We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. Einrichtung eines FT-IR-Mikroskop und Erwerb Tissue Bilder <ol><li> Abschnitt ein Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeblock bei 4 &amp; mgr; m Dicke auf, um einen IR-kompatibel Rutsche mit einem Mikrotom. Alternativ Abschnitt ein mit flüssigem Stickstoff gefrorenen Gewebe bei 4 &amp; mgr; m Dicke auf einem IR-kompatiblen Objektträger unter Verwendung eines Kryostaten. HINWEIS: In der Regel wird eine serielle Abschnitt ebenfalls auf einem Glasträger erworben und angefärbt mit einem speziellen (wie Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)) oder immunhistochemische Färbung kommen. Zusätzlich können kultivierte Zelllinien auf IR kompatibel Trägern gezüchtet werden. IR kompatibel Dias IR reflektierenden Folien für Reflexionsmodus Bildgebung (zB mirrir Rutsche, Gold) oder IR-transparente Folien für den Transmissionsmodus Bildgebung (zB BaF 2, CaF 2). </li><li> Spülen Sie die FT-IR-Mikroskop und Spektrometer entweder mit trockener Luft oder trockenem Stickstoff auf atmosphärischen Wasser aus dem System zu entfernen. Warten Sie mindestens 45 Minuten vor der Belichtung, um eine gründliche PURG gewährleistene. </li><li> Kühle sowohl die FPA-Detektor (bis 79 K) und der Innen MCT-Detektor in der FT-IR-Mikroskop unter Verwendung von flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Detektoren etwa alle 6 Stunden. VORSICHT! Flüssiger Stickstoff ist ein Tieftemperaturfluid und kann Kaltverbrennungen, Erfrierungen und in geschlossenen Räumen Ersticken verursachen. </li><li> Befestigen Sie den Probenobjektträger auf dem Mikroskoptisch für FT-IR-Bildgebung. </li><li> Stellen Sie sicher, das sichtbare Licht ist &quot;ON&quot; und dann entweder mit dem Fernglas oder die Probe-Capture-Programm (die eine Echtzeit-sichtbares Bild des Gewebes bietet), den Schwerpunkt auf die Probe. </li><li> Öffnen Sie das Bundle Software-Paket wie Entschließungen Pro und klicken Sie auf &quot;Collect&quot; und klicken Sie auf &quot;Diagnose&quot; und wählen Sie &quot;Ausrichten Spectrometer&quot;. Sicherzustellen, dass der Strahlengang des Spektrometers internen Detektor nicht behindert wird. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Bildeinstellungen&quot;. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Electronics&quot;, wählen Sie die entsprechende &quot;Speed&quot;, &quot;Unter Sampling Ratio (UDR) &quot;und&quot; Filter &quot;Einstellungen je nach System. HINWEIS: In diesem Beispiel ist die Einstellung Geschwindigkeit = 2,5 KHz, UDR = 4 und Filter = Keine. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Optics&quot; sicherzustellen, dass &quot;Mid-IR-Quelle&quot;, &quot;Offene Blende&quot; und &quot;100% Strahlabschwächer &#39;ausgewählt sind. </li><li> Um an der &quot;Optics&quot; Registerkarte, wählen Sie &quot;Detector&quot; als &quot;Masse&quot; Kalibrierung des Systems, &quot;Microscope Detector&quot; als &quot;links&quot;, und wählen Sie entweder &quot;Durchlässigkeit&quot; oder &quot;Reflexion&quot; unter &quot;Optik-Modus &#39;, je nach Art von schieben verwendet. </li><li> Klicken Sie auf Setup, die das Fenster &#39;Lancer Control&#39; eröffnen wird. HINWEIS: Bei Reflexion folgen Sie den Anweisungen in 1,12 und 1,13 und für Übertragungsmodus folgen Sie den Anweisungen in 1,14-1,16. Weiter von 1,17 sowohl für Reflexion und Transmission. </li><li> Für Reflexionsmodus in &amp;# 8216; &#39;auf&#39; Raw &#39;Lancer Control. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich auf der Folie. </li><li> Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Anschließend bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes. Ändern &quot;Wärme&quot; und &quot;Kontrast&quot; Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren, wird dies keinen Einfluss auf die IR-Daten haben. Weiter 1,18. </li><li> Für Übertragungsmodus, in klicken Sie auf &#39;Lancer Control&#39; auf &#39;Raw&#39;. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich des Objektträgers. </li><li> Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. </li><li> Stellen Sie die untere Schwerpunkt / Kondensator Ziel, die Anzahl der Zählungen seiner Maximu erhöhenMeter Sehen Sie sich die Form der unteren rechten Bild in Lancer Kontrolle, um sicherzustellen, dass es Gauß in Aussehen und relativ einheitlich ist. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte. HINWEIS: Wenn eine der Bildpunkte in der FT-IR-Bild Interferogramm weiß werden, reduzieren Sie die Integrationszeit. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden und perfekt den Fokus des Bildes. Optional können Sie die Wärme und Kontrast Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentriert, aber keine Auswirkungen auf den IR-Daten haben. </li><li> Mit der Bühnensteuerung Joystick bewegen, um einen reinen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Kalibrieren&quot;. Stellen Sie sicher, die &quot;Out Of Range (OOR)&quot; Wert unter 50 und der Unterschied zwischen der &#39;High Flux &quot;und&quot; Low Flux &quot;zählt mindestens 4000 zählt. </li><li> Wählen Sie zweimal auf &quot;OK&quot;. In der Optik Registerkarten auszuwählen; &quot;Detector&quot; = &quot;MCT&quot;, &quot;Microsbewältigen Detector &#39;=&#39; Rechts &#39;und klicken Sie auf &quot;Setup&quot;. An diesem Punkt wird es eine FT-IR-Interferogramm auf dem Bildschirm sein. Klicken Sie auf &#39;Suchen Center&#39;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Optics&quot;, wählen Sie erneut &quot;Detector &#39;=&#39; Masse &#39;,&#39; Mikroskop Detector &#39;=&#39; Links &#39;und wählen Sie&quot; Setup &quot;. </li><li> In Lancer Steuerung - sicher, das Bild immer noch auf eine saubere Fläche und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot; erneut. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Als nächstes sammelt ein Hintergrundbild FT-IR zur Absorption aus der Atmosphäre, und Einschub korrigieren. Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Electronics&quot; und wählen Sie eine geeignete spektrale Auflösung, in der Regel von 4 cm -1 oder 8 cm -1 für Gewebe. </li><li> Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Hintergrund&quot; und geben Sie 128 in &#39;Scans zusammen hinzufügen&#39;. Wählen Sie die &quot;New File ... &#39;Taste und legen Sie die Hintergrunddatei in entsprechende Falteäh. Registerkarte &quot;Imaging&quot;, um sicherzustellen, Mosaik 1 durch 1. Klicken Sie auf &quot;Hintergrund&quot; Überprüfen Sie, warten Sie, bis der Scanvorgang beenden und bestätigen Sie, wo die Datei gespeichert werden. Klicken Sie auf eine Region auf dem Hintergrund FT-IR-Bild und überprüfen Sie das Spektrum. </li><li> Um eine große Mosaikbild der Probe zu nehmen, wählen Sie die Registerkarte &quot;Imaging&quot; und die Anzahl der X- und Y-Rahmen-Einsatz für das Mosaik Größe, die Sie erwerben möchten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Setup&quot; und im Lancer Steuerung verwenden Sie die Live-IR im Hinblick auf den Bereich von Interesse zu finden. Wenn die ein Mosaik, zentriert den Live-Feed in der Mitte der Bereich von Interesse. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Electronics&quot; und geben Sie die Anzahl der Scans zusammen hinzufügen (typischerweise einen Wert zwischen 2 und 16 Scans für Gewebe). Klicken Sie auf Durchsuchen. </li><li> Überprüfen Sie die gesammelten Bild FT-IR auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass es fokussierter aussieht. Klicken Sie auf das Bild nach oben von diesem Standort zu bringen, ein IR-Spektrum und überprüfen Sie, dass es aussieht, um ein akzeptables Signal-Rausch haben. AcquiRe ein sichtbares Bild der Probe. </li><li> Speichern Sie das Bild und exportieren Sie auf das gewünschte Format, wie ENVI-IDL. </li></ol> 2. Die Anpassung eines FT-IR-Mikroskop für HD-Fähigkeiten HINWEIS: Die meisten FT-IR-Systeme sind mit einer Objektiv etwa 15-facher Vergrößerung und 0,5 numerische Apertur (NA) versehen. Um das Bild in High-Definition-Modus kann ein IR-kompatibel 36X oder 74X Ziel verwendet werden, um Beugungs geben begrenzte Imaging-Funktionen werden. <ol><li> Entfernen 15X Zielsetzung dieses Systems durch Herausdrehen gegen den Uhrzeigersinn. </li><li> Schrauben Sie entweder in der 36X oder 74X Ziel an seinem Platz. Richten Sie das Ziel vor dem Gebrauch. Verwenden Sie Objektivverlängerungsrohre das Ziel nahe genug, um die Probe zu bringen. </li><li> Zeigen Gewebe unter dem neuen Ziel und Fokus mit sichtbarem Licht entweder das Fernglas oder Proben Capture-Programm. Hinweis: Neben einem HD-Imaging muss in Übertragungsmodus durchgeführt werden. Die sehr enge Arbeitsabstand von derse Ziele (1-2 mm) und sehr flache Schärfentiefe erfordert langsam und vorsichtig konzentrieren, die Zeit nehmen, um das Ziel, ohne die Probe zu berühren zu senken. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen von 1,6 bis 1,11. HINWEIS: Aufgrund signifikant schwieriger zu konzentrieren und weniger Licht den Detektor erreicht, wird das folgende Protokoll basierend auf 1,14 eingestellt. </li><li> Im Übertragungsmodus, klicken Sie auf &quot;Raw&quot;. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), um das Gewebe zu bewegen und sich (im Idealfall auf einer Kante). Hinweis: Dies kann schwierig sein, daher die &quot;Wärme&quot; und &quot;Kontrast&quot; Optionen einstellen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren (diese Optionen nicht auf der IR-Daten betreffen). </li><li> Einmal ausgerichtet, mit dem Bühnensteuerung Joystick und die Live-Ansicht IR Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Stellen Sie die untere Fokussierobjektiv zuErhöhung der Anzahl von Zählungen auf seinen Maximal. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes. </li><li> Wenn Mosaikieren ein Bild mit einer hohen Auflösung, passen Sie die Bühne, um die korrekte Bewegung über Entfernungen für genaue Mosaik erforderlich ermöglichen. Um die Bühne Abstand Einstellungen zu ändern, gehen Sie auf &quot;Setup-Phase&quot; in Lancer Steuerung und stellen Sie die horizontale und vertikale Ausrichtung Einstellungen zur korrekten Mosaik ermöglichen. </li><li> Mit der Bühnensteuerung Joystick Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Kalibrieren&quot;. Stellen Sie sicher, die außerhalb des Bereichs (OOR) Wert kleiner als 50 für beide 36X und 74X Ziele. Achten Sie darauf, die Differenz zwischen dem Hochfluss und Low Flux-Werte mindestens 1000 zählt für die 74X Objektiv und 2000 zählt für die 36X Ziel. </li><li> Weiter 1,19-1,27. Die Anzahl der Abfragen in 1.23 und1.25 müssen aufgrund der reduzierten Signal auf ca. 256 Scans