054). Siamo particolarmente Ringraziamo il Dr. Qiti Guo, il dottor Justin Jureller, e il Prof. Ka Yee Lee per accogliere i nostri studenti prima il finanziamento della proposta di NSF-risonanza magnetica che ha portato la strumentazione necessaria per il nostro campus. Riconosciamo il finanziamento di una borsa del titolo III dello stelo (ID: P031C110157) assegnato a Northeastern Illinois University che ha fornito borse di ricerca estivi per studenti e docenti, nonché il supporto per materiali di consumo. Infine, riconosciamo Bruker-Nano, Inc. per il continuo supporto strumentale e per il permesso di reproduce un grafico che mostra il meccanismo di PeakForce QNM e ad usare la parola ScanAsyst per descrivere il software automatizzato.

1. Computer e Microscopio Set Up <ol><li> Aprire la valvola della bombola N 2 e regolare le manopole per assicurare la tabella aria è mobile e livello. </li><li> Accendere il computer, controller e luce a fibre ottiche in questo ordine. </li><li> Impostare lo scanner alla modalità / LFM AFM e centrare la telecamera sopra la testa AFM. </li><li> Software Open. Seleziona una categoria esperimento &quot;Proprietà nanomeccaniche&quot;, &quot;Quantitative nanomeccanico Mapping&quot; nel gruppo esperimento, e &quot;PeakForce QNM in Fluid&quot; sotto esperimento. Fare clic su Carica Esperimento e quindi il programma di installazione. </li><li> Mettere a fuoco la fotocamera con l&#39;obiettivo Z per vedere la superficie del palco. Utilizzando il grossolano su / giù piezo spostare il palco ca. 1 mm sotto la superficie dell&#39;apertura testa AFM. </li></ol> 2 Preparazione di Mica Surface <ol><li> Premere un autoadesivo adesivo sulla faccia di un disco pulito di supporto del campione (diametro 15 mm, spessore 0,8 mm). Spingere una mica V-4disco di grado (25 x 25 x 26 mm) sull&#39;adesivo fino saldamente collegato. </li><li> Strofinare un pezzo di nastro adesivo trasparente sul mica assicurandosi che sia pienamente rispettato con bolle d&#39;aria. Estrarre il nastro largo della mica da un lato per fendere uniformemente esso. Ripetere se necessario per assicurare la mica è piatta. </li><li> Afferrare il disco di supporto, lato mica pulizia, con un paio di pinzette circolari (pinze disco), e posizionare sullo scanner. La mica deve essere inferiore al livello dell&#39;apertura di testa AFM. </li></ol> 3. fluido Assemblea cellulare e imaging di Mica Surface <ol><li> Risciacquare la cella del fluido, O-ring, adattatore per siringa, l&#39;adattatore del tubo, e il tubo di espulsione in 100% etanolo. Risciacquare la cella del fluido in acqua deionizzata. Che tutti parti di aria completamente asciutto. </li><li> Spingere l&#39;adattatore del tubo nella porta sulla cella fluido pulito. Premere delicatamente l&#39;O-ring nella rientranza centro della cella liquido utilizzando una pinzetta piatta diretti. </li><li> Premere la molla leggermente sulla clip sonda fermo e girare lontano dalla Groove per la punta. </li><li> Afferrare la sonda sul lungo termine lontano dalla punta piatta con una pinzetta a capo. Inserire la sonda nella scanalatura con la punta rivolta verso il centro della cellula. Spingere la molla in e regolare il fermo sopra la sonda per fissarlo (Figura 1B). </li><li> Controllare il morsetto sul AFM per assicurarsi che sia completamente retratto (Figura 1C). </li><li> Inserire la cella fluido, O-ring e sonda verso il basso, sulla parte superiore del campione mica. Lasciare che la cellula liquido di riposare sui perni della AFM. Abbassare il morsetto per stabilizzare la cella fluido sulla scena. Premere l&#39;interruttore verso il basso sul microscopio fino un&#39;ispezione visiva mostra l&#39;O-ring saldamente compressa tra il disco di supporto e la cella fluido. </li><li> Mentre si guarda il