עבודה זו נתמכה על ידי בוגר בית הספר &#39;דלקת והתחדשות &quot;המרכז לחקר שיתופי 841 של Forschungsgemeinschaft דויטשה (אלכסנדר לנץ, ולנטין Kunick, ויליאם Fumey), על ידי מרכז המחקר המשותף של 877 Forschungsgemeinschaft דויטשה (פרידריך קוך-נולטה) , על ידי הקרן ורנר אוטו (פיטר Bannas), על ידי וילהלם סנדר הקרן (פיטר Bannas, פרידריך קוך-נולטה), ועל ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (מרטין Trepel, פרידריך Haag ופרידריך קוך-נולטה). אנו מודים לאוניברסיטת מרכז הסרטן המבורג (UCCH) במתקן Vivo האופטי ההדמיה Core וצוות בUKE להתייעצות והשירות באיכות הגבוהה שלהם. מתקן Core נתמך בחלקו על ידי מענקים מדויטשה Krebshilfe (גרמני למלחמה בסרטן סיוע).

הערה: ניסויים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומיות על השימוש האתי בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה המקומית לרווחת בעלי החיים של המרכז הרפואי של האוניברסיטה, המבורג. 1. הכנה של תאים סרטניים, עכברים, ובונה הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים לימפומה וaliquoting של מטריקס מרתף (Matrigel). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני ההזרקה של תאים סרטניים לשים תיבה מעוקרת קצה (1,000 טיפים μl) ופיפטה המתאימה במקפיא C -20 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הבקבוק עם מטריצת המרתף על קרח במקרר O 4 ° C / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההזרקה למלא דלי קרח ומניח את מטריצת המרתף יחד עם פיפטה, טיפים, ו1 מיליליטר מזרקים עם 30 מחטי G על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לימפומה Aliquot בהיקף של של מדיום RPMI בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge 100 μl ומערבבים בזהירות עם של מטריצת המרתף 100 μl. צייר את למראש מקורר-מזרקים ולשים על קרח עד הזרקה. הערה: השתמש בטכניקה סטרילית טובה ולעבוד על קרח כל הזמן כדי למנוע סתימה של מטריצת המרתף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 8-10 עכברים בשבוע ישן athymic בעירום (NMRI- Foxn1 n u). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית autofluorescence של המעי לשמור על עכברי דיאטה נטולת אספסת לשבוע 1 לפני ההדמיה in vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה של תאים לימפומה להרדים עכברים לבצע עם 2% isoflurane בתא אינדוקציה. לשמור isoflurane 1-2% עבור משך ההליך באמצעות סעפת isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תאים לימפומה מתחת לעור לתוך חביות הכתף. לשם השוואה פנים-אישית ישירה להזריק תאי אנטיגן חיובי ושלילי אנטיגן בצד ימין ושמאל, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באגודל ואצבע מורה לצבוט את העור של העכבר ולמשוך אותו מהגוף של העכבר. הזרק לאט ובאופן שווה להנרתיק נוצר על ידי האצבעות, יצירת קבוצה אחת של תאים שמתחת לעור. מטריצת המרתף עוזרת לשמור על תאים מוזרקים במקום. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת בונת הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל נוגדנים חד-שבטיים וnanobodies תחום אחד עם ערכת תיוג חלבון זמינה מסחרית לצבע ניאון AlexaFluor-680 (AF680) (אורך הגל = 679 nm העירור, גל = 702 nm הפליטה) על פי הוראות היצרן. לחשב את מספר הצבעים לnanobody ונוגדן קונבנציונלי באמצעות מקדמי הכחדה טוחנות של 15720 mol -1 -1 סנטימטר ו203.000 mol -1 סנטימטר -1, בהתאמה. להעריך את טוהר של מבני נוגדנים על ידי חלוקה גודל SDS-PAGE וכתם כחול מבריק Coomassie. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הספציפיות של conjugates שכותרתו על ידי ביצוע סדרה של ניסויים במבחנה לפני בדיקות ההדמיה בפועל. בחן את הספציפיות של הכותרתtibody בונה במבחנה באמצעות מחקרי חסימה ואלוטיפ נוקב שולט 8,20. הערה: בשלב 1.2.4 מספרים סלולריים לתאי אנטיגן-שלילי ואנטיגן החיובי (או קווי תאים שונים) עשויות להיות מותאמת על פי שיעורי צמיחה שונים. בניסויים אלה, תאים חיוביים 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 השלילי ו1.5x10 ARTC2 6 DC27.10 שמשו להשיג גידולים בגודל דומה. בשלב 1.3.1 התהליך של יעילות תיוג וסימון של בדיקות נוגדן עם fluorophores יכול להיות שונה בערכת התיוג השתמשה. </li></ol></li></ol> 2. בVivo Imaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7-9 ימים, כאשר גידולים להגיע ~ 8 מ&quot;מ קוטר, להזריק 50 מיקרוגרם של AlexaFluor680 שכותרתו בונה נוגדן בהיקף של 200 מלוח μl לוריד לוריד הזנב של העכבר (מב-AF680: 50 מיקרוגרם עם 2 צבעים / מולקולה ≈ ~ 4 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 0.8 מיקרוגרם fluorochromes; Nanobody-AF680: 50 μg עם 0.3 צבעים / מולקולה ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 1.1 מיקרוגרם fluorochromes). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתחל את מערכת ההדמיה ולהרדים עכברים לבצע עם 3% isoflurane באמצעות מערכת הרדמה XGI-8 בחדר האינדוקציה לפני ההדמיה. לשמור isoflurane 1-2% עבור משך הליך ההדמיה באמצעות סעפת isoflurane שוכנו בחדר ההדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי עמדה על במה הדמיה מחוממת עם גידולים מופנים לכיוון המצלמה. צג הרדמה הראויה על ידי צובט את הבוהן או זנב של החיה; כל תגובה של בעלי החיים מצביעה על כך שההרדמה היא קלה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על קצב הנשימה; ההרדמה היא קלה מדי אם קצב הנשימה מוגבר ועמוקה מדי אם קצב הנשימה יורד, עמוקה או לא סדירה. להגן על הקרניות של החיה עם משחה העין כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מערכות סינון ניאון של 615-665 nm לעירור, 695-770 ננומטר עבור emission, ועירור nm 580-610 לחיסור רקע עם גודל מטריצת פיקסל 51 2x 512. הגדרת זמן חשיפה לאוטומטית, binning פיקסל עד בינוני וF / תפסיק עד 2. הערה: זמני חשיפה קצרים יותר לאפשר מסגרת חליפין מהר יותר; זמני חשיפה ארוכים יותר מספקים רגישות רבה יותר. Binning שולטת בגודל פיקסל במצלמה CCD. הגדלת binning מגדילה את גודל פיקסל, רגישות, וקצב פריימים, אך מפחית את הרזולוציה מרחבית. F / Stop מגדיר את גודל צמצם עדשת מצלמה. גודל הצמצם שולט בכמות האור זוהה ועומק של field.Note שהגדרות יכולות להיות שונות על ידי ההדמיה מכשיר ולהגדיר ניסיוניים. עיין במדריך של היצרן לקבלת תוצאות אופטימליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן החשיפה לייעל תוכנת הדמיה, F / תחנה וbinning פיקסל מבוססים על רמת הביטוי של הקו הסלולרי. לשנות הגדרות אלה בכל עת במהלך ניסוי מבלי להשפיע על התוצאה כמותית. לחלופין, לתת לתוכנת ההדמיה האשף לקבוע באופן אוטומטיהפרמטרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי תמונה לפני ההזרקה ו -6 שעות לאחר ההזרקה של מבני נוגדן. הערה: יעילות התיוג עשויה להשפיע על המינון הנדרש דרוש לתוצאות הדמיה אופטימליות. לכן כמות נוגדנים-מבנה הנדרש לקבלת תוצאות הדמיה אופטימליות יש לקבוע באופן אמפירי. זה עשוי להשתנות בהתאם ליעילות תיוג וגודל של המבנה, כמו גם את מודל הגידול וביטוי יעד אנטיגן. </li></ol> 3. קציר והכנת הגידולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דלי קרח ומניח את 4%, מלוח paraformaldehyde (PFA) פוספט (PBS) / מעכב פרוטאז (AEBSF) ו / 0.2% אלבומין PBS בסרום שור (BSA) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגישת ההדמיה נגמרה, להגדיל את הריכוז של isoflurane עד 4%. אחרי בעלי החיים מפסיק לנשום, להסיר אותו מהבמה ולבצע ההדמיה נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הר על גוש קלקר ולרסס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים שימושים ומלקחיים כדי לחתוך את העור החיצוני ולמשוך בחזרה את זה בזהירות כדי לחשוף גידולים. הסרת גידולים עם אזמל כדי להבטיח רקמת גידול נותרה בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים בחצי באמצעות אזמל. מניחים מחצית בצינור איסוף עם PBS / AEBSF לFACS ניתוח ואת החצי השני בצינור 50 מיליליטר עם 4% PFA אימונוהיסטוכימיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לאימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור גידולי PFA 4% במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. העבר את הגידולים לצינור עם סוכרוז / 30% PBS ולשמור במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד כיורים גידול לחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגידולים בחתיכות מתאימות לcryomolds. שים את הגידולים בcryomolds ולמלא עם מתחם אוקטובר, כך שהגידולים מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תבניות