Candida albicans Biofilme wie viele biologische Proben sind in ihrem Heimatstaat stark durchscheinend bis undurchsichtig. In diesen Protokollen zeigen wir, dass mit Klärungsmethoden die innere Struktur fester intakter Biofilme durch optische Schnittmikroskopie abgebildet werden kann. Mit einfachen, kostengünstigen und relativ schnellen Verarbeitungsschritten können feste intakte Biofilme durch konfokale Scanning-Fluoreszenzmikroskopie für die 3D-Bildgebung transparent gemacht werden.
Dieses Verfahren wird heute Katie Lagree, eine Postdoktorandin hier, und ich demonstrieren. Um mit dem Biofilmwachstum in einer 12-Well-Platte zu beginnen, bereiten Sie die Platte wie im Textprotokoll beschrieben vor. Legen Sie die Platte 90 Minuten lang auf einen 60 Umdrehungs-Orbitalmischer in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Luftinkubator, um Zeit für die Zellhaftung zu lassen.
Nach 90 Minuten die mittleren und nicht angeschlossenen Zellen entfernen und mit sterilem Medium oder PBS waschen. Übertragen Sie die geimpften Substrate in eine andere Multi-Well-Platte, die ein vorgewärmtes Filamentierungsmedium enthält. Bringen Sie die Platte auf den 37 Grad Celsius befeuchteten Umgebungsluft-Inkubator zurück und wachsen Sie die Biofilme bis zu 48 Stunden mit 60 Umdrehungen zur Belüftung.
Holen Sie sich die 48-Stunden-Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie das Kulturmedium von jedem Exemplar. Ersetzen Sie das Medium durch PBS und inkubieren Sie für einige Minuten Serumproteine. Nach dem Entfernen der PBS, füllen Sie die Brunnen mit fixativ.
Jedem Gericht sollte ein ausreichendes Fixierungsvolumen hinzugefügt werden, um das gesamte Biofilmwachstum einschließlich eines beliebigen Aufderbeinens der Schale einzutauchen. Stellen Sie die bedeckte Schale für 20 Minuten auf einen langsamen Orbitalmixer. Nach dem Entfernen des Fixativs, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Färbung vor, indem Sie die PBS abtropfen lassen und die Brunnen schnell mit einer Lösung füllen, die PBS und den erforderlichen Fleck enthält.
Lassen Sie den Biofilm nicht mehr als ein paar Sekunden abtropfen oder trocknen. Fügen Sie den Fleck auf die Schale. Die benötigte Menge an Flecken hängt von der Biofilmmasse ab.
Dann stellen Sie die bedeckte Schale über Nacht auf einen langsamen Orbitalmixer und schützen Sie vor Licht mit Folie oder einem Stück schwarzem Papier. Mit einer Pinzette den fixierten gebeizten Biofilm von PBS auf fünf Milliliter 50/50 PBS-Methanol in einer 20-Milliliter-Glasdurchstechflasche mit nach oben zeigendem Biofilm übertragen. Manuell mit Orbitalbewegung in einem Minutentakt für fünf Minuten mischen.
Entfernen Sie das Lösungsmittel in eine Abfallflasche, da Sie vorsichtig sind, um den Kontakt zwischen Pipette und Biofilm oder dem Biofilm und der Durchstechflasche zu vermeiden. Mit drei Millilitern ordentlichem Methanol vorsichtig nachfüllen. Manuell mit Orbitalbewegung in einem Minutentakt für drei Minuten mischen.
Nun das Lösungsmittel in eine Abfallflasche entfernen und sofort mit fünf Milliliterm Ethanol nachfüllen. Nach dem manuellen Mischen mit Orbitalbewegung in einem Minutentakt für fünf bis zehn Minuten, entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche. Sofort mit drei Milliliterm Ethanol nachfüllen.
Biofilme sehen an dieser Stelle oft undurchsichtiger aus als ihr ursprüngliches Aussehen. Entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche und füllen Sie die Durchstechflasche sofort mit fünf Millilitern 50/50 Methanol-Methylsalicylat auf. Manuell mit Orbitalbewegung in einem Minutentakt für fünf bis zehn Minuten mischen.
