HINWEIS: Alle Verfahren wurden von der Lebensdauer Institutional Animal Care und Verwenden Committee und allen Tieren und Verfahren nach dem National Research Council Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren 10 genehmigt. 1. Balloon Fabrication und linksventrikulärer Drucküberwachungsschaltung <ol><li> Konstruieren LV Ballons nach Miller et al. 11 In einem Becherglas mit einem Rührstab, mischen 9,5 ml destilliertem Wasser, 14,2 ml Licht Maissirup und 33,8 g Saccharose und Hitze auf einer heißen Platte, mischen, bis sich der Zucker aufgelöst . Weiter Heizlösung, bis es etwa 150 ºC erreicht. HINWEIS: Zahlreiche Verfahren existieren, um LV Ballons einschließlich Modifikation Kondom Tipps und Frischhaltefolie 9,12 Bau zu errichten. Wir finden, das obige Verfahren relativ einfach, leckagefreie Ballons zu konstruieren, kann jedoch nur ein Vorteil der Frischhaltefolie Ballons umfasst vorherige Charakterisierung geeignete frequency-Wirkungs-Beziehungen 9. </li><li> Brechen trockene Spaghetti-Stränge in Stücke von etwa 5 cm in der Länge und tauchen einer Seite von jedem Stück ca. 1 cm tief in die Zuckerlösung und langsam entfernen. </li><li> Legen Sie die Trockenpartie der Teigstrang in eine Polystyrolschaumblock und auszusetzen, so dass die Zuckermischung tropft nach unten und bildet eine Tropfenform Schimmel. Lassen Sie O / N in einem Exsikkator so die Form aushärtet. </li><li> Am nächsten Tag tauchen die Formen in Silikon-Gel-Dispersion. Zeigen Teigstränge zurück in Styropor-Block und in aa 37 ºC Ofen für 2 Stunden oder bis trocken. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal so zwei Schichten aus Silikon aufgebracht sind. </li><li> Nach dem Trocknen in Wasser für mehrere Stunden, um die Entfernung der Ballon aus der Form zu unterstützen. Shop Luftballons in 0,02% Natriumazid-Lösung. </li><li> Verwenden Sie eine 23 G Blutsammelset eine maßgeschneiderte Ballon Kanüle durch Schneiden einer Nadel, um eine stumpfe Spitze zu erstellen und platzieren Kerben in der Nadel zu produzieren. </li><li> Verbinden Sie den Schlauch mit einer Druck transProduzent und mit Wasser spülen und dabei Schlauch und Kanüle vollständig untergetaucht, um Luft in das System zu verhindern. Legen Sie einen Ballon, der mit Wasser auf die Kanüle gefüllt worden ist und verwenden 2-0 Seidenfäden, um auf die Kanüle zu binden. Testballon durch die Fähigkeit, Druck zu halten (~ 100 mm Hg für mindestens 1 h) </li></ol> 2. Herstellung des isolierten Herzens Perfusionssystem <ol><li> Zunächst waschen und wärmen das System. Schalten Sie auf einem 37 ºC warmen Wasserbad Zirkulator, die der Langendorff-Apparatur angeschlossen ist, und füllen Pufferbehälter mit destilliertem Wasser. Schließen Sie eine neue Glasfaserfilter in die Vorrichtung fließt, um die Rohrleitung an und schalten Sie Pumpe zu spülen, das System. Während der Vorbereitungszeit, überwachen die Temperatur von Wasser aus dem Langendorff-Block mit einem Temperaturfühler ausgestoßen, um sicherzustellen, dass Wasserbad genau eingestellt. Außerdem schalten Sie einen gekühlten Umwälzpumpe und 20 ºC, die während der kardioplegischen Stillstand des Herzens verwendet wird eingestellt. </li><li> ICHn der Zwischenzeit bereiten die folgenden Lösungen. Bereiten Sie 1 l Kardioplegielösung (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM NaHCO 3) und Filter. Auch bereiten 2 l KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,7 mM MgSO 4, 2 mM Na-Pyruvat, 6 mM Dextrose, 24,9 mM NaHCO 3 (vorge belüftet mit CO 2) , 1,4 mM CaCl 2 (zuletzt zugegeben). Nach dem Auflösen zu entfernen Präzipitate durch Filtrieren in einen Kolben mit einem 5 um Glasfrittentrichter. Legen Sie einige in eine kleine Schüssel auf Eis, um während der Operation und Isolierung verwendet werden. </li><li> Oxygenieren Perfusat (KHB) und mit 95% O 2/5% CO 2 für mindestens 30 min vor der Verwendung. Perfuse Langendorff-System mit KHB um das restliche Wasser aus dem System zu entfernen und Pufferbehälter. Bei