על קרח יבש ולהמתין עד למתחם הוא קפוא לחלוטין. העבר את הגידולים קפואים ל-80 ° C במקפיא ולאחסן אימונוהיסטוכימיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut קפוא גידולים בסעיפים של 8 מיקרומטר עם microtome. השתמש immunohisto הסטנדרטיפרוטוקול כימיה להכתים עם נוגדן נגד CD31-AF488 לדמיין כלי דם וdiamidino-phenylindole (DAPI) כדי להמחיש גרעינים. הערה: סעיפי גידול רגישים מאוד לאור כפי שהם כבר מכילים נוגדנים שכותרתו fluorescently. למזער את החשיפה לאור ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי על קרח ולהסיר את הבוכנה של מזרק 2.0 מיליליטר. שים את הגידול במסננת התא ולחתוך אותו בעדינות לתוך 3-4 חתיכות באמצעות אזמל. יוצקים את PBS הראשוני בצלחת פטרי ולהשתמש בקצו השטוח של הבוכנה לכתוש את הגידול בתוך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מסננת התא עם PBS הראשוני כדי לשטוף את כל התאים עם טפטפת 10 מיליליטר. העבר את ההשעיה תא בצינור וספין חדש ב XG 500 במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 10 מיליליטר PBS / BSA 0.2%. ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-5 x 10 6 תאים לימפומה Aliquot בצינור FACS 5 מיליליטר. תאים שוב ספין (500XG), להשליך supernatant וגלול ב100 μl BSA / 0.2% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, בלוק FCR באמצעות אנטי-CD16 / CD32-מב (FcgR3 / 2) שנקשר לFcγR על קרח למשך 10 דקות. שטוף תאים פעם עם PBS / 0.2 BSA%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי CD45-מב להפלות leucocytes מהתאים אחרים. דגירה של 20 דקות על קרח בחושך, ואחריו שני שוטף עם BSA / 0.2% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני כתם ניתוח FACS עם יודיד propidium במשך 15 דקות על קרח כדי להבחין תאים מתים, ואחריו שני שוטף עם PBS רגיל. Resuspend ב -150 μl לניתוח FACS. הערה: בשלב 3.7.4 וצעד 3.7.5 נוגדנים אחרים, ניתן להשתמש בהתאם לישות סרטנית. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסדרה של כלים gating לשער האוכלוסייה של עניין בצורה של פיזור גדול, אפליית כפיל, הרחקה של תאים מתים, gating לתאים חיוביים CD45, וgating לתאי אנטיגן חיובי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחלה, תא שער החוצהפסולת בפיזור קדימה (FSC-A) לעומת פיזור הצד (SSC-A) באמצעות עלילת שני פרמטרים. כפילויות תא נזרק הבא. לבסוף, שער החוצה ללא CD45 אנטיגן-חיובי (CD45) ומת למות תאים (LD - מת-כתם / חי) /. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות שיא תוך שימוש באותה התבנית לכל הניסויים. הערה: עיין בפרוטוקול של היצרן לקבלת ייעוץ טכני בנוגע לשימוש בחומרה ותוכנה אנליטית. </li></ol> 5. ניתוח מיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח cryosections גידול צבעוני באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשת טבילת שמן (אובייקטיבי 40X). השתמש עירור הוא ניאון 633 nm לייזר של AF680, לייזר ארגון לAF488, ו- 405 Diode לDAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את נתוני תמונת גלם באמצעות תוכנה תואמת עם מיקרוסקופ. בצע רקע תיקון ורעש סינון במידת צורך. לבצע התאמות תמונה נוספות, כגון חתך, חיתוך, וכן התאמות בהירות והניגודיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף generate תמונת שכבת מרוכבים יחידה מכל ערוצי הגילוי. התאם את הבהירות והניגודיות של השכבות בודדות. התמונות המשולבות תציג לוקליזציה של תאים (DAPI-כתם, כחול), הפצה של מבנים שכותרתו נוגדן (AF680-כתם, אדום) וכלי דם (AF488-כתם, ירוק). </li></ol></li></ol> 6. בניתוח Vivo Imaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי תמונה פתוחים בתוכנת הדמיה וליצור תמונת שכבה על ידי שילוב של נתוני תמונת תמונה עם נתוני תמונת הקרינה. לייעל תצוגת תמונה על ידי הסרת אות רקע autofluorescence רקמות מאות הניאון הספציפית. ניתן לעשות זאת על ידי הפחתת התמונה שנרכשה עם מסנן רקע להגדיר מהתמונה שנרכשה עם המסנן המוגדר ספציפיים לנותב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר אזורי מדידה מעגליים זהים של עניין (ROI) סביב גידול אנטיגן חיובי והגידול אנטיגן-שלילי. כדי לקבוע עוצמת אות רקע, למקם את ההחזר על ההשקעה חוזרבשטח של בעלי החיים שבו אות הקרינה צפויה להיות נמוך (למשל, אחורי רגל). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו ROIs לכל בעלי החיים בכל נקודות הזמן. למיצוב, להשתמש בתמונות בשחורות-לבנה הצילום לזהות שוליים גידול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני ROI התצוגה בטבלת מדידה. השתמש בנתונים ממוצע קורנים יעילות, המאפשר השוואת כמותית נוספת של אותות ניאון עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תצוגה ולהשוות את הנתונים כעוצמות אות מוחלטות או לחשב את יחס אות לרקע באמצעות נתוני ROI נמדדו מרקמת מטרה ורקמת רקע. לחשב את יחס גידול לרקע על ידי חלוקת שווי ספיגת גידול על ידי ערך הרקע נקבע מהגפיים האחוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפקדים, גם לנתח גידולי אנטיגן-שליליים ואנטיגן החיובי באותן חיות כמו גם בעלי חיים שהוזרקו עם פקדי isotype שכותרתו להעריך את הספציפיות של אותות in vivo. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies+from+llama+effectively+and+specifically+block+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+in+vivo.">Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo.</a> FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).</li><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+monoclonal+antibody+detects+a+developmentally+regulated+mouse+ecto-ADP-ribosyltransferase+on+T+cells:+subset+distribution,+inbred+strain+variation,+and+modulation+upon+T+cell+activation.">A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation.</a> J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).</li><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetic+immunization+to+raise+antibodies+recognizing+toxin-related+cell+surface+ADP-ribosyltransferases+in+native+conformation.">Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation.</a> Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).</li><li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+and+specificity+of+toxin-related+mouse+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+depends+on+its+association+with+lipid+rafts.">Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts.</a> Blood. 105, 3663-3670 (2005).</li><li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+magnetic+resonance+imaging+of+enzyme+activity+on+the+cell+surface:+in+vitro+and+in+vivo+monitoring+of+ADP-ribosyltransferase+2+on+T+cells.">Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells.</a> Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).</li><li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+overexpression+of+toxin-related+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+sensitizes+T+cells+but+not+B+cells+to+NAD-induced+cell+death.">Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death.</a> Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).</li><li>Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+nomenclature+for+mammalian+ADP-ribosyltransferases.">Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases.</a> Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).</li><li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+targeting+of+T+cells:+comparison+of+nanobodies+and+conventional+monoclonal+antibodies.">In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies.</a> Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).</li><li>Scheuplein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD++and+ATP+released+from+injured+cells+induce+P2X7-dependent+shedding+of+CD62L+and+externalization+of+phosphatidylserine+by+murine+T+cells.">NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells.</a> J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).</li><li>Vaneycken, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+screening+of+anti-HER2+nanobodies+for+molecular+imaging+of+breast+cancer.">Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.</a> FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).