Dieses Protokoll wird die Implementierung und Optimierung der spektral fokussierenden SRS-Mikroskopie demonstrieren und wie sie für Echtzeit-stimulierte Raman-Histologie-Anwendungen verwendet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Geschwindigkeit, mit der Proben verarbeitet werden können, sobald die Instrumentierung richtig ausgerichtet ist, da SRS keine Gewebeverarbeitung und -färbung erfordert. Dieses Protokoll gilt für andere SRS-Anwendungen, nicht nur für die Histologie.
Solche Anwendungen umfassen kleine Moleküle, Medikamente, Zellen und Gewebe. Beginnen Sie mit der Installation eines Paares achromatischer Linsen für den Pumpstrahl, um die Laserstrahlgröße als Ausgangspunkt um das Doppelte zu vergrößern. Platzieren Sie ein 100- und 200-Millimeter-Objektiv etwa 300 Millimeter voneinander entfernt.
Richten Sie dann den Pumpstrahl durch die Mitte beider Linsen aus. Als nächstes platzieren Sie einen Spiegel nach der zweiten Linse, um den Strahl in Richtung einer Wand zu senden, die mehr als einen Meter entfernt ist. Verfolgen Sie den Strahl vom Spiegel zur Wand mit einer IR-Karte und prüfen Sie, ob sich der Strahl in der Größe ändert.
Kollimieren Sie den Balken, wenn sich die Größe des Balkens in Abhängigkeit von der Entfernung ändert. Kombinieren Sie die beiden Laserstrahlen, indem Sie einen dichroitischen Spiegel mit mehreren Lenkspiegeln zur Einstellung installieren. Optimieren Sie die räumliche Überlappung der Pumpe und von Stokes, indem Sie die Strahlen nach dem dichroitischen Spiegel an zwei verschiedenen Positionen im Abstand von etwa einem Meter überwachen.
Stellen Sie den Lenkspiegel, gefolgt vom dichroitischen Spiegel, iterativ ein, um den Stokes-Strahl mit dem Pumpenstrahl auszurichten. Stellen Sie sicher, dass die kombinierten Strahlen in die Mitte der Scanspiegel des Laserscanning-Mikroskops geschickt werden, indem Sie ein Paar Lenkspiegel einstellen, wenn sich die Scanspiegel in der geparkten Position befinden. Verwenden Sie nach dem Kondensator ein weiteres Paar Linsen mit Brennweiten von 100 Millimetern bzw. 30 Millimetern, um den übertragenen Strahl auf die Fotodiode zu leiten und sicherzustellen, dass beide Strahlen in der Fotodiode enthalten sind.
Installieren Sie dann zwei Tiefpassfilter, um den modulierten Stokes-Strahl zu blockieren. Platzieren Sie einen Strahlsampler im Stokes-Strahlpfad, um 10% des Strahls aufzunehmen, und senden Sie ihn an eine schnelle Fotodiode, um den 80-Megahertz-Pulszug zu erkennen. Nehmen Sie einen der Ausgänge des Fanout-Puffers und filtern Sie ihn mit einem Bandpassfilter, um eine 20-Megahertz-Sinuswelle zu erhalten.
Verwenden Sie dann einen HF-Dämpfungsglied, um die Ausgangsspitze bis zur Spitzenspannung auf etwa 500 Millivolt einzustellen. Senden Sie den resultierenden Ausgang an einen Phasenschieber, der eine Feineinstellung der HF-Phase mit einer Spannungsquelle ermöglicht. Senden Sie diesen Ausgang an einen HF-Leistungsverstärker und schließen Sie den Ausgang des Verstärkers an die EOM an.
Nachdem Sie den Stokes-Strahl entsperrt haben, optimieren Sie die Modulationstiefe des ersten EOM, indem Sie eine Fotodiode im Strahlweg platzieren. Stellen Sie die EOM-Spannung und die Viertelwellenplatte so lange ein, bis die Modulationstiefe zufriedenstellend erscheint. Platzieren Sie eine Fotodiode nach dem dichroitischen Spiegel, um den Laserstrahl zu erkennen.