für das Hintergrundbild und 16 bis 128 Scans für das Gewebebild eingestellt werden. </li></ol> 3. Visualisieren und Klassifizieren IR Spectral Datensätze HINWEIS: In diesem Abschnitt werden wir besprechen, wie die Visualisierung und Extrahieren von Daten aus spektrale Bilder mit Geo-Bildverarbeitung und Analyse-Software wie ENVI + IDL, aber der Prozess ist für jede alternative Software wie MATLAB, freie Software wie CytoSpec sehr ähnlich oder des Instruments Entwickler eigene Software. Es gibt einige unterschiedliche spektrale Verarbeitungstechniken, die auf der IR-Daten durchgeführt werden kann. <ol><li> Open Geospatial Bildverarbeitung und Analyse-Software und laden Sie die IR-Datendatei. </li><li> Tragen Sie eine Basislinienkorrektur-Algorithmus auf die IR-Daten, indem Sie &quot;Spectral-Tools&quot; und blättern Sie nach unten und klicken Sie auf &quot;Absorptionsspektren&quot;. Ein Pop-up-Menü Beobachten und wählen Sie &quot;Baseline correction &quot; HINWEIS: Basislinienkorrektur wird eine Baseline Offset Steigung aus den Daten durch Streuung entfernen </li><li> Führen Spectral Normalisierung durch Verhältnisbildung der Daten zu einer bestimmten spektralen Spitze (typischerweise Amid I (1650 cm -1) oder Amid II (1550 cm -1)) bzw. Fläche unter einem definierten Bereich des Spektrums. Wählen Sie dazu &quot;Normalspektren&quot; unter den &quot;Absorptionsspektren&quot; Menüoptionen. HINWEIS: Spectral Normalisierung so durchgeführt, daß die Unterschiede in den Spektren sind real biochemischen Unterschiede und nicht in Folge der Dicke und Dichte der Unterschiede zwischen den Proben. </li><li> Verwenden Sie ein Geräuschreduktionsalgorithmus, um Lärm von der Spektren falls 28 zu entfernen. HINWEIS: Es gibt mehrere Ansätze zur Verfügung, mit dem Basislinienkorrektur, spektrale Normalisierung und Rauschunterdrückung erreicht werden kann, wobei die meisten Software, die automatisierte Algorithmen eingebaut Darüber hinaus gibt es ein aufstrebendes Reihe von Ansätzen, die für die Korrektur wird.spektrale Abweichungen, die im Detail 29-42 diskutiert wurden; Allerdings hat die Gemeinschaft noch nicht einigen, welche von diesen benötigt werden. </li><li> Beobachten einer Liste aller IR-Frequenzen innerhalb des Bildes (typischerweise von einem Spektralbereich von 900 bis 4000 cm -1) gesammelt. Klicken auf den Frequenzen, die auf bestimmte Biomoleküle entsprechen, um ein Bild des Gewebes bei der ausgewählten Frequenz zu beobachten. <ol><li> Klicken Sie beispielsweise auf 1650 cm -1 Band um die Verteilung der Proteine ​​in der Probe zu beobachten. Alternativ klicken Sie auf 1080 cm -1 Band um die Verteilung der Nukleinsäuren in der Probe zu beobachten. Verwenden Wellenzahl 1650 cm -1. </li></ol></li><li> Erstellen Sie zusätzliche Bilder durch die Berechnung Spektralspitze Höhenverhältnisse, Peakflächenverhältnisse usw., die für die Visualisierung verschiedener biomolekularer Komponenten ermöglicht. Klicken Sie auf &quot;Spectral Extras&quot; und wählen Sie dann entweder &quot;Peakhöhe Verhältnisse&quot; oder &quot;Berechnen Bildbereich &#39;um Bilder zu erstellen. </li><li> Scannen Sie den entsprechenden benachbarten Gewebeschnitt, die befleckt mit einem separaten gesamte Dia-Imager-System, das Hellfeld Bilder erfasst wird. Neben dem Infrarotbild, um das digitale Bild des gefärbten Gewebe mit einer sichtbaren Bildprogramm. </li><li> Rechtsklicken Sie auf das Bild, um einen interessierenden Bereich und wählen Sie &quot;Z-Profil&quot;. Dies gibt die spektrale Information zu dem ausgewählten Pixel. </li><li> Schauen Sie sich die IR-Spektren von mehreren Pixeln aus mehreren Klassen, wie zum Beispiel den Vergleich Zelltypen, Krankheitszuständen. Mark spezifischen Pixel auf dem Bild mit dem &quot;Regions Of Interest&quot; (ROI) Tool. Um dies durchzuführen, klicken Sie rechts auf das Bild und wählen Sie &quot;ROI-Tool &#39;. Erstellen Sie die Klassen, die gekennzeichnet sind, zum Beispiel normal, Dysplasie und Krebs-Klassen. Wählen Sie dann &quot;ROI-Typ&quot; - &quot;Point&quot;. Wählen Sie dann die Klasse, um Pixel zu wählen und stützen sich auf die entsprechenden Pixel auf dem IR-Bild. Leiten Sie die durchschnittlichen Spektren foder jede der Klassen mit dem &quot;Durchschnitts ROI &#39;Werkzeug. </li><li> Vergleichen abgeleiteten Spektren durch Auftragen in Grafik-Software. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR ist ein aufstrebendes Modalität für markierungsfreie biochemischen Bildgebung von Gewebeschnitten, mit dem Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der aktuellen Standard der Diagnose in der Pathologie haben. Der aktuelle Gold-Standard für Pathologie erfordert Gewebe biopsiert werden, in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mehrfach geschnitten und mit mehreren Färbemitteln angefärbt. Eine gut ausgebildete Pathologen muss subjektiv visuell beurteilen die Gewebestruktur und Zellmorphologie, um eine Diagnose zu bestimmen. Hier zeigen wir, wie man hochauflösende IR-Bilder zu sammeln aus der gleichen Art von Teilen und diskutieren einige der computergestützten Ansätzen zur chemischen Unterschiede zwischen Zelltypen und Krankheitszuständen zu untersuchen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind, um sicherzustellen, dass das Gewebe sehr sorgfältig ausgerichtet, und