</li><li>Xavier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+preclinical+validation,+dosimetry,+and+toxicity+of+68Ga-NOTA-anti-HER2+Nanobodies+for+iPET+imaging+of+HER2+receptor+expression+in+cancer.">Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer.</a> J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).</li><li>Tchouate Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Between+Epidermal+Growth+Factor+Receptor-Specific+Nanobody+Uptake+and+Tumor+Burden:+A+Tool+for+Noninvasive+Monitoring+of+Tumor+Response+to+Therapy.">Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy.</a> Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).</li><li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+labelling+of+an+anti-epidermal+growth+factor+receptor+Nanobody+with+68Ga+via+a+novel+bifunctional+desferal+chelate+for+immuno-PET.">Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).</li><li>Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumors+with+nanobodies+for+cancer+imaging+and+therapy.">Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy.</a> Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+optical+imaging+of+human+breast+tumour+xenografts+using+anti-HER2+VHHs+site-directly+conjugated+to+IRDye+800CW+for+image-guided+surgery.">Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).</li><li>Zaman, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibody+bioconjugated+near-IR+quantum+dots+for+targeted+cellular+imaging+of+pancreatic+cancer.">Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer.</a> J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).</li><li>Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+visualization+of+human+tumor+xenografts+through+optical+imaging+with+a+near-infrared+fluorescent+anti-epidermal+growth+factor+receptor+nanobody.">Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody.</a> Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).</li><li>Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+biodistribution+and+tumor+targeting+of+two+99mTc-labeled+anti-EGFR+nanobodies+in+mice,+using+pinhole+SPECT/micro-CT.">Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT.</a> J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).</li><li>Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody:+the+'magic+bullet'+for+molecular+imaging.">Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging.</a> Theranostics. 4, 386-398 (2014).</li><li>Siontorou, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+as+novel+agents+for+disease+diagnosis+and+therapy.">Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.</a> International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+trends+in+antibody-based+oncologic+imaging.">Recent trends in antibody-based oncologic imaging.</a> Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).</li><li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+targeting+to+tumors:+principles,+pitfalls+and+(pre-)+clinical+progress.">Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress.</a> Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).</li><li>Jain, R. K., Stylianopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+nanomedicine+to+solid+tumors.">Delivering nanomedicine to solid tumors.</a> Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).</li><li>Lisy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice.">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li><li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography.">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li></ol>

Friedrich Koch-Nolte and Friedrich Haag receive a share of antibody and protein sales via MediGate GmbH, a wholly owned subsidiary of the University Medical Center Hamburg-Eppendorf.

