Diese Arbeit wurde von der Graduiertenschule &quot;Inflammation und Regeneration&quot; des Sonderforschungsbereich 841 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), durch den Sonderforschungsbereich 877 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) unterstützt , von der Werner Otto Stiftung (Peter Bannas), von der Wilhelm Sander-Stiftung (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag und Friedrich Koch-Nolte). Wir danken dem Universitäts Krebscentrum Hamburg (UCCH) In-vivo-Optical Imaging Core Facility und das Personal an UKE für die Konsultation und ihre qualitativ hochwertigen Service. Die Core Facility wurde zum Teil durch Zuschüsse von der Deutschen Krebshilfe (Deutsche Krebshilfe) unterstützt.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit internationalen Leitlinien für die ethische Nutzung von Tieren durchgeführt und wurden von der lokalen Tierschutzkommission des Universitätsklinikum Hamburg zugelassen. 1. Vorbereitung der Tumorzellen, Mäuse und -Antikörper-Konstrukten <ol><li> Vorbereitung der Lymphomzellen und Aliquotierung Keller Matrix (Matrigel). <ol><li> Am Tag vor der Injektion von Tumorzellen stellen eine sterilisierte Spitze Box (1000 ul Tipps) und die entsprechende Pipette in -20 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Tauen Sie die Flasche mit dem Keller Matrix auf Eis in der 4 ° C Kühlschrank O / N. </li><li> Am Tag der Injektion füllen einen Eiskübel und platzieren Sie den Keller Matrix zusammen mit Pipette, Spitzen und 1 ml Spritzen mit 30 G Nadeln auf Eis. </li><li> Aliquot Lymphomzellen in einem Volumen von 100 ul RPMI-Medium in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und sorgfältig mischen mit 100 ul Keller Matrix. Erstellen Sie in vorgekühltSpritzen und auf Eis gelegt, bis der Injektion. HINWEIS: Verwenden Sie gute steriler Technik und auf Eis zu arbeiten die ganze Zeit, um ein Verstopfen der Keller Matrix zu verhindern. </li></ol></li><li> Mäuse Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie 8-10 Wochen alten athymischen Nacktmäusen (NMRI- Foxn1 n u). </li><li> Zur Reduzierung der Autofluoreszenz des Darms zu halten Mäuse auf einem Luzerne-freie Diät für 1 Woche vor der in-vivo-Bildgebung. </li><li> Injektionslymphomzellen anästhesieren Mäuse mit 2% Isofluran in einer Induktionskammer zu bewirken. Pflegen 1-2% Isofluran für die Dauer des Verfahrens unter Verwendung eines Isofluoran vielfältig. </li><li> Spritzen Sie Lymphom-Zellen subkutan in die Schulter Flanken. Für die direkte intraindividuellen Vergleich zu injizieren Antigen-positive und Antigen-negative Zellen auf der rechten und linken Seite verbunden. <ol><li> Verwenden Sie einen Daumen und Zeigefinger, um die Haut der Maus kneifen und ziehen Sie sie aus dem Körper der Maus. Injizieren Sie langsam und gleichmäßig inder Beutel, die durch die Finger, die Schaffung eines einzigen Cluster von Zellen unter der Haut. Der Keller Matrix hilft halten injizierten Zellen vorhanden. </li></ol></li></ol></li><li> Herstellung von Antikörper-Konstrukte <ol><li> Beschriften monoklonalen Antikörpern und Einzeldomänen-Nanobodies mit einem handelsüblichen Protein Labeling Kit zum Fluoreszenzfarbstoff AlexaFluor-680 (AF680) (Anregungswellenlänge = 679 nm, Emissionswellenlänge = 702 nm) nach der Anleitung des Herstellers. Berechnen Sie die Anzahl der Farbstoffe pro Nanokörper und herkömmliche Antikörper mit molaren Extinktionskoeffizienten von 15.720 mol -1 cm -1 und 203.000 mol -1 cm -1. Beurteilen Sie die Reinheit der Antikörperkonstrukte durch SDS-PAGE Größenfraktionierung und Coomassie-Brilliantblau-Färbung. </li><li> Stellen Sie sicher, die Spezifität der markierten Konjugate durch die Durchführung einer Reihe von in-vitro-Experimenten vor den eigentlichen Bildgebungsstudien. Testen Sie die Spezifität der