Blockieren Sie zuerst den Stokes-Strahl und zoomen Sie dann auf einen der Pumpimpulsspitzen des Oszilloskops. Platzieren Sie einen vertikalen Cursor, um die zeitliche Position dieses Peaks mit dem Oszilloskop zu markieren. Blockieren Sie nun den Pumpenstrahl und entsperren Sie den Stokes-Balken.
Übersetzen Sie die Verzögerungsstufe so, dass die Spitzenpositionen auf dem Oszilloskop vorübergehend an die markierte Position im vorherigen Schritt angepasst werden. Durch Berechnung der Verzögerungsentfernung, die erforderlich ist, um die beiden Strahlen anzupassen, gefolgt von der Verlängerung des Balkenpfads des schnelleren Strahls oder der Verkürzung des Strahlwegs des langsameren Strahls. Als nächstes bereiten Sie eine Objektträgerprobe mit DMSO und doppelseitigem Klebeband als Abstandshalter vor, um die Probe zwischen dem Objektträger und einem Deckglas zu halten.
Legen Sie die Probe auf das Mikroskop, wobei die Deckglasseite dem Mikroskopobjektiv zugewandt ist, und beobachten Sie die Probe vom I-Stück unter Hellfeldbeleuchtung. Suchen Sie den Fokus der Probe sowohl an der oberen als auch an der unteren Luftblasenschicht an der Glasbandschnittstelle und verschieben Sie den Fokus zwischen die beiden Schichten des Bandes. Als nächstes stellen Sie die abstimmbare Strahlleistung auf 798 Nanometer ein.
Stellen Sie basierend auf dem optischen Durchsatz des Kondensators die optische Leistung für die Pumpe und die Stokes-Strahlen im Objektivfokus auf jeweils etwa 40 Milliwatt ein. Öffnen Sie dann das Scanbild in MATLAB und klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung Fokus, um den Scanvorgang zu starten. Stellen Sie den Lenkspiegel vor dem Galvo-Scanner so ein, dass er das DC-Signal auf dem Kanal-One-Display zentriert.
Bewegen Sie die motorisierte Verzögerungsstufe und beobachten Sie den Lock-in-Ausgang, der auf dem Display des Kanals zwei angezeigt wird, genau. Passen Sie schließlich die Zeitverzögerung an, um die AC-Signalintensität zu maximieren. Stellen Sie den dichroitischen Spiegel so ein, dass er das SRS-Signal auf dem AC-Kanal zentriert.
Stellen Sie dann die Phase des Lock-in-Verstärkers ein, um das Signal zu maximieren. Nach der Montage des Objektträgers auf das Mikroskop und Einstellen der Leistung beider Strahlen auf jeweils etwa 40 Milliwatt bei Probenfokus, wie bereits gezeigt. Öffnen Sie das Scanbild von MATLAB.
Finden Sie dann das maximale SRS-Signal, indem Sie durch die Verzögerungsstufe scannen, die dem 2.913 inversen Zentimeter Raman-Peak von DMSO entspricht. Erfassen Sie ein SRS-Bild, das dem 2.913 inversen Zentimeter Raman-Peak von DMSO entspricht. Öffnen Sie das Bild in ImageJ, und wählen Sie einen kleinen Bereich in der Mitte des Rahmens aus.
Verwenden Sie die Messfunktion, um den Mittelwert und die Standardabweichung von Werten im ausgewählten Bereich zu berechnen. Speichern Sie für die Frequenzzugangskalibrierung einen hyperspektralen Scan mit dem Verzögerungsstufenbereich, der die 2, 913 und 2.994 inversen Zentimeter Raman-Spitzen von DMSO abdeckt. Speichern Sie dann die Bühnenpositionen, die dem hyperspektralen Datensatz entsprechen.
Führen Sie eine lineare Regression für die Bühnenpositionen und Raman-Verschiebungen bei 2, 913 und 2, 994 inversen Zentimetern durch. Konvertieren Sie die Verzögerungspositionen mithilfe der linearen Regressionsgleichung in die entsprechenden Raman-Frequenzen. Für die Kalibrierung der spektralen Auflösung schätzen Sie die Tischposition basierend auf der vorherigen Position mit der erhöhten optischen Weglänge aufgrund des Einsetzens von Stäben.