monitor, concentrare la manopola di regolazione grossolana per visualizzare la parte superiore della cella fluido sullo schermo. </li><li> Spostare il microscopio fino a quando vi è una chiara immagine della punta utilizzando le manopole di regolazione X / Y e Z l&#39;obiettivo. La punta si apporecchio come un metallico, triangolo d&#39;oro. Spostare la punta più vicino alla superficie del campione usando la leva piezo giù sul microscopio. Focus sulla riflessione della punta. Tenere traccia del cantilever effettiva in relazione alla sua riflessione. In questa fase, devono essere strettamente allineati, ma non completamente sovrapposte. </li><li> Collegare l&#39;adattatore ad una siringa sterile siringa da 1 ml. Attaccare un&#39;estremità del tubo di espulsione all&#39;adattatore siringa e posizionare l&#39;altra estremità del tubo nel contenitore di soluzione tampone. Estendere completamente lo stantuffo della siringa. </li><li> Collegare il tubo flessibile per l&#39;adattatore del tubo sulla cella fluido. Premere delicatamente il pistone finché il liquido riempie completamente la camera centrale. Controllare la cella per assicurare non vi siano bolle d&#39;aria. Verificare che non vi è alcun liquido fuoriuscita dalla cellula liquido sul microscopio. Posizionare la siringa su un supporto solido sollevato. </li><li> Utilizzare il feed fotocamera e X / Y manopole di traduzione per individuare il laser sullo schermo (un punto rosso diffusa). Utilizzando il movem lasermanopole di controllo ORL, spostare il laser sulla punta. </li><li> Finemente regolare i controlli laser e specchi fino a quando il segnale somma visualizzata sul microscopio è massimizzato (valore = 4 - 6). </li><li> Regolare l&#39;angolo del diodo quadranti utilizzando le manopole sul lato posteriore sinistro e il lato superiore sinistro della testa di scansione per ridurre le deformazioni verticali e orizzontali visualizzate sul microscopio il più vicino possibile allo zero (± 0,1). </li><li> Nel software, selezionare le opzioni di acquisizione. Come minimo, selezionare l&#39;altezza (trace e ritracciamento), errore di picco di forza e deformazione. Le altre opzioni sono a carico dell&#39;utente e possono essere personalizzati in base alle informazioni specifiche voluta dal sperimentalista. </li><li> Selezionare &quot;linea&quot; per RT Aereo Fit in ogni finestra di acquisizione. Selezionare &quot;none&quot; per l&#39;OT Piano Fit nelle finestre di altezza. Impostare il X e Y offset e angolo di scansione a zero, se non già fatto. </li><li> Impostare la velocità di scansione di 1 Hz, il campione per linea a 256, il controllo automatico ScanAsysta individuo, e la ScanAsyst auto Z limite off. Modificare il limite Z a 500 nm. Impostare formato di scansione a 1 micron. </li><li> Fare clic impegnarsi. A questo punto, la punta si avvicina alla superficie. Mentre la punta si avvicina, osservare Z variazione di tensione piezo nell&#39;angolo in basso a sinistra dello schermo. Se la punta va al di fuori della gamma, ritirare la punta e ri-approccio. Se questo non riesce, la punta può avere bisogno di essere modificato in modo da avere un approccio di successo. Una volta che la punta è impegnato, le linee inizieranno a comparire su ciascuna delle finestre di acquisizione che comporranno un&#39;immagine. </li><li> Prendete le immagini di mica a 1 x 1 micron e zoom lentamente per assicurare che la superficie mica è pulita e piatta. Clicca cattura continua per salvare le immagini come appaiono. Zoom in e muoversi intorno alla superficie, se lo desideri. </li></ol> 4. proteine ​​Deposizione e Preparazione del campione per Imaging <ol><li> Ottenere proteico purificato del campione 38 e tenere su ghiaccio. Se conservato in un congelatore, scongelare campioneghiaccio per 