gekennzeichnetentibody Konstrukte in vitro durch blockierende Studien und unspezifische Isotypkontrollen 8,20. HINWEIS: In Schritt 1.2.4 Zellzahlen für Antigen-negative und Antigen-positive Zellen (oder verschiedenen Zelllinien) können nach unterschiedlichen Wachstumsraten angepasst werden. Für diese Experimente wurden 0,5x10 6 DC27.10 ARTC2 negativ und 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 positiven Zellen verwendet werden, um Tumoren ähnlicher Grße zu erhalten. In Schritt 1.3.1 das Verfahren der Kennzeichnung und Kennzeichnung Wirksamkeit von Antikörper-Sonden mit Fluorophoren kann durch die Markierungs-Kits verwendet werden, unterscheiden. </li></ol></li></ol> 2. In Vivo Imaging <ol><li> Nach 7-9 Tagen, wenn die Tumore ~ ​​8 mm Durchmesser zu erreichen, zu injizieren 50 ug AlexaFluor680 markierten Antikörper-Konstrukte in einem Volumen von 200 &amp; mgr; l Kochsalzlösung, intravenös in die Schwanzvene der Maus (mAb-AF680: 50 ug mit 2 Farbstoffe / Molekül ≈ ~ 4 ^ 14 Fluorochrome ≈ ~ 0,8 &amp; mgr; g Fluorochrome; Nanobody-AF680: 50 μg mit 0,3 Farbstoffe / Molekül ≈ ~ 5,6 ^ 14 Fluorochrome ≈ ~ 1,1 &amp; mgr; g Fluorochrome). </li><li> Initialisieren des Abbildungssystems und betäuben Mäusen mit 3% Isofluran Verwendung eines XGI-8 Anästhesiesystem in der Induktionskammer vor der Bilderzeugung zu bewirken. Pflegen 1-2% Isofluran für die Dauer der bildgebenden Verfahren unter Verwendung der Isofluran Verteiler in der Abbildungskammer aufgenommen. <ol><li> Position Mäuse auf beheizten Abbildungsstufe mit Tumoren auf die Kamera gerichtet ist. Überwachen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Kneifen der Zehe oder Schwanz des Tieres; eine Reaktion des Tieres zeigt an, dass der Anästhesie ist zu hell. </li><li> Überwachen Sie die Atemfrequenz; die Anästhesie ist zu hell, wenn die Atemfrequenz erhöht und zu tief, wenn die Atemfrequenz verringert, tief oder unregelmäßig. Schützen Sie Tier Hornhaut mit einer Augensalbe zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li></ol></li><li> Wählen Fluoreszenzfiltersätze von 615 bis 665 nm zur Anregung, 695 bis 770 nm für Emission, und von 580 bis 610 nm Anregung für Hintergrund-Subtraktion mit einem 51 2x 512 Pixel-Matrix-Größe. Stellen Sie die Belichtungszeit, um die automatische, Pixel-Binning für mittlere und F / Stopp, um 2. HINWEIS: Kürzere Belichtungszeiten ermöglichen eine schnellere Bildraten; längere Belichtungszeiten liefern eine höhere Empfindlichkeit. Binning steuert die Pixelgröße auf dem CCD-Kamera. Die Erhöhung der Binning erhöht die Pixelgröße, Empfindlichkeit und Bildrate, sondern reduziert die räumliche Auflösung. F / Stop setzt die Größe der Kamera Blende. Die Blendenöffnung steuert die Lichtmenge festgestellt und die Tiefe der field.Note, die Einstellungen können durch bildgebende Gerät und Versuchsaufbau abweichen. Wenden Sie sich im Handbuch des Herstellers für optimale Ergebnisse. <ol><li> In der Bildverarbeitungssoftware zu optimieren Belichtungszeit, F / Stop und die Pixel-Binning, bezogen auf das Expressionsniveau der Zelllinie. Änderung dieser Einstellungen jederzeit während eines Experiments ohne Einfluss auf den quantitativen Ergebnisses. Alternativ lassen Sie die Imaging-Assistenten Software automatisch ermittelndie Parameter. </li></ol></li><li> Bild Mäuse vor der Injektion und 6 Stunden nach der Injektion des Antikörperkonstrukte. HINWEIS: Die Kennzeichnung Wirksamkeit kann die erforderliche Dosis für optimale Bildergebnisse benötigt beeinflussen. Deshalb ist die Menge des erforderlichen Antikörper-Konstrukt für eine optimale Bildergebnisse muss empirisch ermittelt werden. Es kann je nach Kennzeichnung Wirksamkeit und Größe des Konstruktes sowie die Tumormodell und dem Soll-Antigen-Expression variieren. </li></ol> 3. Ernte und Herstellung von Tumoren <ol><li> Füllt ein Eisbehälter und Zeit 4% Paraformaldehyd (PFA) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) / Proteaseinhibitor (AEBSF), und PBS / 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) auf Eis. </li><li> Sobald die Abbildungssitzung beendet ist, erhöht die Konzentration von Isofluran zu 4%. Nach dem Tier nicht mehr atmen, nehmen Sie es von der Bildphase und führen Genickbruch. </li><li> Montieren Sie die Maus auf einem Styropor-Block und Spray mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Scherens und einer Pinzette, um die Außenhaut geschnitten und ziehen Sie sie vorsichtig zurück, um Tumore aus. Tumoren entfernen mit Skalpell, um sicherzustellen, Tumorgewebe erhalten bleibt. </li><li> Cut-Tumoren in der Hälfte mit einem Skalpell. Platzieren Sie die Hälfte in einem Sammelrohr mit PBS / AEBSF für FACS-Analysen und die andere Hälfte in einem 50-ml-Tube mit 4% PFA für die Immunhistochemie. </li><li> Vorbereitung für die Immunhistochemie <ol><li> Halten Tumoren in 4% PFA im Kühlschrank bei 4 ° C für 24 Stunden. Übertragen Tumoren zu einer Röhre mit PBS / 30% Saccharose und in den Kühlschrank bei 4 ° C, bis der Tumor sinkt auf den Boden des Röhrchens. </li><li> Schneiden Sie die Tumoren in geeignete Stücke für die cryomolds. Setzen Sie die Tumoren in cryomolds füllen und mit OCT-Verbindung, so dass die Tumoren sind abgedeckt. </li><li> Setzen Formen auf Trockeneis und warten Sie, bis die Verbindung vollständig gefroren ist. Übertragen gefrorenen Tumoren bis -80 ° C Gefrierschrank und speichern für die Immunhistochemie. </li><li> Cut froren Tumoren in Abschnitte von 8 um mit einem Mikrotom. Verwenden Sie Standard-immunhistochemischeChemie-Protokoll, um mit Antikörper gegen CD31-AF488 Fleck auf Blutgefäße und Diamidino-Phenylindol (DAPI) zu visualisieren, um Kerne zu visualisieren. HINWEIS: Tumorschnitte sind sehr lichtempfindlich sind, wie sie fluoreszierend markierten Antikörper enthalten bereits. Minimieren Exposition so weit wie möglich zu beleuchten. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die FACS-Analyse <ol><li> Zeigen Petrischale auf Eis, und entfernen Sie den Kolben aus einer 2,0-ml-Spritze. Setzen Sie den Tumor in der Zellsieb und schneiden Sie sie vorsichtig in 3-4 Stücke mit einem Skalpell. Gießen Sie den ersten PBS in der Petrischale und verwenden Sie das flache Ende des Kolbens, um den Tumor in der Zelle Sieb pürieren. </li><li> Spülen Sie die Zelle Sieb mit der ersten PBS zu waschen alle Zellen mit einer 10 ml Pipette. Übertragen Zellsuspension in ein neues Röhrchen und Schleudern bei 500 × g für 5 min. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren in 10 ml PBS / 0,2% BSA. Zählen von Zellen. </li><li> Aliquot 1-5 x 10 6 Zellen-Lymphom in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Spin-Zellen wieder (500· g), Überstand verwerfen und resuspendieren in 100 ul PBS / 0,2% BSA. </li><li> Optional Block FcR Verwendung eines Anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2), die an Fc &amp; ggr; für 10 min auf Eis bindet. Wash-Zellen einmal mit PBS / 0,2% BSA. </li><li> Fügen Sie anti-CD45-mAb an Leukozyten von anderen Zellen unterscheiden. Inkubieren für 20 min auf Eis im Dunkeln, gefolgt von zwei Waschschritten mit PBS / 0,2% BSA. </li><li> Kurz vor der FACS-Analyse mit Propidiumiodid-Färbung für 15 Minuten auf Eis, um tote Zellen, gefolgt von zwei Waschschritten mit PBS-Ebene zu erkennen. Resuspendieren in 150 &amp; mgr; l für die FACS-Analyse. HINWEIS: In Schritt 3.7.4 und Schritt 3.7.5 andere Antikörper kann in Abhängigkeit von der Tumorart verwendet werden. </li></ol></li></ol> 4. FACS-Analyse <ol><li> Verwenden Sie eine Reihe von Tools zur Gating Tor der Bevölkerung von Interesse in Form von großen Streuung, Wams Diskriminierung, Ausgrenzung von abgestorbenen