dass das System gut kalibriert ist, um eine sehr hohe Qualität spektroskopischen Daten zu gewährleisten. Die Sorgfalt bei der Einrichtung des Systems ist besonders kri<html> cal beim Arbeiten mit stark vergrößernden Objektiven. Um bei der Fehlersuche, die folgende Liste deckt einige der potenziellen Schwierigkeiten; Problem: Niedrige IR-Intensität bei der Abbildung in der Reflexion. Lösung: Überprüfen Sie IR-Folie-Ausrichtung wie die reflektierende Beschichtung kann auf der falschen Seite der Folie ist. Problem: Low-Signal / rot Warnzeichen in Lancer Control. Lösung: Kühle Detektoren mit LN2. Flüssiger Stickstoff wird für die FPA Melder funktionieren erforderlich und erfordert regelmäßig nachgefüllt wird. Problem: Geschwindigkeit Fehler / Bewegungsfehler. Lösung: Setzen Sie Spektrometer und Vibrationen zu reduzieren. Vibrationen bewirkt, dass der bewegliche Spiegel in dem Interferometer gestört werden. Problem: Die Wasserdampfspitzen Daten. Lösung: Erhöhen Sie auf Purge-System und Probe aus der Luft zu schützen. Problem: Ungültige Center. Lösung: Suchen Center erneut. e_content &quot;&gt; Problem. Niedrige Flussdifferenz Übertragung, obwohl fokussiert. Lösung: Anpassen Sumpfkondensator Dies wird auftreten, wenn das IR-Licht wird nicht bis zu einem Punkt auf der Probe fokussiert. In dieser Arbeit haben wir, wie hochauflösenden IR-Bilder von Gewebe entweder in Transmission oder Transflektanzbetriebsweise erwerben konzentriert. Die Natur des FT-IR-Bildgebung besteht darin, dass es mehrere Modifikationen, die an der Datenerfassungs gemacht werden können, wie zum Beispiel, die Art des Substrats, Fixiertechnik, Probendicke, Spektralauflösung Interferometerspiegel Geschwindigkeit etc. Die Wirkung dieser Parameter aufweist kürzlich 4,5,17,51 in umfangreichen ausführlich diskutiert. Es gibt eine Reihe von Modifikationen, die an dem Bilderzeugungssystem mit Bilderzeugungs in ATR Modus 10,24,26 und nanoskalige thermische Ansätze 52,53 für hochauflösende IR Imaging ermöglichen gemacht werden können. Die wichtigste Einschränkung mit hoher Auflösung IR-Bildgebung ist, dass der tiHEMEN muss sorgfältig vorbereitet werden und dünn genug für IR durch (typischerweise 4 &amp; mgr; m Dicke) bestehen. Zusätzlich Transmission und Reflexion FT-IR-Abbildungs ​​erfordert die Proben trocken sein aufgrund der Absorption des IR von Wasser. Jedoch weist FT-IR-Abbildungs ​​signifikante Vorteile gegenüber anderen Techniken, da sie sehr schnell große Flächen von Gewebe bei der Ableitung reichen und detaillierten biochemischen Informationen. Andere ähnliche Techniken, die in einer markierungsfreien Mode biochemische Information abzuleiten schließen Raman-Spektroskopie, wird jedoch die Zeit der Datenaufnahme ist viel langsamer, um Bilder zu erfassen. New Raman Imaging Ansätze entstehen, einschließlich stimulierter Raman-Streuung (SRS) und Coherent Antistokes Raman-Streuung (CARS); sie haben jedoch Zugang begrenzten Spektralbereich oder Einzelfrequenz-Bildgebung. Die Fortschritte in der Geschwindigkeit der Datenerfassung, räumliche Auflösung, und die Verfügbarkeit von Rechen Ansätze von unschätzbarem Wert bei der Herstellung von FT-IR imag gewesening ein praktikabler Ansatz für die Übersetzung als neuen Imaging-Tool in der Pathologie. Die jüngsten Fortschritte in der räumlichen Auflösung, besonders wichtig für die Gewebepathologie wurde durch Tastenzelltypen nicht in der auflösbaren Verwendung herkömmlicher FT-IR-Abbildungssystemen. Die jüngste Veröffentlichung von Reddy et al. gezeigt, wie ein ideales System die optimale räumliche Auflösung eines FT-IR-Abbildungssystem 5 erhalten modellieren. Das Nierengewebe beispielsweise in diesem Papier zeigt, wie wichtig eine höhere räumliche Auflösung, um die biochemischen Informationen aus glomeruläre Strukturen (Abbildung 3 und Abbildung 5) zu extrahieren. In der Zukunft, neue Fortschritte in der Quantenkaskadenlaser, wie sehr helle IR-Lichtquellen 54 bis 57, 3D Spectral Imaging 58 und Durchbrüche im Bereich der nanoskaligen IR Technologien 52,53,59,60 halten spannende neue Wege der Forschung, die möglicherweise enorme Auswirkungen in der Zukunft von Gewebe-Bildgebung. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Wir haben Beispiele für Anwendungen, in Leber- und Nierenerkrankungen vorgestellt, wo es einen Bedarf an zusätzlichen biochemischen Informationen, von diagnostischem Wert sein kann. Der Spectral Pathology Lab in der Abteilung für Pathologie an der Universität von Illinois in Chicago ist auf die Übersetzung von IR-Imaging-Technologien zur Verbesserung der Diagnose von Krankheiten konzentriert und verbesserte Vorhersage der Behandlungserfolg. FT-IR-Bildgebung können einige der derzeitigen Beschränkungen in der Pathologie der Praxis, wo quantitative und objektive Information ist erforderlich, zu überwinden. Insbesondere wird die künftige Arbeit auf die Ermittlung von Bereichen in der aktuellen Praxis für Pathologie in dem aktuellen Techniken keine ausreichende diagnostische Sensitivität liefern oder einen begrenzten Aufschluss konzentriert. A ergibt sich die Notwendigkeit der Verbesserung der derzeitigen Praxis für Pathologie und Richtung geben weitere Informationen zu den Pathologen zu Krankheitsstatus des Patienten, die erreichbar sein kann mit High-Definition-FT-IR-Bildgebung.