5 min. </li><li> Diluire la proteina a 0,0010 mg / ml di soluzione tampone di imaging utilizzando refrigerato. Il buffer di imaging usata qui è 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl, e MgCl 15 mM 2. </li><li> Riempire un 4 camera (100 x 15 mm) piastra di Petri con una soluzione tampone di imaging refrigerato. Riempire ciascuna camera con almeno 5 ml di soluzione. Mescolare delicatamente la soluzione proteica diluita con la punta attaccata alla micropipetta. </li><li> Applicare 200 microlitri della soluzione proteica diluita alla superficie della mica già preparato. Dopo 30 sec, prendere la superficie proteica / mica con le pinzette circolari (pinze disco). Tenere il campione parallelo al banco di laboratorio. </li><li> Tenendo il campione, immergere immediatamente il campione nella soluzione tampone contenuta nel primo quadrante della piastra Petri (fase 4.2) accertando che il campione sia parallelo al bacino della scatola di Petri. Dopo 1 sec, rimuovere il campione. </li><li> Continuando a premere il campione parallelo al bacinodella piastra Petri, ripetere il passaggio 4.5 per i restanti tre quadranti. </li><li> Posizionare il disco su un panno polvere asciutto per assorbire l&#39;umidità in eccesso e trasferire il disco sul palco del microscopio. Non toccare la superficie effettiva con il panno. Non lasciare che il campione si asciughi. </li><li> Ripetere i passaggi 3,6-3,16. </li></ol> 5. Imaging Proteine ​​in Mica <ol><li> Clicca sulla casella dei parametri di controllo sul lato sinistro dello schermo. Dimensioni Primavera e raggio della punta devono essere impostati basa sul utilizza la punta. </li><li> Fare clic impegnarsi. Analogamente al processo di imaging mica (passo 3.17), osservare la finestra di z-piezo con l&#39;avvicinarsi punta. </li><li> Lasciare lo scanner per l&#39;immagine stessa zona per almeno due passaggi consecutivi. Clicca cattura continua per salvare ogni immagine raccolta. </li><li> Spostare lo scanner ad una nuova regione e / o modificare le dimensioni dell&#39;immagine, se lo desideri. </li><li> Dopo che il software automatizzato ha terminato di regolare l&#39;parametri di scansione per una particolare dimensione dell&#39;immagine, girare il software off. </li><li> Regolare manualmente velocità di scansione, limite z, il numero di linee, e la tensione al fine di ottimizzare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Se l&#39;immagine diventa troppo fuori fuoco, girare il software di nuovo su per tornare alla posizione di partenza. Per aumentare la risoluzione di un&#39;immagine durante lo zoom su una proteina, diminuire la frequenza di scansione e aumentare il numero di linee proporzionalmente. </li><li> Dopo l&#39;esperimento, pulire la cella liquido con il 100% di etanolo e risciacquare con DI H 2 O. Lasciare la cella liquido per asciugare completamente. </li><li> Aprire il software di dati per elaborare le immagini di dati grezzi. In primo luogo, appiattire l&#39;immagine cliccando sull&#39;icona Spiana. Selezionare Zero ° ordine e fare clic su Esegui. A seconda dell&#39;immagine, vestibilità aereo può essere necessaria per ottenere un&#39;immagine in modo appropriato piatta. In questo caso, selezionare l&#39;icona del piano in forma e disegnare un piano di una zona pianeggiante dell&#39;immagine con il cursore. Fare clic su Esegui. Ripetere se necessario </li><li> Select scheda sezione per misurare le dimensioni della proteina. Disegnare una linea con il cursore sposta sopra la molecola o la zona da analizzare. Ripetere per più aree e il software genererà un overlay. Esportare l&#39;immagine o dati utilizzati per generare un&#39;immagine in un formato compatibile con altri programmi software e di disegno. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