Zellen, Gating für CD45-positive Zellen und Gating-Antigen-positiven Zellen. <ol><li> Zunächst Tor aus ZellAblagerungen in einer Vorwärtsstreuung (FSC-A) im Vergleich zu Seitenstreulicht (SSC-A) mit einem Zwei-Parameter-Plot. Nächste Ablagezelle Dubletten. Schließlich Tor aus nicht CD45-Antigen-positiven (CD45) und Toten / sterbenden Zellen (LD - Live / Dead-Färbung). </li></ol></li><li> Nehmen Sie Proben mit der gleichen Vorlage für alle Versuche. HINWEIS: Siehe Protokoll des Herstellers für die anwendungstechnische Beratung über den Einsatz von Hard- und Analysesoftware. </li></ol> 5. Die mikroskopische Analyse <ol><li> Analysieren Bunttumorgefrierschnitten mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Öl-Immersionslinse (40X-Objektiv). Verwenden Sie einen He-Neon 633 nm Laseranregung von AF680, einem Argon-Laser für AF488 und eine 405-Diode für DAPI. </li><li> Verarbeiten Sie die RAW-Bilddaten mit einer Software mit dem Mikroskop kompatibel. Führen Sie Hintergrund-Korrektur und Rauschfilterung, wenn nötig. Führen Sie weitere Bildeinstellungen wie zB Schneiden, Beschneiden sowie Helligkeit und Kontrast. <ol><li> Schließlich generate ein einzelnes Bild zusammengesetzte Überlagerung von allen Detektionskanäle. Stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast der einzelnen Schichten. Die zusammengesetzten Bilder werden Lokalisierung von Zellen (DAPI-Färbung, blau), die Verteilung der markierten Antikörper-Konstrukte (AF680-Flecken, rot) und Blutgefäße (AF488-fleck, grün) zu zeigen. </li></ol></li></ol> 6. In Vivo Imaging Analysis <ol><li> Öffnen von Bilddateien in Bildbearbeitungssoftware und erstellen Sie ein Overlay-Bild durch die Kombination von Foto-Bilddaten mit Fluoreszenzbilddaten. Zum Optimieren der Bildanzeige, indem Gewebeautofluoreszenz Hintergrundsignal aus der spezifischen Fluoreszenzsignals. Dies kann durch Subtraktion der mit einem Hintergrundfilter aus der mit dem Set, speziell für den Tracer Filter aufgenommenen Bildes eingestellt aufgenommenen Bildes durchgeführt werden. </li><li> Zeichnen identischen kreis Messung interessierenden Bereiche (ROI) um die Antigen-positiven Tumor und Antigen-negative Tumor. Um Hintergrundsignalintensität zu bestimmen, legen Sie eine kreisförmige ROIin einem Bereich des Tieres, wo Fluoreszenzsignal wird voraussichtlich gering sein (zB Hinterbein). <ol><li> Verwenden Sie die gleichen ROIs für alle Tiere zu allen Zeitpunkten. Für die Positionierung mit Hilfe der fotografischen Schwarz-Weiß-Bilder, um Tumorränder zu identifizieren. </li></ol></li><li> Anzeige ROI-Daten in einem Messtisch. Verwenden durchschnittliche Strahlungsleistung Daten, die eine quantitative Vergleich der Fluoreszenzsignale für die weitere statistische Analysen ermöglicht. <ol><li> Anzeige und Daten als absolute Signalintensitäten zu vergleichen oder die Berechnung des Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis mit gemessenen ROI Daten von Zielgewebe und Hintergrundgewebe. Berechnen der Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnis durch Dividieren der Tumoraufnahme Wert von dem Hintergrundwert von der Hintergliedmaße bestimmt. </li><li> Als Kontrollen wurden auch analysiert Antigen-negative und Antigen-positive Tumoren bei denselben Tieren als auch Tiere mit markiertem Isotypenkontrollen injiziert, um die Spezifität von Signalen in vivo zu beurteilen. </li></ol></li&gt; </ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice.">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li><li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography.">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li></ol>

Friedrich Koch-Nolte and Friedrich Haag receive a share of antibody and protein sales via MediGate GmbH, a wholly owned subsidiary of the University Medical Center Hamburg-Eppendorf.