אנחנו השתמשנו nanobodies האינפרה-אדום הקרוב fluorophore שכותרתו ונוגדנים חד-שבטיים קונבנציונליים מכוונות נגד אותו היעד על תאי הלימפומה להשוואת multimodal של in vivo לשעבר vivo ניתוחים. הראינו כי nanobodies מתאים גם כלי אבחון לגילוי מהיר וספציפי in vivo של לימפומות. In vivo, S + 16 א 680 אפשרו זיהוי מהיר ומדויק יותר של xenografts ARTC2-חיובי. מלבד קינטיקה השונות להדמיה גידול הטובה ביותר in vivo, החסרון העיקרי של Nika102 680 הייתה האות ספציפי הגבוהה מגידולי ARTC2-שלילי ואותות רקע ספציפיים. Vivo לשעבר זרימת cytometric ניתוחים של תאים מפוזרים מגידולים גזורים לא הראו ספציפיים מחייב לתאים לימפומה ARTC2-השלילי של AF680-conjugates המוזרק. Ex vivo הקרינה חשף חזק וכמעט homogenצביעת יחידות ארגונית של תאי גידול בסעיפי ART2C חיובי במקרה של 16a של nanobody +, המאשר כי nanobody היה מסוגל להגיע לאזורים מרוחקים אפילו בתוך הגידול לאחר 6 שעות. בניגוד לכך, הנוגדן חד שבטי הראה כתמים חלשים והומוגניות של תאים בגידולי ARTC2 החיובי לאחר 6 שעות. תוצאות הדמיה טובות יותר עם הנוגדן הקונבנציונלי יכולות להיות מושגת לאחר 24 שעות או 48 שעות (מידע לא מוצג). על מנת לבצע השוואה מעמיקה של שני מבנים בגודל שונה, הדמיה בנקודות זמן שונה (סידורי הדמיה) יש לבצע על מנת לזהות את נקודת זמן הדמיה האופטימלית עבור כל מבנה. כמו מחקרים קודמים אחרים, על התוצאות המדווחות כאן להדגיש כי in vivo הדמיה מולקולרית עם nanobodies שכותרתו מאפשרת הדמיה גידול באותו יום מהירה וספציפית עם יחס גבוה של גידול לרקע 12-15,17-19. Contrariwise, נוגדנים קונבנציונליים לגרום ליחסים נמוכים גידול לרקע ואותות ספציפיים מאנטיגידולי gen-שליליים הראשונה לאחר הזרקה עקב הפינוי האיטי שלהם מהגוף. על מנת לקבל תוצאות אופטימליות הדמיה עם נוגדנים קונבנציונליים, זמן הדמיה מציין 24 שעות או אפילו 48 שעות לאחר ההזרקה יש צורך בדרך כלל. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו כי נוגדנים קונבנציונליים עם תועלת טיפולית מוכחת בעלת תועלת מוגבלות בהדמיה מולקולרית 17,19,26. לכן נוגדנים קונבנציונליים עשויים להיות לא מתאימים למטרות טיפוליות בשל הפלזמה מחצית החיים הארוכים שלהם בזמן nanobodies למדי מתאים למטרות הדמיה בשל הפינוי המהיר שלהם מהמחזור. הבדלים אלה נובעים מכך שכל עודף של nanobodies הקטן יותר (15-17 KDA) מנוקה במהירות באמצעות חיסול כליות בעוד עודף של נוגדנים גדולים יותר קונבנציונליים (150 KDA) נשמרים במחזור הדם. אז היתרון העיקרי של nanobodies להדמיה מולקולרית היא אות הרקע הנמוכה בנקודות זמן מוקדמות הדמיה regardlESS מהחומר המוזרק. זה מאפשר הדמיה אותו יום ויכול להיות לתרגום להגדרה. Contrariwise הקליני, נוגדנים קונבנציונליים צריכים להיות טיטרציה בדיוק כדי למזער אותות רקע ספציפיים, תוך שמירה על אות מסוימת מספיק מרקמת המטרה (נתונים שלא פורסמו). אחת המגבלות של טכניקת NIRF ההדמיה in vivo הוא עומק החדירה הנמוך אשר בדרך כלל מאפשר הדמיה של תת-עורי רק, אבל לא של מודלים גידול orthotopic. עם זאת, מגבלה זו עשויה להיות להתגבר בהגדרה ניסיונית על ידי טכניקות צילום אקוסטית טומוגרפית שפותחו לאחרונה, המאפשרות הדמיה של הגוף כולו של חיים עכברים 27. מגבלה נוספת של טכניקת NIRF ההדמיה היא ההערכה של מינון הרקמה בהשוואה להדמיה בתיווך רדיונוקלידים. עם זאת, nanobodies ניתן radiolabelled לטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים הדמיה (PET) של מודלים xenograft והערכה כמותית מדויקת שלbiodistribution נותב. ואכן, תוצאות NIRF ההדמיה שלנו הן בהתאם למחקר שנערך לאחרונה כי בהשוואה nanobodies ונוגדנים קונבנציונליים הדמיה PET. המחברים גם הגיעו למסקנה שnanobodies לאפשר הדמיה באותו יום עם יחס גבוה של גידול לרקע 15. עם זאת, רק התיוג של מבני נוגדן עם AF680 צבע פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום אפשר לנו מקיף במבחנה, in vivo והשוואה הדמיה הקרינה האינפרה-אדום קרוב vivo לשעבר באמצעות cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וNIRF הדמיה. מסיבה זו, ובגלל זה הוא nonradioactive, רגיש מאוד, זול, ומשתמש קל ללייצר יחסית בדיקות ממוקדות, אנו ממליצים על השימוש בטכניקת NIRF ההדמיה להערכת מבני נוגדן חדשים בהדמיה מולקולרית פרה-קלינית.

בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתארים את היישום של בדיקות fluorophore קרוב אינפרא אדום שכותרתו עבור אימות של in vivo ניסויי ההדמיה xenograft באמצעות זרימת vivo לשעבר cytometry ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של גידולי xenograft גזורים. אנו משווים nanobody יחיד תחום (ים + 16 א, 17 KDA) 1 ונוגדנים חד שבטיים (Nika102, 150 KDA) 2,3 מופנים לאותו אנטיגן ספציפי ליעד in vivo קרוב אינפרא אדום דימות פלואורסצנטי במודל xenograft לימפומה. ARTC2.2 ADP-ribosyltransferase אנטיגן היעד מתבטא כecto-אנזים פני התא מעוגן-GPI על ידי תאים לימפומה 4-9. Nanobodies נגזר מגמליים כבד שרשרת רק נוגדנים הם שברים מחייב אנטיגן הכי הקטנים 10,11. עם רק ~ 15 kDa, ברי נוגדן הקטנים אלה מסיסים, יציבים מאוד והם מופרשים באמצעות כליה פינו מהמחזור 8,10. Tמאפייני hese לגרום להם מתאימים במיוחד למיקוד ספציפי ויעיל של אנטיגנים סרטניים in vivo 12-20. מטרות משותפות של אנטיגן nanobodies זמין הן הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR1 או-1 שלה), גורם אנושי סוג צמיחת אפידרמיס 2 (HER-2 או CD340), אנטיגן carcinoembryonic (CEA) והידבקות תא כלי דם מולקולה-1 (VCAM-1 ) 21. conjugates Nanobody הם כלים מבטיחים לטיפול חיסוני סרטן וטיפול במחלות דלקתיות 22. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי nanobodies לאפשר גבוה -ratios גידול לרקע (T / B) מאשר נוגדנים קונבנציונליים ביישומי הדמיה מולקולריים in vivo 8,17,19. זה מוסבר בעיקר על ידי החדירה לרקמות עניה ואיטית יחסית של נוגדנים קונבנציונליים, פינוי איטי ממחזור, ושימור ארוך ברקמות ממוקדות שאינם 23. יתר על כן, עודף של נוגדנים קונבנציונליים מוביל להצטברות אני לא ספציפיגידולי אנטיגן-שלילי יעד n שנגרמו על ידי החדירות המשופרות והשימור (EPR) ישפיעו 24,25. משמעות הדבר היא כי מינונים גבוהים יותר של נוגדנים קונבנציונליים עשויים להגדיל לא רק אותות ספציפיים אלא גם אותות ספציפיים, ובכך להקטין את יחס גידול לרקע המרבי השגה. בניגוד לכך, הגדלת המינון של nanobodies מגבירה את האותות של גידולי אנטיגן חיובי, אך לא של רקמה נורמלית או גידולי אנטיגן-שלילי (נתונים שלא פורסמו). מעבר להשוואה של nanobodies ונוגדנים קונבנציונליים, אנו מתארים הערכת intraindividual של xenografts אנטיגן החיובי ו-שלילי באותו העכברים להשוואה ישירה של אותות ספציפיים ולא ספציפיים בשל השפעת EPR. הבדיקות מצומדות fluorophore קרוב אינפרא אדום אפשרו לנו לנצל את בדיקה יחידה in vivo לשעבר vivo באמצעות הדמיה הקרינה האינפרה-אדום קרוב, cytometry זרימה, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. יישום הפרוטוקולים שלנו מאפשר לאיאופטימיזציה רדיואקטיביים, רגישה מאוד, ולא יקרה של in vivo ניסויי הדמיה מולקולריים כגון הערכה של מבני נוגדן חדשים לגידול ספציפי מיקוד. מטרת מחקר הדרכה זו היא כדי להדגיש את השימוש בNIRF הדמיה להערכת מבני נוגדן חדשים בהדמיה מולקולרית פרה-קלינית. בפרוטוקול זה, כל הניסויים בוצעו עם מערכת NIRF-הדמיה קטן של בעלי חיים, סדרן תא הקרינה הופעלה (FACS) לזרום cytometer, ומיקרוסקופ confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AF680 protein labelling kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:176px;">A20172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD16/CD32-antibody</td>
			<td style="width:147px;">BioXCell</td>
			<td style="width:176px;">BE0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Anti-CD31-antibody</td>
			<td style="width:147px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-1506</td>