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AFM è una scansione di sonda metodo di microscopia pienamente in grado di immaginare proteine ​​e altre macromolecole biologiche in condizioni fisiologicamente rilevanti. In confronto a cristallografia a raggi X e NMR, una limitazione di AFM è la sua incapacità di raggiungere la stessa risoluzione, risoluzione particolarmente laterale. Quando si utilizza AFM per analizzare una molecola su qualsiasi superficie, l&#39;impatto della superficie e la sonda sull&#39;immagine della molecola devono essere considerati anc...

Microscopia a forza atomica (AFM) è diventato uno strumento molto importante per indagare le proprietà strutturali e meccaniche delle superfici, film sottili, e le singole molecole dalla sua invenzione nel 1986 (Figura 1). 1-3 Utilizzo di una cella liquido, il metodo ha diventa particolarmente utile negli studi di macromolecole biologiche e cellule anche che vivono in un ambiente fisiologicamente rilevanti. 4-10 Toccando modalità AFM è stato tradizionalmente usato per l&#39;imaging materiali morbidi o molecole debolmente legate alla superficie, poiché il contatto-mode AFM è in genere inadatto dovuto per i danni causati dalle forze laterali esercitate sul campione dal cantilever. 11 Tapping modalità AFM riduce sostanzialmente queste forze avendo la punta intermittenza toccare la superficie piuttosto che essere in costante contatto. In questa modalità, il cantilever è oscillato in corrispondenza o in prossimità della sua frequenza di risonanza normale alla superficie. Allo stesso modo di contattare modalità AFM, topografia è analeyzed tracciando il movimento dello z-piezo come funzione di xy (distanza). La dinamica a sbalzo possono essere molto instabili o in prossimità di risonanza; Pertanto, essi sono molto impegnativo per automatizzare al di fuori di una situazione di &quot;steady-state&quot;. In particolare, queste dinamiche dipendono sia dalle proprietà del campione e ambiente di scansione. Per una molecola adsorbita morbida per un (er) superficie dura, un ciclo di feedback ben sintonizzato per la molecola può portare a risposte di oscillazione per la superficie. Operazione nel liquido complica ulteriormente la messa a punto del cantilever. Le variazioni di livelli di temperatura o fluidi richiedono costante adeguamento del set point, guadagni, e altri parametri di imaging. Queste regolazioni tendono ad essere molto in termini di tempo e stimolante per gli utenti. Peak Forza quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM), come tapping mode AFM, evita interazioni laterali dal intermittenza contattando il campione (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Tuttavia, PF-QNM funziona in modalità non-risonante e frequenze molto più basse rispetto toccando modalità AFM. Questo elimina i problemi di sintonia di maschiatura modalità AFM, in particolare quelli aggravato dalla presenza di fluido. Con PF-QNM, le immagini sono raccolte prendendo una curva di risposta forza in ogni punto di contatto. Con l&#39;aggiunta di software ScanAsyst, 15 regolazione dei parametri di scansione può essere automatizzato e un&#39;immagine ad alta risoluzione ottenuta in pochi minuti anche gli utenti inesperti. Una volta che l&#39;utente diventa più familiarità con l&#39;AFM, uno o tutti i parametri automatizzati potrebbero essere disattivate in qualsiasi momento, che permette di sperimentalista per ottimizzare la qualità dell&#39;immagine manualmente. Fin dalla sua istituzione, PF-QNM è stato applicato per mappare batteriorodopsina, una proteina di membrana, e di altre proteine ​​native a livello submolecolare. 16-18 Per batteriorodopsina, c&#39;è una correlazione diretta tra flessibilità proteine ​​e raggi X delle strutture cristallografiche. PF 12 -qnM è stato utilizzato per studiare le cellule viventi con alta risoluzione. 19,20 connessioni importanti, inoltre, i dati PF-QNM ha chiariti tra struttura e la meccanica all&#39;interno della membrana eritrocitaria che sono critici per l&#39;integrità e la funzione delle cellule. 21 Abbiamo impiegato microscopia a scansione di sonda (SPM) metodi, tra cui 22 AFM, 23 per studiare la struttura dei fotorecettori a luci rosse chiamato bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Sono costituiti da un modulo di rilevamento della luce covalentemente legato ad un modulo di segnalazione-effector tale come istidina chinasi (HK). 26 Il modulo luce di rilevamento contiene tipicamente un cromoforo bilin che subisce una trasformazione strutturale su assorbimento di un fotone, con una serie di modifiche strutturali che raggiungono il modulo di segnalazione-effettore e portano ad una trasformazione globale della proteina intera . 24,27-29 Sulla base di questa trasformazione, ci sono due distinti assorbente la luce stati di BphPs, una luce che assorbe stato rosso e rosso lontano, indicati come Pr e Pfr. Pr è termicamente stabile, stato adattato al buio per la maggior parte BphPs. 28 Le basi molecolari della Pr / Pfr fotoconversione non è del tutto compreso a causa della limitata conoscenza strutturale di queste proteine. Con l&#39;eccezione di una struttura da D. radiodurans, 30 tutti pubblicati a raggi X delle strutture cristallografiche di queste proteine ​​sono in stato adattato all&#39;oscurità e mancano dominio effettore. I BphPs intatti sono troppo grandi per essere efficacemente studiato da Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e sono notoriamente difficili da cristallizzare nella loro forma intatta (in particolare nello stato di luce-adattato) per la cristallografia a raggi X. BphPs Recentemente sono stati progettati come marcatori proteici fluorescenti infrarossi (di IFP). 31 Caratterizzazione strutturale di queste proteine ​​può ulteriori aiuti in efficace progettazione IFP. 32-36 Il focus di questo articolo è quello di presentare una procedura perimaging BphPs utilizzando AFM liquido-cell tramite PF-QNM. Il metodo è dimostrato da studi dello stato luce-adattata del RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) dal batterio fotosintetico R. palustris. La procedura di AFM qui presentata è l&#39;approccio pratico e diretto per l&#39;imaging di proteine ​​e altre macromolecole biologiche. Con questo metodo, i dettagli strutturali di singole molecole possono essere raccolti in un breve periodo di tempo, simile ad un corso di scienze sessione di laboratorio di livello superiore. Attraverso la misurazione sezioni e completando ulteriori analisi dimensionali, i dati sperimentali possono essere paragonati a modelli computazionali utili. 37-42