Mäusen, stellen Sie die ursprüngliche Pumpendrehzahl auf ca. 2,0 ml / min. Zeigen 2-0 und 4-0 Seidenfäden in der Nähe Perfusionskanüle. Lassen Sie die Pumpe, bis der Schlauch und eine Vorrichtung Witz gefüllth Perfusat und sorgen für die Blase strup mit Perfusat gefüllt. HINWEIS: Bei längerer Durchblutung und stabile Funktion ist es sehr empfehlenswert, um eine In-line-Glasfaserfilter (~ 1 &amp; mgr; m) in der Perfusionskreislauf installieren, um keine Niederschläge, die Blutgerinnsel im Herzen bilden könnten sammeln </li></ol> 3. Maus-Chirurgie 3.1) Maus Anästhesie und Handhabung <ol><li> Bereiten Sie Spritze mit Narkosedosis von 80 mg / kg Ketamin und 5 mg / ml Xylazin-Gemisch, und fügen Sie steriler 0,9% iger Kochsalzlösung, um die Lautstärke zu 0,2 ml bringen. Heparin spritzen IP (50 ul von 1.000 U / ml Lösung). </li><li> Bewegen Sie die Maus wieder in Transportbehälter (~ 10-20 min) und warten Sie, das Bewusstsein zu verlieren, wie Heparin wirksam wird. Von Zeit zu Zeit tun, eine Zehe Prise, um Schmerzen Reflex überwachen. </li></ol> 3.2) Entfernen Sie die Herz- <ol><li> Sobald der Maus ist komplett bewusstlos ist und nicht bis zu den Zehen Prise reagieren, sichern Sie sie auf einen geeigneten Operationstisch mit Stiften oder 25 G<html> Spritzenansätze durch den Extremitäten. Führen Sie eine Thorakotomie, um das Herz freizulegen. Geschnitten ein kleines Loch gerade unterhalb des Brustbeins und verlängern die geschnitten, um die Seiten des Maus Vermeidung der Membran. </li><li> Schnell schneiden Sie die Membran und dann schnell an den Seiten des Brustkorbs zu schneiden. Flip wieder den Brustkorb wie eine Muschel, die Brusthöhle freizulegen. Nehmen vorsichtig aus dem Herzen, platzieren Schere unter und nehmen Sie den Herz. HINWEIS: Es ist wichtig, um das Herz zu schnell zu entfernen, sobald es in der Brusthöhle ausgesetzt ist und die Lungen sind nicht funktionsfähig. </li></ol> 3.3) Reinigen Sie das Herz <ol><li> Legen Sie die Herzen in die Schale mit eiskaltem KHB und schneiden Sie alle große Stücke von Lungengewebe befestigt. Verwenden einer Pinzette zu holen die Herzen und suchen Sie die Aorta. Drücken Sie leicht die Herzen und suchen Sie nach jeder Blut, das angezeigt wird, da dies sollte das offene Ende der Aorta können. Verwenden Sie feine Spitze Pinzette, um das Herz von dem offenen Ende der Aorta zu halten. </li></ol>e &quot;&gt; 4. Montage des Herz, Starten Perfusion und Platzieren der Ballon 4.1) Montage und Kanülierung der Herz <ol><li> Vor dem Transport des Herzens auf die Langendorff-Apparatur, schalten Sie die Pumpe dafür, dass die Perfusion Druck niedrig (~ 20 mmHg). Halten Sie die Herzen durch die Aorta knapp die Kanüle. Mit einem anderen Satz von feine Spitze Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Aorta und schieben Herz bis auf die Kanüle. Halten Sie es fest mit einem Satz Pinzette und dann mit einem weichen Kanten Clip vorübergehend befestigen Sie sie Kanüle. HINWEIS: Schnell Montage des Herzens auf die Perfusionskanüle ist entscheidend für eine gute Vorbereitung. Mit Erfahrung, sollten die Verfahren Öffnen der Brusthöhle, bis die Montage des Herzens von zwischen 1 und 2 min zu nehmen. </li><li> Krawatte und initiieren Perfusion wie folgt, mit 4-0 Seidennaht sichere Aorta an die Kanüle direkt unter dem Clip. Stellen Sie sicher, das Band ist ebenfalls rund um die Metall Aortenkanüle, so die Aorta nicht off beim Anziehen gebunden bekommender Knoten. Sobald eine Bindung ist fest gelegt, entfernen Sie den Clip. </li><li> Verwenden Sie zusätzliche Seidenfäden, die Aorta sicher an der Kanüle und achten Sie auf binden Sie unterhalb jedes Schiff, Zweige, die aus der Aorta kommen kann befestigen. Diese können oft durch Perfusat undicht oder aus der Aufnahme von der Aorta beobachtet werden. HINWEIS: Während der Anfangsphase der Durchblutung der Blut sollte aus dem Herzen Waschen und das gesamte Herz sollte eine weiche rosa Farbe. Dunkle Verfärbungen, die nicht waschen out anzuzeigen