Wir verwendeten im nahen Infrarot-Fluorophor markierten Nanokörper und konventioneller monoklonaler Antikörper gegen das gleiche Ziel auf Lymphomzellen gerichtet für eine multimodale Vergleich von in vivo und ex vivo-Analysen. Wir haben gezeigt, dass Nanokörper sind auch Diagnose-Tools für eine schnelle und spezifische in vivo Detektion von Lymphomen geeignet. In vivo, s + 16a 680 erlaubt einen schnellen und spezifischen Nachweis von ARTC2-positive Fremdtransplantaten. Abgesehen von der unterschiedlichen Kinetik besten Tumor Visualisierung in vivo, ein schwerwiegender Nachteil Nika102 680 war die hohe unspezifische Signal von ARTC2-negative Tumoren und unspezifische Hintergrundsignale. Ex vivo durchflusszytometrischen Analysen von dispergierten Zellen aus sezierten Tumoren zeigten keine spezifische Bindung zu ARTC2-negativen Lymphomzellen injiziert AF680-Konjugate. Ex vivo Fluoreszenz zeigte starke und nahezu homogenschiedenen Färbung von Zellen in ART2C-positive Tumorschnitte im Falle von Nanobody s + 16a, bestätigt, dass die Nanokörper konnte auch abgelegene Gebiete innerhalb des Tumors nach 6 h. Im Gegensatz dazu zeigte der monoklonale Antikörper schwächer und inhomogene Färbung von Zellen in ARTC2-positiven Tumoren nach 6 Std. Bessere Abbildungsergebnisse mit dem herkömmlichen Antikörpers kann nach 24 h oder 48 h erreicht werden (Daten nicht gezeigt). Um eine gründliche Vergleich zweier unterschiedlich großer Konstrukte auszuführen, abbild zu verschiedenen Zeitpunkten (serial-Bildgebung) durchgeführt, um die optimale Bilderzeugungszeitpunkt für jedes Konstrukt zu identifizieren. Wie bei anderen früheren Studien, die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass in vivo molekulare Bildgebung mit markierten Nanokörper ermöglicht eine schnelle und spezifische selben Tag Tumordarstellung mit hoher Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse 12-15,17-19. Umgekehrt führen herkömmliche Antikörper in niedrigen Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse und unspezifische Signale von Antigen-negativen Tumoren früh nach der Injektion aufgrund ihrer langsamen Clearance aus dem Körper. Um eine optimale Bildergebnisse mit konventionellen Antikörpern zu erhalten, bildgebenden Zeitpunkten 24 Stunden oder sogar 48 Stunden nach der Injektion werden häufig benötigt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die vorgeschlagen haben, dass konventionelle Antikörper mit bewährten therapeutischen Nutzen haben Dienstprogramm in der molekularen Bildgebung 17,19,26 begrenzt. Daher konventionellen Antikörpern könnte zu therapeutischen Zwecken nicht geeignet sein, die aufgrund ihrer langen Plasmahalbwertszeit während der Nanokörper sind zur Bildgebung und nicht geeignet, die aufgrund ihrer schnellen Clearance aus dem Kreislauf. Diese Unterschiede sind auf die Tatsache zurückzuführen, dass ein Überschuss der kleineren Nanobodies (15-17 kDa) rasch über die renale Elimination gelöscht, während über größeren konventionellen Antikörpern (150 kDa) in den Kreislauf zurückgehalten. So der große Vorteil von Nanokörpern für die molekulare Bildgebung ist die geringe Hintergrundsignal in frühen Bildzeitpunkten regardless der injizierten Dosis. Auf diese Weise können am gleichen Tag Bildgebung und konnte übersetzbar klinischen Umfeld. Umgekehrt können, müssen herkömmliche Antikörper genau titriert, um die unspezifische Hintergrundsignale zu minimieren, und gleichzeitig genügend spezifische Signal von der Zielgewebe (unveröffentlichte Daten) werden. Eine der Einschränkungen der in vivo NIRF-Bildgebungstechnik ist die geringe Eindringtiefe der Regel erlaubt nur Abbildungs ​​subkutaner aber nicht orthotope Tumormodellen. Allerdings könnte diese Einschränkung in einer experimentellen Einstellung durch die neu entwickelten tomographischen photoakustischen Techniken, die Ganzkörper-Bildgebung von lebenden Mäusen 27 ermöglichen überwunden werden. Eine weitere Einschränkung des NIRF-Bildgebungstechnik ist die Beurteilung des Gewebe Dosis verglichen mit Radionuklid-vermittelte Bildgebung. Jedoch können die Nanokörper für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung des Xenograft-Modellen und genaue quantitative Beurteilung der radioaktiv markiert werdenTracer Bioverteilung. Tatsächlich sind unsere NIRF-Abbildungsergebnisse in Übereinstimmung mit einer neueren Untersuchung, die Nanokörper und herkömmliche Antikörper für die PET-Bildgebung verglichen. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Nanobodies ermöglichen selben Tag Bildgebung mit hoher Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse 15. Nur die Markierung von Antikörperkonstrukten mit der Nah-Infrarot fluoreszierenden Farbstoff AF680 erlaubt jedoch uns umfangreiche in vitro, in vivo und ex vivo Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung Vergleich mittels Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und NIRF-Bildgebung. Aus diesem Grund und weil es nicht radioaktives, hochempfindliche, kostengünstig und verwendet vergleichsweise einfach zu produzieren gezielte Sonden treten wir die Verwendung des NIRF-Abbildungsverfahren für die Bewertung der neuen Antikörperkonstrukte in präklinischen molekularen Bildgebung.

In diesem Bericht beschreiben wir die Anwendung der im nahen Infrarot-Fluorophor-markierten Sonden für die Validierung der in vivo-Xenotransplantat-Abbildungsexperimente unter Verwendung von ex vivo Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie der sezierten Xenograft. Vergleicht man eine einzelne Domäne Nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 und einem monoklonalen Antikörper (Nika102, 150 kDa) 2,3 auf den gleichen Zielantigen für bestimmte in vivo gerichtet Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildung in einem Lymphom-Xenotransplantat-Modell. Das Zielantigen ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 als GPI-verankerten Zelloberfläche Ekto-Enzyms durch Lymphomzellen 4-9 exprimiert. Nanobodies von Kameliden abgeleiteten Schwerketten-Antikörper nur sind die kleinsten verfügbaren antigenbindende Fragmente 10,11. Mit nur ca. 15 kDa, diese kleine Antikörperfragmente löslich, sehr stabil und über die Nieren aus dem Verkehr 8,10 gelöscht. Tiese Eigenschaften machen sie besonders geeignet für die spezifische und effiziente Ausrichtung der Tumorantigene in vivo 12-20. Common Antigen Ziele verfügbaren Nanobodies sind die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR1 oder HER-1), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Typ 2 (HER-2 oder CD340), carcinoembryonales Antigen (CEA) und das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody Konjugate sind vielversprechende Werkzeuge für die Immuntherapie von Krebs und Behandlung von entzündlichen Erkrankungen 22. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Nanobodies ermöglichen höhere Tumor-zu-Hintergrund (T / B) -ratios als herkömmliche Antikörper in in vivo-Anwendungen der molekularen Bildgebung 8,17,19. Dies wird vor allem durch den relativ schlechten und langsamen Gewebepenetration von konventionellen Antikörpern, langsame Clearance aus dem Kreislauf und lange Verweildauer in Nicht-Zielgewebe 23 erläutert. Außerdem Schuß konventionellen Antikörpern führt zu unspezifische Akkumulation in Ziel-Antigen-negativen Tumoren durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) hervorgerufen worden ist 24,25. Dies bedeutet, dass höhere Dosen konventioneller Antikörper können nicht nur spezifische Signale, sondern auch nicht-spezifische Signale zu erhöhen, wodurch die maximal erreichbare Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnis. Im Gegensatz dazu eine Erhöhung der Dosis von Nano erhöht die Signale von Antigen-positiven Tumoren, aber nicht von normalen Gewebe oder Antigen-negative Tumoren (unveröffentlichte Daten). Über den Vergleich von Nanobodies und konventionellen Antikörpern beschreiben wir eine intraindividuelle Beurteilung der Antigen-positiven und -negativen Xenotransplantaten in derselben Mäuse zum direkten Vergleich der spezifischen und unspezifischen Signale aufgrund der EPR-Effekt. Die Nah-Infrarot-Fluorophor konjugierten Sonden uns erlaubt, eine einzelne Sonde in vivo und ex vivo mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging auszunutzen, Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Die Anwendung unserer Protokolle ermöglicht nichtradioaktive, hochempfindliche und kostengünstige Optimierung der in vivo molekulare Bildgebung Experimente wie Evaluierung neuer Antikörperkonstrukte für bestimmte Tumor-Targeting. Das Ziel dieses Tutorials Studie ist, die Verwendung von NIRF-Bildgebung zur Beurteilung der neuen Antikörperkonstrukte in präklinischen molekularen Bildgebung zu markieren. In diesem Protokoll wurden alle Versuche mit einem Kleintier-NIRF-Abbildungssystem durchgeführt wird, ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS) Durchflusszytometer und einem konfokalen Mikroskop.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AF680 protein labelling kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:176px;">A20172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD16/CD32-antibody</td>