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Microscopia a forza atomica (AFM) utilizza una punta piramidale collegata ad un cantilever per sondare la risposta forza di una superficie. Le deviazioni di punta possono essere misurati a ~ 10 pN da un laser e rivelatore sectored, che può essere convertito in immagine topografia. Modulazione di ampiezza o AFM &quot;tapping mode&quot; comporta la sonda il contatto intermittente con superficie mentre oscilla alla sua frequenza di risonanza per produrre un&#39;immagine. Utilizzato in combinazione con una cella di fluido, toccando modalità AFM permette l&#39;imaging di macromolecole biologiche come le proteine ​​in condizioni fisiologicamente rilevanti. Toccando modalità AFM richiede la sintonizzazione manuale della sonda e frequenti aggiustamenti di una moltitudine di parametri di scansione, che può essere difficile per gli utenti inesperti. Per ottenere immagini di alta qualità, queste regolazioni sono il momento più consumo. PeakForce quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM) produce un&#39;immagine misurando un respon forzacurva se per ogni punto di contatto con il campione. Con il software ScanAsyst, PF-QNM può essere automatizzato. Questo software consente di regolare il set-point, frequenza di azionamento, velocità di scansione, i guadagni, e altri importanti parametri di scansione automatica per un dato campione. Non solo questo processo proteggere entrambe le sonde fragili e campioni, riduce significativamente il tempo richiesto per ottenere immagini ad alta risoluzione. PF-QNM è compatibile per l&#39;imaging AFM in liquido; Pertanto, esso ha una vasta applicazione per l&#39;imaging di materiali biologicamente rilevanti. Il metodo presentato in questo articolo descrive l&#39;applicazione del PF-QNM per ottenere immagini di un fotorecettore batterica a luci rosse, RpBphP3 (P3), da fotosintetico R. palustris nel suo stato-luminosa adatta. Usando questo metodo, i singoli dimeri proteici di P3 e aggregati di dimeri sono stati osservati su una superficie mica in presenza di un buffer di imaging. Con opportuni adeguamenti per superficie e / o concentrazione della soluzione, questo metodopuò essere generalmente applicato ad altre macromolecole biologicamente rilevanti e materiali morbidi.