ischämischen Gebiete, die voraussichtlich aufgrund von Luftembolien oder Blutgerinnsel und Herzen sollten nicht verwendet werden. </li></ol> 4.2) Festlegung Perfusion und LVP Measurement <ol><li> Erhöhen Sie langsam die Perfusionsdruck und Pumpendrehzahl erhöhen, bis der Perfusionsdruck 70 mmHg erreicht. HINWEIS: Standard Perfusionsdrücken für Maus Perfusion 70-90 mmHg, aber konstant von Tier zu Tier innerhalb eines Experiments gehalten werden. </li><li> Reinigen Sie das verbleibende Gewebe (Lunge, Schilddrüse usw.), Die noch an das Herz befestigt werden kann. Mit einer Schere, um eine Öffnung in der linken Herzkammer zu erstellen schneiden Sie die linken Vorhof. </li><li> Setzen Sie den Ballon auf den Halter und zu entleeren. Positionieren Sie den Ballon in der Nähe der Kanüle Aortenkanüle, direkt über der Öffnung in der linken Herzkammer. Ballon vorsichtig nach unten legen Sie in den linken Ventrikel, während das Herz in Position halten, so dass die Aorta nicht reißt. </li><li> Sobald es in Kraft ist, langsam zu beginnen, um den Ballon aufzublasen, bis die LVEDP erreicht ~ 8 mmHg. Platzieren des Temperaturfühlers gegen die Unterseite des Herzens, damit er die Temperatur des Abgases misst. </li></ol> 4.3) Basal Measurement <ol><li> Dichten Sie das Herz in einem Wassermantel Perfusionskammer. Während dieser Zeit kontinuierlich durchströmen das Herz mit KHB, und sicherzustellen, dass die Temperatur weiter steigt. Überwachen Sie die Temperatur und stellen Sie das Wasserbad entsprechend, bis es etwa ~ 37 ° C erreicht. HINWEIS: Überwachung temperature in den Anfangsphasen der Perfusion ist kritisch, da koronaren fließt und anschließend Temperatur kann von Herz zu Herz variieren. Temperatur des Abgases Perfusat für gewünschte myokardialen Temperatur über einen Temperaturfühler an der Spitze des Herzens platziert überwacht. Darüber hinaus im Vergleich zu anderen Langendorff-Perfusion Protokollen das Herz nicht in CP oder KHB während der Perfusion oder Arrest untergetaucht ist diese hauptsächlich durchgeführt, um schnell Temperatur einzustellen sowie effiziente CP Lieferung ohne Diffusion. </li><li> Beginnen Sie zur ständigen Aufzeichnung Funktionsmessung mit einem Datenerfassungssystem an die entsprechenden Sensoren angeschlossen, darunter Perfusionsdruck, linksventrikuläre Druck (Druckwandler zum LVP Ballon befestigt), Temperatur und elektrophysiologischer Parameter (EKG, MAP falls vorhanden) (Anlage werden nach Herstellung und spezifisch für den einzelnen Sensoren und Datenerfassungssystem). Sobald das Abwasser KHB erreicht ~ 37 ºC für mindestens 15<html> min und Herzfunktionsparameter sind stabil, notieren Sie die Zeit für die Baseline-Messungen. HINWEIS: Ein- / Ausschlusskriterien werden für jeden Herz angewendet. A LVDP von &lt;60 mmHg zu Beginn der Studie zeigt, ein Herz, das von der Analyse entfernt werden sollte. Außerdem Koronarfluss&gt; 4,5 ml / min, oder der Unfähigkeit, Perfusionsdruck zu Studienbeginn zu halten wahrscheinlich zeigt eine undichte oder zerrissen Aorta. Auch alle Herzen, die klare ischämische Bereiche, die visuell bestätigt werden kann (dh Blutgerinnsel) oder Ausstellungs Ischämie-assoziierten Senkung der Herzfunktion (dh Erhöhung LVEDP, extrem arrhythmic) haben, werden aus der Analyse entfernt. </li><li> Messen Koronarfluss über Sammlung des koronaren Abflusses in einen Meßzylinder für 1 min. Schließen Sie die Kammer und ermöglichen Temperatur und funktionieren, um auf die Ausgangswerte zurück. Alternativ messen die koronare Fluss kontinuierlich in der Perfusion Leitung über einen Strömungssonde nach dem Druckentlastungskreis gelegt. </li></ol>&quot;&gt; 5. Initiating Kardioplegische Arrest <ol><li> Zeigen 100 ml kaltem Kardioplegie Puffer in einen anderen Behälter und. übertragen die KHB Reservoir Kanüle in die Kardioplegie-Reservoir. </li><li> Nehmen Sie den Wassermantel Gehäuse und die Perfusion Erwärmung Schaltung von der warmen Wasserbad und eine Verbindung zum Kältemaschine mit Hilfe von