IR-Spektroskopie ist ein Analyseinstrument seit den 1930er Jahren in irgendeiner Form; es ist jedoch nur innerhalb der letzten zehn Jahre, dass der Bereich der Gewebebildgebung mit FT-IR explodiert gewesen. 1) erhöhte Geschwindigkeit der Datenerfassung durch die Verfügbarkeit großer Focal Plane Array (FPA) Detektoren, die haben in der Regel Tausende von IR-empfindliche Detektoren 1: Die Fortschritte in der FT-IR für Tissue Imaging haben in einem großen Teil durch drei wesentliche Entwicklungen getrieben , 2, 2) Entwicklung fortschrittlicher Verarbeitungsalgorithmen und Rechenleistung, große hyperspektralen Daten verarbeiten Sätze 3 und 3) Modellierung der FT-IR-Bildgebungssysteme, um die räumliche Auflösung 4,5 maximieren. Es gab zahlreiche qualitativ hochwertige und sehr umfangreiche Artikel Überprüfung der Bereich der FT-IR-Spektroskopie kürzlich 6-16, neben einem Natur Protokolle Papier, das die Schritte zum Punkt Spektren oder Karten aus dem Gewebe 17 zu erhalten Details. In dieser Arbeit werden wir uns auf die prot konzentrierenocol um Bilder von Geweben mit einem 128 x 128 FPA-Detektor in einer modifizierten FT-IR-System mit High-Definition-Fähigkeiten zu erhalten. FT-IR-Bildgebung ist seit langem vorgeschlagen worden, auf Grund der Möglichkeit, Bilder, in denen jedes Pixel hat eine Fülle von biochemischen Informationen zu erhalten, um ein möglicherweise wünschenswert für Zell- und Gewebebildgebung ist. FT-IR-Bildgebung beruht auf dem Prinzip, daß verschiedene Biomoleküle in der Probe quantitativ zu absorbieren unterschiedliche Regionen des mittleren Infrarot; Dies ermöglicht die Ableitung eines &quot;biochemischen Fingerprint. Dieser Fingerabdruck war in vielen Studien gezeigt, dass zwischen den verschiedenen Zelltypen und Krankheitszustände zu verändern. Anders als bei herkömmlichen Praxis für Pathologie, wo Flecken und immunhistochemischen Marker müssen verwendet werden, um sichtbar zu machen und zu identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, die verwendet werden, um die Diagnose und Behandlungsmöglichkeiten zu führen, werden die Bilder von FT-IR basierend auf der inhärenten Biochemie des Gewebes gebildet. Die aktuelle technique der Färbung Gewebe für die Diagnose ist zeitaufwändig, zerstörerisch, mühsam und erfordert subjektive Expertise des Pathologen, während FT-IR bietet das Potenzial dieser Prozess schnell, zerstörungsfrei, hochautomatisierten und objektiver zu gestalten. Zusätzlich stellt FT-IR einen neuen Weg zur Erlangung zusätzlicher biochemischer Informationen, die nicht leicht zugänglich sein können mit herkömmlichen Färbetechniken. Eine der aufregendsten Entwicklungen in den letzten Jahren war die Verfügbarkeit von hochauflösenden bildgebenden Methoden, die jetzt für die Visualisierung und Charakterisierung von Zelltypen und Gewebestrukturen, die für die umfassende Diagnose von Krankheiten sind erlauben können. Eine dieser Techniken ist für abgeschwächte Totalreflexion (ATR), FT-IR, die eine feste Immersionslinse (SIL) mit einem hohen Brechungsindex, der für eine hochauflösende Abbildung 18 ermöglicht, wobei viele sehr aufregende Studien zeigen ihre Anwendungen 19-25 enthält. Darüber hinaus ist es wwie kürzlich gezeigt, dass die erhöhte räumliche Auflösung mit ATR-Bildgebung verbunden sind, können für die Visualisierung und Klassifizierung von endothelialen und Myoepithelzellen im Brustgewebe, die eine Schlüsselkomponente der Brustkrebsdiagnose 26 bilden können. Während ATR-Bildgebung ist sehr nützlich, erfordert diese Technik die SIL den Kontakt mit dem Gewebe, um FT-IR-Bilder zu bilden zu machen; daher ist ihre Verwendung etwas für Gewebepathologie denen große Bereiche der Gewebe müssen schnell abgebildet werden begrenzt. Ein zweiter Ansatz wurde durch Kuppeln einer hohen linearen Ziels an eine vorhandene FT-IR-System, das eine Synchrotronstrahlung als helle Quelle von IR verwendet gezeigt, ist es möglich, vollständig zu beleuchten eine FPA und Bild mit einer effektiven Pixelgröße von 0,54 x 0,54 um. Dies ermöglichte es