Immagini AFM rappresentativi di una proteina fotorecettore, P3, nel suo stato adattato-luce sono presentati nelle figure 3 e 4. Un substrato di mica appena spaccati (Figura 3A) è una superficie piatta adatta per delle proteine. Raccolta un&#39;immagine di mica pulito come controllo negativo è importante per diverse ragioni. In primo luogo, essa assicura la cella liquido è pulito e senza materiali residui da precedenti esperimenti sarà contaminare la superficie. In s...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

11.6K Views.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

Preparazione e attrito Forza Microscopia Misure di Immiscibile, Opposing Pennelli Polymer

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Ricerca

Ingegneria

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

Dinamico Pore scala Reservoir-condizione Imaging di Reazione a Carbonati Utilizzando sincrotrone tomografia veloce

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

Un metodo efficiente per la desalinizzazione selettivo di anioni di iodio radioattivo mediante filtro a membrana incorporato di nanoparticelle d'oro

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

Mappatura superficiale di esopianeti simili alla Terra utilizzando curve di luce a punto singolo

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...

Optimizing Magnetic Force Microscopy Resolution and Sensitivity to Visualize Nanoscale Magnetic Domains

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force microscopy (AFM) probe whose tip has been magnetized vertically (i.e., perpendicular to the probe cantilever) is oscillated at a fixed height above the sample surface. The resultant shifts in the oscillation phase or frequency, which are proportional to the magnitude and sign of the vertical magnetic force gradient at each pixel location, are then tracked and mapped. Although the spatial resolution and sensitivity of the technique increases with decreasing lift height above the surface, this seemingly straightforward path to improved MFM images is complicated by considerations such as minimizing topographical artifacts due to shorter range van der Waals forces, increasing the oscillation amplitude to further improve sensitivity, and the presence of surface contaminants (in particular water due to humidity under ambient conditions). In addition, due to the orientation of the probe's magnetic dipole moment, MFM is intrinsically more sensitive to samples with an out-of-plane magnetization vector. Here, high-resolution topographical and magnetic phase images of single and bicomponent nanomagnet artificial spin-ice (ASI) arrays obtained in an inert (argon) atmosphere glovebox with &lt;0.1 ppm O2 and H2O are reported. Optimization of lift height and drive amplitude for high resolution and sensitivity while simultaneously avoiding the introduction of topographical artifacts is discussed, and detection of the stray magnetic fields emanating from either end of the nanoscale bar magnets (~250 nm long and &lt;100 nm wide) aligned in the plane of the ASI sample surface is shown. Likewise, using the example of a Ni-Mn-Ga magnetic shape memory alloy (MSMA), MFM is demonstrated in an inert atmosphere with magnetic phase sensitivity capable of resolving a series of adjacent magnetic domains each ~200 nm wide.

Magnetic force microscopy (MFM) employs a vertically magnetized atomic force microscopy probe to measure sample topography and local magnetic field strength with nanoscale resolution. Optimizing MFM spatial resolution and sensitivity requires balancing decreasing lift height against increasing drive (oscillation) amplitude, and benefits from operating in an inert atmosphere glovebox.

Ottimizzazione della risoluzione e della sensibilità al microscopio a forza magnetica per visualizzare domini magnetici su scala nanometrica

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Array a sbalzo attivi in parallelo in AFMS per consentire ispezioni ad alta produttività

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autore in primo piano: Introduzione alla microscopia a forza atomica con sonda attiva con array a sbalzo a quattro paralleli

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Microscopia a forza atomica con sonda attiva con array a sbalzo Quattro-Parallel per l'ispezione di campioni su larga scala ad alta produttività

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...