Schläuchen Schnellkupplungen. Verwenden Sie separate Heizung und Kühlung Umwälzpumpen starken Temperaturschwankungen des Herzens und Perfusat ermöglichen. </li><li> Befolgen Sie die Luftblase, die während der Schalter in die Rohrleitung eingeführt wird, und wenn es in der Nähe von dem isolierten Herzen erreicht starten Sie den Zeitpunkt für die Kardioplegie. Liefern Kardioplegie für 2 min. Nach der ersten Dosis die Pumpe stoppen. Stellen Sie sicher, das Herz in der Diastole zu verhaften und die Nähe zu den gewünschten CP Temperatur. ANMERKUNG: Eine ausreichende Blasenfalle ist notwendig, um Luftembolien im Herzen zu vermeiden. Alternativ kann ein Abgabesystem für beide Reservoirs durch einen Absperrhahn schaltet leicht konstruiert werden, aber wir finden, folgening die kleine Luftblase, die eingeführt wird, wenn Vertauschen der Kanüle zwischen Stauseen, eine einfache Methode der Zeit CP Lieferung gegeben potenziell unterschiedlichen Pumpendrehzahlen zwischen den Experimenten (dh aufgrund von Maus / Ratte, Perfusionsdruck, Filterwiderstand, etc.) </li><li> Halten Sie das Herz in Kardioplegie für 2 Stunden bei ~ 20 ° C. Jede halbe Stunde während der CP schalten Sie die Pumpe wieder auf 1 min, so eine weitere Dosis verabreicht wird. HINWEIS: Intermittent Dosen von CP alle 30 min führt zu Funktionsstörungen des Herzens, ohne Nekrose des Gewebes. Längere Zeiträume zwischen Dosen von CP (dh&gt; 45 min) kann in Nekrose und ischämischen Kontraktur führen und mehr für ein Modell der nekrotischen Schädigung mit ungeschützten Ischämie geeignet. </li></ol> 6. Reperfusion <ol><li> Am Ende des CP, überweisen Sie den Behälter Kanüle zurück in die sauerstoffreiches KHB. Schließen Sie die Temperaturregelkreise auf die Heizungspumpe und schalten Sie die Pumpeauf der Reperfusion zu starten. An diesem Punkt der Kardioplegie wäscht, beachten Sie den Temperaturanstieg und das Herz beginnt nach 2-4 min der Reperfusion wieder zu schlagen. Wenn das Herz beginnt der Herzschlag langsam und oft arrhythmischen. Hinweis: Es ist in der Regel nicht ein großer Anstieg der diastolischen LVP (dh ≤10 mmHg Anstieg), die oft in charakteristischen pure Ischämie-Modellen ist. Herzrhythmusstörungen können auch in der Reperfusion bestehen und gelegentlich das Herz muss defibrilliert werden. Dies kann mit der Verwendung eines Stimulators Satz zu höheren Spannungen (~ 10-50 V) und Elektroden, die an der Basis und dem Apex des Herzens platziert erreicht werden. </li><li> Ermöglichen das Herz für 30 min reperfuse, und während dieser Zeit nehmen Koronarfluss Messungen notwendig. Messen Sie Koronarfluss durch Sammeln des Abwassers mit einem Messzylinder für 30-60 sec. </li></ol> 7. Sammeln des Gewebes <ol><li> Die Luft aus dem Ballon und entfernen Sie sie aus der linken Herzkammer. Nehmen Sie das Herz aus derKanüle und gewogen. In anfänglichen Experimenten sollte mindestens eine Querscheibe des Herzens aufgenommen und TTC angefärbt, um Nekrose bewerten, um sicherzustellen, dass das Herz frei von nekrotischen Schädigung. </li><li> Sammeln Sie Herzen Scheiben für die Mikroskopie Studien, nass / trocken Gewichte etc. Der Rest oder ganzes Herz sollte rasch, indem in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Shop eingefroren Herzen in einem -80 ° C Tiefkühltruhe. HINWEIS: Für die Messung der energiereichen Phosphatverbindungen (dh, ATP, Kreatin-Phosphat), die Herzen sofort eingefroren werden. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Die vorhergehenden Protokolldetails Methoden zu bewerten myocardial stunning sekundär zu einer globalen Ischämie mit kardioplegischen Stillstand. In unseren Händen dieses Protokoll erzeugt eine ungefähre ~ 40% ige Reduktion der Herzfunktion (LVDP, +/- dP / dt) mit minimalen Veränderungen der Herzfrequenz an der 30 min nach der Reperfusion Zeitpunkt. Da das Herz perfundiert und wiedererwärmt alle Parameter der Herzfunktion bei Anfangszeitpunkte mit einem stark reduzierten Herzfrequenz vor Stabilität zwischen 20 un...