uns, Schlüsselstrukturen in Brust- und Prostatagewebe, die nicht auflösbar mit herkömmlichen FT-IR-Systeme 4 wurden zu visualisieren. Während dieser dramatischen Anstieg der IR-Bild räumliche resolution waren aufregend, seine Verwendung blieb aufgrund eines Synchrotron erfordern begrenzt. Anschließend wurde ein optimales System entwickelt, die auch für High-Definition-Imaging-Funktionen mit einem 1,1 x 1,1 um Pixelgröße, ohne das Erfordernis einer Synchrotronquelle, sondern mit einem herkömmlichen Globar IR-Quelle 5 ermöglichen kann. In diesem Artikel zeigen wir, wie Sie ein bestehendes Handels FT-IR-Bildgebungssystem für beugungsbegrenzte IR Bildgebung von Gewebe mit einem akzeptablen Signal-Rauschverhältnis mit mehreren IR-Ziele (15X, 36X und 74X) erlauben zu ändern. Die effektive Pixelgröße mit den drei Zielen ist 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) und 1,1 x 1,1 um (74X). Wir geben dann einige Beispiele für die Bedeutung der Gewinne in der räumlichen Auflösung für die Erkennung von Krankheiten in Leber- und Nierenbiopsien 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1102">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cary 600 Series FT-IR system</td>
			<td style="width:308px;">Agilent</td>
			<td style="width:192px;">Multiple configurations&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Alternate FT-IR imaging systems exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">MirrIR slide</td>
			<td style="width:308px;">Kevley Technologies</td>
			<td style="width:192px;">CFR</td>
			<td>For FT-IR reflection-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Barium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Calcium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry Nitrogen/Dry Air gas</td>
			<td style="width:308px;">Multiple gas suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hexane</td>
			<td style="width:308px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For deparafinizing tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:308px;">Multiple cryogenic liquid suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ENVI-IDL software</td>
			<td style="width:308px;">Exelis-Vis</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>Other software packages available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Whole slide Imager</td>
			<td style="width:308px;">Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>To image stained slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) spektroskopischen Bildgebung ist eine neue Herangehensweise, um detaillierte Bilder, die biochemische Information verbundenen erhalten. FT-IR-Bildgebung von Gewebe beruht auf dem Prinzip, daß unterschiedliche Bereiche der mittleren Infrarot durch unterschiedliche chemische Bindungen (z, C = O, CH, NH) innerhalb von Zellen oder Gewebe, die dann auf die Anwesenheit und Zusammensetzung beziehen absorbiert basierend von Biomolekülen (zB Lipide, DNA, Glycogen, Protein, Kollagen). In einem FT-IR-Bild jedes Pixel in dem Bild umfasst eine gesamte Infrarot (IR) -Spektrum, das Informationen über die biochemische Status der Zellen, die anschließend zur Zelltyp oder krankheits Typisierung genutzt werden können geben. In diesem Beitrag zeigen wir: wie man IR Bilder von menschlichen Geweben mit einem FT-IR-System zu erhalten, wie Sie vorhandene Instrumente zu modifizieren, um für hochauflösendes Imaging-Funktionen zu ermöglichen, und wie die FT-IR-Bilder zu visualisieren. Wir stellen dann einige Anwendungen der FT-IRfür Pathologie mit der Leber und Niere als Beispiele. FT-IR-Bildgebung hält spannende Anwendungen bei der Bereitstellung einer neuartigen Zugang zu biochemischen Informationen aus Zellen und Gewebe in einem völlig markierungsfreie störungsfreie Weg zu geben neue Einblicke in biomolekulare Änderungen im Rahmen von Krankheitsprozessen zu erhalten. Darüber hinaus kann diese biochemische Information potenziell ermöglichen objektive und automatisierte Analyse bestimmter Aspekte des Krankheitsdiagnose.