			<td style="width:147px;">BioXCell</td>
			<td style="width:176px;">BE0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Anti-CD31-antibody</td>
			<td style="width:147px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-1506</td>
			<td style="width:183px;">labeled with secondary antibody with AF488</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-CD45-antibody V450</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AxioVision LE software</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">354234</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell strainer 70&#181;m</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:176px;">431751</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Molcular Probes</td>
			<td style="width:176px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">DC27.10 cells&#160;</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;">n/a</td>
			<td style="width:183px;">Other cells with different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FACS Canto II</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">www.bdbiosciences.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Flourescence mircoscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">NIH</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Alternative in vivo imaging system can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Leica LAS software</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to microscope used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Living Image software</td>
			<td style="width:147px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to imaging system used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Needles 30 G</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">305128</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Nika102-antibody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:103px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">P6148</td>
			<td style="width:183px;">Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">s+16a-nanobody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes 1ml</td>
			<td style="width:147px;">Braun</td>
			<td style="width:176px;">916 1406 V</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft nirf-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Fluoreszenzmarkierte Sonden ermöglichen die Kombination verschiedener NIRF-Bildgebungsverfahren (1A). Wir sollen, um in vivo NIRF-Abbildungsfluoreszenzmikroskopie sequentiell um fluoreszierend markierten Nanokörper und monoklonale Antikörper für die spezifische in-vivo-Bildgebung (1B) Vergleichen durchzuführen, Durchflusszytometrie und. Mäuse wurden mit 50 ug Nanokörper und monoklonale Antikörper injiziert, um die Spezifität der fluoreszierend markierten Konstrukte für die in vivo-Bildgebung zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von Antigen-positiven Tumoren mit sowohl Nanokörper und monoklonale Antikörper bei 6 Stunden nach der Injektion (Figur 2). ROI-Analysen der Antigen-positiven Tumoren zeigten eine viel höhere T / B-Verhältnis von ~ 12 für die Nanobody Vergleich zu ~ 6 für den monoklonalen Antikörper ist. Darüber hinaus zeigte die Nanokörper keine unspezifische Signal in den Antigen-negativen Tumoren, während diemonoklonale Antikörper zeigte unspezifische confounding Signale in den Antigen-negative Tumoren. Neben dem unspezifischen Signal der negativen Tumoren, der monoklonale Antikörper auch in der gesamten Tier induzierten unspezifische Hintergrundsignale. Dies ist aufgrund übermäßigen freien zirkulierenden Antikörpern, die zu groß sind, um die Nieren ausgeschieden werden, sind wahrscheinlich. Umgekehrt Tiere mit Nanokörper injiziert zeigten unspezifische Signale nur in den Nieren durch die renale Ausscheidung der kleinen Nanokörpern. Durchflusszytometrie Analysen von Tumorzellsuspensionen zeigten spezifische Markierung von Antigen-positiven Tumorzellen sowohl mit AF680-Konjugate 6 Stunden nach der Injektion. Die stärkere Fluoreszenzsignal der Nanobody markierten Zellen gegenüber monoklonalen Antikörper markierte Zellen widerspiegelt, die in vivo NIRF-Abbildungsergebnisse. Wichtig ist, dass