Der Biofilm sollte in diesem mischflüssigen Lösungsmittel halbtransparent sein. Nachdem Sie das Lösungsmittel in eine Abfallflasche entfernt haben, füllen Sie die Durchstechflasche vorsichtig mit drei Millilitern ordentlichem Methylsalicylat nach. Manuell mit Orbitalbewegung in einem Minutentakt für drei Minuten mischen.
Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal mit fünf Millilitern ordentlichem Methylsalicylat, das in einem Minutentakt fünf bis zehn Minuten lang manuell gemischt wird. An dieser Stelle sollte der Biofilm transparent sein. Entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche und füllen Sie die Durchstechflasche sofort mit drei Millilitern ordentlichem Methylsalicylat auf.
Der verarbeitete Biofilm ist in diesem Lösungsmittel stabil. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, verwenden Sie eine lösungsmittelbeständige Schale, die einen Deckglasboden hat, und bereiten Sie Abstandshalter zur Unterstützung der invertierten Probe vor. Hier sind Abstandshalter 13-Millimeter-Silikonringe, die eine Stunde lang in Methylsalicylat vorgetränkt sind, um die Fokusdrift durch Schwellungen zu minimieren.
Für einen Biofilm auf einem medizinischen Silikonquadrat, invertieren Sie das Quadrat und setzen Sie es auf einen Abstandsraum in einem Pool von Methylsalicylat in der Schale. Achten Sie darauf, Blasen unter der Probe zu vermeiden. Montieren Sie die Schale fest auf der Bühne des Mikroskops und machen Sie Öl in Kontakt mit dem Objektiv.
Stellen Sie die Menge an Methylsalicylat in der Schale so ein, dass der Meniskus die Probe durch Oberflächenspannung fest auf dem Abstandsraum hält. Legen Sie ein Tröpfchen Methylsalicylat auf das invertierte quadratische Substrat, um die Lichtstreuung von der matten Oberfläche zu reduzieren. Dann bedecken Sie die Schale mit einer Glasplatte, um die Verdunstung zu begrenzen.
Warten Sie einige Minuten, bis sich die Probe vor der Bildgebung auf die Abstandshalter einlässt. Führen Sie nun eine konfokale Mikroskopie durch, um die Probe wie im Textprotokoll beschrieben abzubilden. Um die Bilder zu verarbeiten, öffnen Sie ImageJ oder Fidschi.
Stellen Sie sicher, dass dem Programm genügend Arbeitsspeicher für die verarbeitung daten zugewiesen ist. Die Verarbeitung eines 2-Gigabyte-Datasets erfordert mindestens acht Gigabyte dedizierten RAM für einen reibungslosen Betrieb. Öffnen Sie die zu verarbeitende Bilddatei auf serieller Ebene.
Wenn der Computer nicht über genügend RAM verfügt, um den gesamten Stapel zu verarbeiten, können Substacks verarbeitet und dann zu einem einzigen Stapel wieder zusammengesetzt werden. Konvertieren Sie die Daten in das 32-Bit-Format, um Gleitkommaarithmetikoperationen mithilfe des Bildmenüs, des Typs 32-Bit zu aktivieren. Dadurch wird die Dateigröße verdoppelt.
Subtrahieren Sie den glatten Hintergrund, um den Kontrast von Fokus-Features zu erhöhen. Verarbeiten Sie den gesamten Stapel, indem Sie zum Prozessmenü navigieren und den Hintergrund subtrahieren. Passen Sie ggf. den Rollenkugelradius an.
Der Kugelradius sollte deutlich größer sein als die größte Dimension der zu erhaltenden Fokus-Features. Um alle negativen Pixel auf Null festzulegen, fügen Sie jedes Bild seinem absoluten Wert hinzu. Zuerst duplizieren Sie den Stapel mit Image-Menü, duplizieren, duplizieren Stapel.
Nehmen Sie dann den absoluten Wert der duplizierten Daten mit Prozessmenü, Mathematik, absoluter Wert. Fügen Sie die beiden Stapel hinzu, indem Sie zum Prozessmenü, Bildrechner, Hinzufügen navigieren. Um den Bildstapel axial neu zu schneiden, verwenden Sie das Bildmenü, Stapel, Reslice.
Wählen Sie dann den Ausgangsabstand 1.0 aus, beginnen Sie oben und vermeiden Sie die Interpolation. Die Fokusachse ist nun die vertikale Achse im Stapel. Die Y-Dimension des neu geschnittenen Stapels entspricht der Anzahl der Fokusebenen.