FT-IR-Bildgebung ermöglicht die Ableitung der IR-Bilder von Gewebe, das Kontraststufen in Abhängigkeit von der IR-Frequenz von Interesse geben. Zusätzlich ist in einem IR-Bild, nimmt die gesamte IR-Spektrum für jedes Pixel, mit unterschiedlichen Peaks, die den verschiedenen Biomolekülen, die Informationen über die biochemischen Eigenschaften von Zelltypen oder Krankheitszuständen (Abbildung 1) geben kann. Hier haben wir gezeigt, wie man spektralen Signaturen zwischen den Klassen zu vergleichen, jedoch erweiterte automatisierte Klassifizierung ist möglich durch zusätzliche Algorithmen 3,43-50 wie Bayes-Klassifizierung, Random Forests, Künstliche Neuronale Netze und Hierarchische Clusteranalyse kann auf die durchgeführt werden, haben Daten. Wachte Klassifizierung Ansätze für die Konstruktion eines Klassifizierers, die ausgebildet ist, um für die automatische Erkennung von Zelltypen oder Krankheitszustände zu ermöglichen ermöglichen. Unüberwachten Klassifizierung Ansätze können verwendet werden, um natürlich vorkommende dif suchenKonferenzen in Gewebe oder Zellen durch biochemische Varianz. FT-IR-Messtechnik hat sich in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt, aus der Messung in einem einzigen Punkt / Abbildungsmodus mittels IR undurchsichtig Öffnungen Abbildungsmodus mit Cassegrain Ziele, wobei entweder eine Beleuchtungsobjektiv gekoppelt mit einem Sammelziel der Übertragungsmode oder einer einzigen Objektiv daß beide optisch und sammelt sich in Reflexionsmodus (Abbildung 2). Kürzlich wurde gezeigt, daß das Sammelziel im Transmissionsmodus kann für eine höhere Vergrßerung und numerische Apertur Ziel geschaltet werden, um für die Beugung begrenzten IR-Bildgebung, die zu einer beträchtlichen Erhöhung der räumlichen Auflösung des gesammelten IR-Bilder 4,5 führt zu ermöglichen. Die Fortschritte in der räumlichen Auflösung für eine Gewebe Bildgebung von entscheidender Bedeutung gewesen, da wir nun die Funktionseinheiten der Niere Glomeruli identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, beispielsweise unter Verwendung von in-house angepaßtFT-IR-Systeme (Figur 3). Neben einem HD-FT-IR-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Bilder von Gewebe untersucht, um anomale Regionen zu identifizieren und biochemischen Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen zu identifizieren. Bei einer Lebergewebe Kern ist es möglich, Hepatozyten und Regionen infiltrierenden Fibrose, die zwei verschiedene Bereiche von Dysplasie und nicht-dysplastischen Zirrhose (Figur 4) trennt visualisieren. Wir arbeiten daran, diese dazu bei, automatisierte Diagnose-Tools für den Einsatz in schwierigen Fällen von Lebererkrankungen zu nutzen. Wichtig ist, dass die erhöhte räumliche Auflösung nun ermöglicht es uns, bestimmte strukturelle Merkmale, die durch Krankheit chemisch modifiziert werden kann, bevor histologischen Veränderungen erkennbar sind, zu isolieren. Zum Beispiel haben wir die Identifizierung biochemischen Veränderungen in der Niere Glomeruli wie die Bowman-Kapsel, mesangium, glomerulären Basalmembran und Rohr Basalmembran fokussiert werden, bevor<html> Änderungen durch den Pathologen identifiziert beobachtet werden (Abbildung 5). Insbesondere interessieren wir uns bei der Identifizierung von Änderungen mit dem Fortschreiten der diabetischen Nephropathie und chronischer Abstoßung bei Transplantationspatienten, in denen aktuelle Techniken nicht zu Änderungen in einem ausreichend frühen Mode für erfolgreiche Intervention zu identifizieren verbunden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Abbildung 1: FT-IR-Spektrum von Bildern und von einer Leberkern. Bild von (A) H &amp; E gefärbten Kern von Leberbiopsie und Bilder der IR-Absorption der Serienschnitt der gleichen Kern an (B) 3286 cm -1 und (C) 2603 cm -1, die unterschiedliche Strukturmerkmale hervorgehoben. (D) Typische IR-Spektrum von Gewebe, mit bedeutenden Peaks markiert. Balken = 100 um.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Abbildung 2 schema Optics Detaillierung FT-IR-Mikroskop Betriebsarten. (A) In-Übertragungsmodus wird die Probe durch den Boden Ziel beleuchtet, und das Licht durch die Probe durch die obere Objektiv gesammelt. (B) Im Reflexionsmodus dient das vorrangige Ziel, sowohl die Probe zu beleuchten und das reflektierte Licht zu sammeln. Die untere Ziel nicht verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vergleich der different Mikroskopobjektive auf FT-IR-Bild einer Niere Glomeruli bei 2925 cm -1. (A) 15X Sammeln Objektiv mit NA = 0,5 (5,5 x 5,5 um Pixelgröße). (B) 36X Sammelobjektiv mit NA = 0,5 (2,2 x 2,2 um Pixelgröße). (C) 74X Sammeln Objektiv mit NA = 0,65 (1,1 x 1,1 um Pixelgröße). Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Abbildung 4. Spektrale Unterschiede zwischen Fibrose und Leberzellen in der Leber Kern. (A) H &amp; E gefärbten Kern von Leberbiopsie. (B) Bild einer Serienteil Kern in FT-IR gescannt (36X Ziel Setup). (C) Repsentativ Spektren von Hepatozyten und Fibrose, aus Regionen von Gewebe durch die Pfeile in (A) angegeben entnommen und (B). Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Abbildung 5. Differenzierung der Nierengewebebiopsie Funktionen durch den Einsatz von High-Definition-FT-IR-Bildgebung. (A) Periodic-Acid-Schiff gefärbt Abschnitt mit den Merkmalen extrahiert gekennzeichnet werden. (B) einen HD-FT-IR-Bild der CH 2 asymmetrische Streckbereich (36X Ziel Setup) eines Serienschnitt des gleichen Gewebes. (C) Eigenschaften in (A) unter Verwendung des FT-IR-Bild (B) in der Lage, chemisch dif sein extrahiertes markierteszieren die vier Merkmale des Gewebes. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.0K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Serie: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases the accuracy of current delivery to the brain by using arrays of smaller "high-definition" electrodes, instead of the larger pad-electrodes of conventional tDCS. Targeting is achieved by energizing electrodes placed in predetermined configurations. One of these is the 4x1-ring configuration. In this approach, a center ring electrode (anode or cathode) overlying the target cortical region is surrounded by four return electrodes, which help circumscribe the area of stimulation. Delivery of 4x1-ring HD-tDCS is capable of inducing significant neurophysiological and clinical effects in both healthy subjects and patients. Furthermore, its tolerability is supported by studies using intensities as high as 2.0 milliamperes for up to twenty minutes.
Even though 4x1 HD-tDCS is simple to perform, correct electrode positioning is important in order to accurately stimulate target cortical regions and exert its neuromodulatory effects. The use of electrodes and hardware that have specifically been tested for HD-tDCS is critical for safety and tolerability. Given that most published studies on 4x1 HD-tDCS have targeted the primary motor cortex (M1), particularly for pain-related outcomes, the purpose of this article is to systematically describe its use for M1 stimulation, as well as the considerations to be taken for safe and effective stimulation. However, the methods outlined here can be adapted for other HD-tDCS configurations and cortical targets.