Myocardial atemberaubenden wird als reversibel reduziert kontraktile Aktivität trotz Wiederherstellung der ausreichende Durchblutung nach einer kurzen Zeit der Ischämie, längere Zeiträume mit ischämischen Herzschutz 1.2.3.4.5 definiert. Das vorgestellte Verfahren ist speziell zur klinisch relevanten ischämischen Insulten, die in reversible Beeinträchtigungen in der Kontraktionsfunktion führen kann, zu modellieren (dh mit ischämischen Herzchirurgie Verwendung kardioplegischen Stillstand, kurze Zeiträume von Ischämie, Angina, usw. zugeordnet). Im Gegensatz zu schweren Ischämie Studien (Myokardinfarkt, Nekrose) wurde dieses Protokoll entwickelt, um myocardial funktionelle Erholung und Herzschutz ohne Gewebeverletzung, Umbau, und Zelltod zu bewerten. Die Mehrzahl der Papier diskutiert ein Standard kardioplegischen Still Protokoll ähnlich einem Herzchirurgie mit Hypothermie und intermittierende Anlieferung Kardioplegielösung Elemente. Myocardial protBiegung während des Großteils Herzoperationen beruht auf Kardioplegie und kardiopulmonalen Bypass. Obwohl Kardioplegie (CP) Lösungen und Strategien sehr unterschiedlich (Blut, kristalloiden, kalt, warm etc.) die häufigsten Elemente sind 1) Hyperkaliämie und / oder andere Strategien, um das Herz in der Diastole zu verhaften, wodurch Energienutzung von Herzmuskelkontraktion resultierende Begrenzung, und 2), um den Stoffwechsel zu verlangsamen Hypothermie und zur Erhaltung der ATP und andere Energiereserven während verhaftet. Aktuelle Kardioplegie-Lösungen bieten Schutz für das Herz gegen ischämischen Insulten, die das Gegenteil beweisen tödlich wäre. , Kardioprotektive Strategien bei chirurgischen ischämischen sind jedoch nicht perfekt, und die sich ergebende mild ischämischer Verletzung kann in reversible Herzkontraktionsstörung trotz ausreichender Blutfluss zur Folge haben (myokardiale Betäubung), Azidose, Herzmuskelschäden und Gefäßwirkungen wie reduzierte Koronarperfusion und Vasospasmus. Dieses Protokoll unterscheidetvon Standard-isolierten Herz Ischämiemodellen Auswertung Herzinfarkt und schwere Ischämie, dass es wertet milder ischämischen Insulten, die zu einer Beeinträchtigung der Herzfunktion folgende kurze Ischämie oder ischämischen Insulten mit kardioplegischen Stillstand führen kann. (Für einen Überblick über Langendorff-Perfusion Techniken und I / R Studien siehe 6-8). Allgemeine Richtlinien und eine gründliche Analyse der mit der Maus isoliert perfundierten Herzen zugehörigen Versuchsparameter siehe Sutherland e t al. 2003 9 Die hier vorgestellte Technik Details die notwendige Ausrüstung, Reagenzien, Schritte, Strategien und Tipps, um zuverlässig zu induzieren atemberaubende in Mäuseherzen. Geringfügige Änderungen erforderlich, um die Technik an Ratten anzuwenden. Kurz isolierten Maus Herzen nach Langendorff für ca. 30 min bei physiologischen Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) über Abgabe eines Hyperkaliämische HYPOTHERM perfundiert, durch Kälte geschützt Herzstillstand, gefolgtic Kardioplegielösung. Nach der Festnahme wird Herz funktionelle Erholung bei Wiedererwärmung und Reperfusion des Herzens mit KHB überwacht. Veränderungen im Grad der Erholung der Herzkontraktionsfunktion bewertet werden können, um kardioprotektive Mittel und unterschiedliche Kardioprotektion Strategien geprüft.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Cardioplegia Solution (St Thomas II)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Symbol / Concentrations (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 110</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgCL2; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Krebs-Heinslet Buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 118</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 4.8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgSO4; 1.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 24.9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Phosphate (monobasic)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KH2PO4; 1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Pyruvate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Na pyruvate; 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>C6H12O6; 6</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Balloon reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corn Syrup</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spaghetti</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon Dispersion Gel</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >styrofoam block</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lab oven/incubator ( 50C)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Langendorff Perfusion equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heated water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cooling water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Perfusion pump capable of 2-30 ml/min</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inline perfusion filters - 1 um glass fiber</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small graduated cylinder (~10 mL)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)</td>
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			<td >perfusion resevoir (1L)</td>
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			<td >cardioplegia resevoir (~200 mL)</td>
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			<td >gas bubbler</td>
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			<td >95/5 O2/CO2 mix</td>
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			<td >Surgical tools and reagents</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td >Metzenbaum and Potz surgical scissors</td>
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		<tr >
			<td >two Dumont size 5 forceps</td>
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		</tr>
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			<td >ketamine</td>
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			<td >xylazine</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >heparin</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td >small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silk 2-0 and 4-0 sutures</td>
			<td ></td>
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			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest

Das folgende Protokoll ist von Nutzen, um Herzfunktionsstörungen oder Herzmuskel atemberaubenden folgenden moderate ischämischen Insulten zu bewerten. Die Technik ist nützlich für die Modellierung von ischämischer Verletzung mit zahlreichen klinisch relevanten Phänomen einschließlich Herzchirurgie mit kardioplegischen Stillstand und Herz-Lungen, off-pump CABG, Transplantation, Angina, kurze Ischämie, etc verbunden. Das Protokoll stellt eine allgemeine Methode, um hypo hyperkaliämische kardioplegischen Stillstand und Reperfusion in Nagerherzen mit Schwerpunkt auf der Messung der Herzmuskelkontraktionsfunktion zu modellieren. In Kürze wird eine Maus Herz in Langendorff-Modus durchströmt, mit einem intraventrikulären Ballon instrumentiert, und Baseline Herzfunktionsparameter werden aufgezeichnet. Nach Stabilisierung, das Herz ist dann einer Infusion einer kardioprotektiven hypo Kardioplegielösung kurz zu diastolischen Verhaftung zu initiieren. Kardioplegie intermittierend über 2 h zugeführt. Das Herz wird dann reperfundiert und warmed auf Normothermie Temperaturen und Wiederherstellung der myokardialen Funktion überwacht wird. Verwendung dieses Protokolls ergibt zuverlässige deprimiert Herzkontraktionsfunktion frei von Brutto myokardialen Gewebeschäden bei Nagern.