Um eine Seitenansichtsprojektion eines Teils oder des gesamten Stapels zu erstellen, navigieren Sie zum Bildmenü, zu Stapeln, Z-Projekt. Legen Sie Startslice und Stop Slice fest, um einige oder alle Seitenansichtsebenen einzuschließen. Wählen Sie die maximale Intensität für die besten Ergebnisse.
Korrigieren Sie die axiale Skalierung der Seitenansichtsprojektion, indem Sie zum Bildmenü, Skalierung navigieren. Die Projektion muss für die ungleiche Bildebenenpixelung und das Fokusinkrement mit dem axialen Skalierungsfaktor korrigiert werden. Legen Sie die X-Skala auf eins und die Y-Skala auf den axialen Skalierungsfaktor fest.
Wählen Sie bikubische Interpolation aus. Wählen Sie neues Fenster erstellen aus. Passen Sie Helligkeit und Kontrast an.
Konvertieren Sie dann in das Acht-Bit-Format für die Anzeige. Alternativ können Sie eine Farbsuchtabelle anwenden und als RGB- oder Acht-Bit-Farbe speichern. Mit serienmäßig mischbaren Lösungsmitteln mit steigendem Brechungsindex lässt sich das Maximum an Klarheit schnell abschätzen.
Dies wird durch die herkömmliche Phasenkontrastmikroskopie verfeinert, um den Punkt des minimalen Kontrasts zu finden. Ein Biofilm wurde seriell zwischen Xylol und einem schmalen Satz von Referenzflüssigkeiten in diesem Bereich ausgetauscht. Nach jedem Austausch wurde dasselbe Feld verlegt und durch ein Deckglas betrachtet.
Mit steigendem Index wird die Kontrastumkehr zuerst gesehen, wenn n 1,530 für die Zellwand entspricht, gefolgt von Zytoplasma, wenn n gleich 1,535 ist. Hier wird eine tiefe Abbildung von mutierten und wilden Biofilmen des Typs C.albicans gezeigt. Der wilde Biofilm wuchs auf eine Dicke von 502 Mikrometern, wie in der SeitenansichtProjektion des 538 Ebene konfokalen Bildstapels zu sehen ist.
Axialprojektionen von Scheitel auf Basis zeigen die Variation ender Zelltypen und verschiedener Schichten des Biofilms. Dieses Beispiel zeigt die charakteristische Wildtypstruktur. Der mutierte Biofilm wuchs auf eine Dicke von 500 Mikrometern, wie in der Seitenansichtsprojektion des 556-Ebenen-Bildstapels zu sehen ist.
Diese Mutante, die bekanntlich in Ermangelung von induzierenden Stressoren ein fadenförmiges Wachstum durchläuft, erzeugte eine dramatisch andere Architektur. Wie sowohl in der Seitenansicht als auch in den axialen Projektionen zu sehen ist, führen viele verzweigte Zellen zu radialen Auswüchsen. Dies ist ein High Refractive Index Deep Imaging-Protokoll.
Idealerweise sollten der Brechungsindex der Probe und der Brechungsindex des Tauchöls übereinstimmen. Deshalb verwenden wir in diesem Fall ein Ziel für das Eintauchen von Öl. Die meisten unserer Studien waren strukturelle Bildgebung von Biofilmen mit Zellwandmarkern, aber jede Fluoreszenzmethode, die mit festen Proben verwendet wird, sollte funktionieren, einschließlich Immunfluoreszenz, Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung und Reporter-Genexpression.
Dieser besondere Organismus, Candida albicans, ist bei gesunden Menschen commensal, aber auch ein opportunistischer Erreger, der Schleimhaut- oder systemische Hefeinfektionen verursachen kann. In einigen Institutionen sind BSL-II-Containment-Methoden und -Protokolle erforderlich. Darüber hinaus sind Formaldehyd- und Glutaraldehyd-Fixative flüchtig und gefährlich.
Sie sind bekannt karzinogene. Machen Sie Verdünnungen von Fixativen in einer Dunstabzugshaube. Halten Sie Gerichte mit verdünnten Fixativen bedeckt und legen Sie keine Behälter mit diesen Fixativen in einen Biosicherheitsschrank oder in einen Zellkultur-Inkubator.