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation HD-tDCS

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS), with its 4x1-ring montage, is a noninvasive brain stimulation technique that combines both the neuromodulatory effects of conventional tDCS with increased focality. This article provides a systematic demonstration of the use of 4x1 HD-tDCS, and the considerations needed for safe and effective stimulation.

Technik und Überlegungen bei der Verwendung von 4x1 Ring High-Definition-transkranielle Gleichstrom-Stimulation (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases ...

Forschung

Medizin

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Gewebe-Simulation Phantoms zur Bestimmung der potentiellen Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen in Brustkrebschirurgie

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely related to metabolism and energy expenditure, and its dysfunction is one important contributor for obesity and diabetes. Contrary to previous belief, recent PET/CT imaging studies indicated the BAT depots are still present in human adults. PET imaging clearly shows that BAT has considerably high uptake of 18F-FDG under certain conditions. In this video report, we demonstrate that Cerenkov luminescence imaging (CLI) with 18F-FDG can be used to optically image BAT in small animals. BAT activation is observed after intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) and cold treatment, and depression of BAT is induced by long anesthesia. Using multiple-filter Cerenkov luminescence imaging, spectral unmixing and 3D imaging reconstruction are demonstrated. Our results suggest that CLI with 18F-FDG is a practical technique for imaging BAT in small animals, and this technique can be used as a cheap, fast, and alternative imaging tool for BAT research.

In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS images are constructed from calibrated freehand 2D B-mode ultrasound images, which are positioned into a voxel array. Ultrasound (US) imaging allows quantification of muscle size, fascicle length, and angle of pennation. These morphological variables are important determinants of muscle force and length range of force exertion. The presented protocol describes an approach to determine volume and fascicle length of m.&#160;vastus lateralis and m.&#160;gastrocnemius medialis. 3DUS facilitates standardization using 3D anatomical references. This approach provides a fast and cost-effective approach for quantifying 3D morphology in skeletal muscles. In healthcare and sports, information on the morphometry of muscles is very valuable in diagnostics and/or follow-up evaluations after treatment or training.

3D ultrasound imaging (3DUS) allows fast and cost-effective morphometry of musculoskeletal tissues. We present a protocol to measure muscle volume and fascicle length using 3DUS.

3D Ultraschall-Bildgebung: schnelle und kostengünstige Morphometrie des Muskel-Skelett-Gewebe

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Skelettmuskulatur neurovaskuläre Kopplung, Oxidative Kapazität und mikrovaskuläre Funktion mit "One Stop Shop" Nah-Infrarot-Spektroskopie

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, the fundamental physical diffraction limit prevents interrogation of nanoscale anatomy and subtle pathological changes when using conventional optical imaging approaches. Here, we describe a simple and inexpensive protocol, called expansion pathology (ExPath), for nanoscale optical imaging of common types of clinical primary tissue specimens, including both fixed-frozen or formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue sections. This method circumvents the optical diffraction limit by chemically transforming the tissue samples into tissue-hydrogel hybrid and physically expanding them isotropically across multiple scales in pure water. Due to expansion, previously unresolvable molecules are separated and thus can be observed using a conventional optical microscope.

Nanoscale imaging of clinical tissue samples can improve understanding of disease pathogenesis. Expansion pathology (ExPath) is a version of expansion microscopy (ExM), modified for compatibility with standard clinical tissue samples, to explore the nanoscale configuration of biomolecules using conventional diffraction limited microscopes.

Nanoskopische Bildgebung menschlicher Gewebeabschnitte über physikalische und isotrope Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

DIPLOMA Approach for Standardized Pathology Assessment of Distal Pancreatectomy Specimens

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. Accurate pathology assessment of the pancreatic specimen is essential for providing prognostic information and it may guide further treatment strategies. The recent 8th edition of the American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control (AJCC/UICC) staging system for pancreatic tumors has incorporated significant changes to tumor (pT) stage, which is predominantly based on tumor size. This change emphasizes the importance of careful block selection. Owing to the greater prevalence of tumors in the head of the pancreas, efforts are made to standardize the assessment of pancreatoduodenectomy specimens. However, consensus regarding the macroscopic assessment of distal (i.e., left) pancreatectomy specimens is lacking. The DIPLOMA approach includes the standardized measurement of pancreas and other resected organs, inking of relevant surgical margins and anatomical surfaces without removing covering layers of fat, measurement of tumor size (for T-stage), together with assessment of splenic vessel involvement (and other organs if present). All relevant margins are assessed, and relevant blocks are selected to confirm these parameters microscopically. The current protocol describes a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens. This approach was developed during several meetings with pathologists and surgeons during the preparation phase for an international multicenter trial (DIPLOMA, ISRCTN44897265), which focuses on radicality of distal pancreatectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. This standardized approach can be instrumental in the design of studies and will uniform reporting on the outcomes of distal pancreatectomy. The described technique is used in the DIPLOMA trial for pancreatic ductal adenocarcinoma but may also be useful for other indications.

The current study highlights a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens for pancreatic ductal adenocarcinoma, with special emphasis on the measurement of pancreatic dimensions and those of other organs, inking of margins, measurement of tumor size and proximity to margins, lymph node sampling and block selection.

DIPLOMA Ansatz für standardisierte Pathologie Bewertung von distalen Pancreatektomie Specimens

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. ...