Abbildung 1 zeigt typische Ergebnisse von einem Maus-Experiment. LVP (rote Linie), dP / dt (grüne Linie) und Temperatur (lila Linie) wurden continusouly über ~ 3 Stunden aufgezeichnet. Buchstaben geben a - Baseline-Messung, b, c, d, e - Lieferung von Kardioplegielösung, f - Start der Reperfusion, g, h, i, j - Messung der cornary Fluss während der Reperfusion. Hinweis, deprimiert LVDP und dP / dt nach Reperfusion im Vergleich zum Ausgangswert. 1B enthält die Daten von einem überzei...

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Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murine isolierten Herzmodell Myocardial Stunning Verbunden mit Kardioplegische Arrest

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

murine-isolated-heart-model-myocardial-stunning-associated-with

Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K Aufrufe.  Brown University. The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Serie: Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. After isolation and retrograde perfusion of the heart according to the Langendorff technique, the heart is inverted into an upside-down position and is mechanically stabilized by a balloon catheter inserted into the left ventricle. Then, a thin latex cap &#8211; previously cast to match the average size of the rat heart &#8211; is placed over the epicardial surface. The outlet of the latex cap is connected to silicon tubing, with the distal opening 10 cm below the base level of the heart, creating slight suction. CT continuously produced on the epicardial surface is collected in ice-cooled vials for further analysis. The rate of CT formation ranged from 17 to 147 &#181;L/min (n = 14) in control and infarcted hearts, which represents 0.1-1% of the coronary venous effluent perfusate. Proteomic analysis and high performance liquid chromatography (HPLC) revealed that the collected CT contains a wide spectrum of proteins and purinergic metabolites.

This protocol describes a method to collect cardiac interstitial fluid from the isolated, perfused rat heart. To physically separate interstitial transudate from coronary venous effluent perfusate, the Langendorff perfused heart is inverted, and the transudate (interstitial fluid) formed on the cardiac surface is collected using a soft latex cap.

Das invertierte Herzmodell für interstitielle Transudat-Sammlung aus dem isolierten Rattenherz

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major causes of mortality and morbidity around the world. Cell-based therapies for cardiac repair and improvement of left ventricular function after MI have attracted considerable attention. Accordingly, the safety and efficacy of these cell transplantations should be tested in a preclinical large animal model of HF prior to clinical use. Pigs are widely used for cardiovascular disease research due to their similarity to humans in terms of heart size and coronary anatomy. Therefore, we sought to present an effective protocol for the establishment of a porcine chronic HF model using closed-chest coronary balloon occlusion of the left circumflex artery (LCX), followed by rapid ventricular pacing induced with pacemaker implantation. Eight weeks later, the stem cells were administered by intramyocardial injection in the peri-infarct area. Then the infarct size, cell survival, and left ventricular function (including echocardiography, hemodynamic parameters, and electrophysiology) were evaluated. This study helps establish a stable preclinical large animal HF model for stem cell treatment.

We sought to establish a swine model of heart failure induced by left circumflex artery blockage and rapid pacing to test the effect and safety of intramyocardial administration of stem cells for cell-based therapies.

Erstellung eines Schweinemodells für postmyokarde Infarkt-Herzinsuffizienz für die Stammzellbehandlung

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization and cardiovascular drugs, a significant proportion of patients develop pathological left-ventricular remodeling and progressive heart failure following MI. Therefore, new therapeutic options, such as cellular and gene therapies, among others, have been developed to repair and regenerate injured myocardium. In this context, animal models of MI are crucial in exploring the safety and efficacy of these experimental therapies before clinical translation. Large animal models such as swine are preferred over smaller ones due to the high similarity of swine and human hearts in terms of coronary artery anatomy, cardiac kinetics, and the post-MI healing process. Here, we aimed to describe an MI model in pig by permanent coil deployment. Briefly, it comprises a percutaneous selective coronary artery cannulation through retrograde femoral access. Following coronary angiography, the coil is deployed at the target branch under fluoroscopic guidance. Finally, complete occlusion is confirmed by repeated coronary angiography. This approach is feasible, highly reproducible, and emulates the pathogenesis of human non-revascularized MI, avoiding the traditional open-chest surgery and the subsequent postoperative inflammation. Depending on the time of follow-up, the technique is suitable for acute, sub-acute, or chronic MI models.

Myocardial infarction (MI) animal models that emulate the natural process of the disease in humans are crucial to understanding pathophysiological mechanisms and testing the safety and efficacy of new emergent therapies. Here, we describe an MI swine model created by deploying a percutaneous embolization coil.

Myokardinfarkt durch perkutane Embolisationsspulenentfaltung in einem Schweinemodell

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...