die durchflusszytometrische Analysen zeigen, daß es keine unspezifische Markierung von antigennegativen Zellen mit einem der beidenKonstrukte (Abbildung 3). Die Fluoreszenzmikroskopie von Tumorgefrierschnitte zeigten eine starke und fast homogene Kennzeichnung von Antigen-positiven Zellen mit dem Nanobody 6 Stunden nach der Injektion. Umgekehrt zeigte der monoklonale Antikörper eine wesentlich schwächere und recht inhomogene Färbung (4A). Antigen-negative Tumoren zeigen keine Färbung 6 Stunden nach Injektion der Nanobody, während antigen-negativen Tumoren zur herkömmlichen Antikörper zeigen unspezifische Streu Färbung in dem Zwischenraum (4B) eingespritzt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Fluoreszenz-Bildgebung und Antikörperkonstrukte. (A) Bilddarstellungsaufbau zur Auswertung AF680-Konjugate: In vivo NIRF-imaging gefolgt von Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. (B </strong&gt;) Schematische Darstellung der AlexaFluor680 beschriftet Nanobody s + 16a (rot) und monoklonale Antikörper Nika102 (blau). Orange Sterne zeigen die AlexaFluor680 Fluorochrome. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: In vivo NIRF-Abbildungsbilder des Fluoreszenzsignals von Antigen-positiven (+) und Antigen-negative (-) Tumoren in Mäusen, die mit Nanobody s + 16a (A) und monoklonale Antikörper Nika102 (B) injiziert wurden. . In-vivo-Bildgebung wurde vor (0 h) und 6 h nach der Injektion durchgeführt. Signalintensitäten werden als Strahlungsleistung (p / sec / cm 2 / sr) / (&amp; mgr; W / cm 2) dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Abbildung 3:Ex vivo FACS Analysen der Zelle gebundenen Antikörperkonstrukte die aus Tumorzellsuspensionen. (A) Gating Strategie für FACS-Analysen von Tumorzellen. (B) Histogramme zeigen die Menge des intravenös injiziert AF680-konjugierten Nanobody s + 16a und Antikörper Nika102 spezifisch an die Tumorzellen in vivo gebunden. Antigen-negative Tumoren werden als ungefüllte Histogramme und Antigen-positiven Tumoren angezeigt sind als ausgefüllte Histogramme dargestellt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Abb. 4: Ex-vivo-Fluoreszenzmikroskopie (A) Übersicht Fluoreszenzmikroskopie der gesamte Antigen-positiven Tumor Kryoschnitte 6 Stunden nach der Injektion von s + 16a 680 oder Nika102 680. Signalintensitäten des in vivo intravenöszogen AF680-Konjugate ohne Sekundär-Markierungsmittel werden in rot angezeigt. Ex vivo gegengefärbt Kerne sind blau und Behälter grün dargestellt. Punktierte Linien zeigen äußeren Ränder der gesamten Tumoren. (B), Close-up der Fluoreszenzmikroskopie von Antigen-positiven und Antigen-negativen Tumoren.

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Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

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Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

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Serie: Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Forschung

Medizin

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound and aortic blood pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is raised then lowered incrementally by intravenous infusion of vasoactive drugs phenylephrine and sodium nitroprusside. Aortic diameter is measured for each pressure step to characterize the pressure-diameter relationship of the ascending aorta. Stiffness indices derived from the pressure-diameter relationship can be calculated from the data collected. Calculation of arterial compliance is described in this protocol.
This technique can be used to investigate mechanisms underlying increased aortic stiffness associated with cardiovascular disease and aging. The technique produces a physiologically relevant measure of stiffness compared to ex vivo approaches because physiological influences on aortic stiffness are incorporated in the measurement. The primary limitation of this technique is the measurement error introduced from the movement of the aorta during the cardiac cycle. This motion can be compensated by adjusting the location of the probe with the aortic movement as well as making multiple measurements of the aortic pressure-diameter relationship and expanding the experimental group size.

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.

Mess aufsteigende Aorta Steifigkeit<em&gt; In-vivo-</em&gt; In Mäuse Mit Ultraschall

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...