Richten Sie die räumliche Überlappung der Balken aufgrund der leichten Abweichung des Balkens beim Hinzufügen von Glasstäben neu aus. Installieren Sie einen polarisierenden Strahlteiler, eine Viertelwellenplatte und eine zweite EOM in den Strahlpfad nach dem ersten EOM. Trennen Sie den Signaleingang vom zweiten EOM, schließen Sie den Signaleingang an den ersten EOM an, und schalten Sie ihn ein.
Modulieren Sie den Stokes-Strahl mit 20 Megahertz, indem Sie den Strahl durch die erste EOM senden. Passen Sie die Neigung und Position des ersten EOM an, um sicherzustellen, dass der Strahl durch den EOM-Kristall zentriert ist. Bereiten Sie eine Objektträgerprobe mit doppelseitigem Klebeband, Objektträger und Deckglas vor.
Legen Sie die Probe auf das Mikroskop, wobei die Deckglasseite dem Mikroskopobjektiv zugewandt ist. Für die Epi-Mode-SRS-Bildgebung installieren Sie eine Halbwellenplatte, bevor der Strahl in das Mikroskop eintritt, um die Polarisation des Strahls zu ändern, der in das Mikroskop eindringt. Platzieren Sie einen polarisierenden Strahlteiler über dem Objektiv, damit der depolarisierte rückreflektierte Strahl den Detektor erreichen kann.
Als nächstes verwenden Sie eine 75-Millimeter-Achromatlinse und eine 30-Millimeter-asphärische Linse, um die rückseitigen gestreuten Photonen von der hinteren Öffnung des Objektivs an den Fotodetektor weiterzuleiten. Montieren Sie den Detektor, um das vom Polarisationsstrahlteiler geleitete Streulicht zu sammeln. Installieren Sie dann einen Filter, um das Eindringen des modulierten Strahls in den Detektor zu verhindern.
Die Variation der Stablängen wirkt sich auf die spektrale Auflösung aus. Wenn keine Glaszwitscherstäbe verwendet werden, werden die beiden Raman-Peaks von DMSO überhaupt nicht aufgelöst. Eine Zunahme der Anzahl der Glaszwitscherstäbe beginnt, die beiden Spitzen an einem zufriedenstellenden Punkt aufzulösen.
Abgestimmtes Zwitschern löst beide Spitzen auf und kann verwendet werden, um die Tischpositionen auf Frequenz zu kalibrieren. Zwei zeitverzögerte Pulszüge orthogonaler Polarisation, die zur Abbildung von DMSO-Spektren verwendet werden, zeigen die Zeitverzögerung zwischen den SRS-Anregungen mit akzeptabler Modulationstiefe und zeitlicher Trennung. Im Gegensatz dazu führt eine schlechte zweifarbige SRS-Phasenverschiebung zu invertierten oder negativen Spitzen.
Hier wird eine zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit bei 2.850 und 2.930 inversen Zentimetern Ex-vivo-Hirngewebe der Maus gezeigt. Die rohen Lipid- und Proteinbilder wurden farbcodiert, um ein einziges Bild zu erzeugen, das Lipid- und Proteinbeiträge darstellt. Falsche Hämatoxylin- und Eosin-Umfärbungen wurden auch durchgeführt, um die Hämatoxylin- und Eosinfärbung für pathologische Anwendungen nachzuahmen.
Raumzeitliche Überlappung und räumliche Auflösungsoptimierung sind die wichtigsten Schritte für den räumlichen Fokussierungsansatz von SRS. Diese Methode ist allgemein für andere Pumpsondenmikroskopie-Experimente wie die transiente Absorptionsmikroskopie anwendbar. Die Methode ermöglicht auch die Bildgebung von nicht-fluoreszierenden Molekülen in Zellen und Geweben.
Die hier vorgestellte Methode beschleunigt die Bildaufnahmezeit für die zukünftige Translation der stimulierten Raman-Histologie in der Klinik.