			<td style="width:183px;">labeled with secondary antibody with AF488</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-CD45-antibody V450</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AxioVision LE software</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">354234</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell strainer 70&#181;m</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:176px;">431751</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Molcular Probes</td>
			<td style="width:176px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">DC27.10 cells&#160;</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;">n/a</td>
			<td style="width:183px;">Other cells with different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FACS Canto II</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">www.bdbiosciences.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Flourescence mircoscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">NIH</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Alternative in vivo imaging system can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Leica LAS software</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to microscope used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Living Image software</td>
			<td style="width:147px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to imaging system used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Needles 30 G</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">305128</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Nika102-antibody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:103px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">P6148</td>
			<td style="width:183px;">Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">s+16a-nanobody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes 1ml</td>
			<td style="width:147px;">Braun</td>
			<td style="width:176px;">916 1406 V</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft nirf-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

בדיקות שכותרתו fluorescently מאפשרות שילוב של טכניקות שונות NIRF-הדמיה (איור 1 א). אנחנו מכוונים לביצוע in vivo NIRF-הדמיה, cytometry זרימה, ורצף מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להשוות nanobodies שכותרתו fluorescently ונוגדנים חד שבטיים לספציפי בתחום ההדמיה vivo (איור 1). עכברים הוזרקו 50 מיקרוגרם של nanobody ונוגדן חד שבטי כדי להעריך את הספציפיות של המבנים שכותרתו fluorescently הדמיה in vivo. התוצאות הראו תיוג ספציפי של גידולי אנטיגן חיובי עם שני nanobody ונוגדן חד-שבט בשעה 6 שעות לאחר ההזרקה (איור 2). ROI ניתוחים של גידולי אנטיגן החיובי הראה / B יחס גבוה בהרבה של T ~ 12 לnanobody לעומת ~ 6 לנוגדנים חד שבטיים. יתר על כן, nanobody לא הראה אות ספציפיות בגידולי אנטיגן-שלילי, ואילונוגדן חד-שבט הראה אותות בלבול ספציפיים בגידולי אנטיגן-שלילי. מלבד האות ספציפי של הגידולים השליליים, הנוגדן חד שבטי גם מושרה אותות רקע ספציפיים בכל בעלי החיים. זה כנראה עקב נוגדנים במחזור חופשי מוגזמים, שהם גדולים מדי כדי להיות מופרשים מופרשים באמצעות כליה. Contrariwise, בעלי חיים שהוזרקו עם nanobodies הראו אותות ספציפיים רק בכליות בשל חיסול הכליות של nanobodies הקטן. Cytometry זרימת ניתוח של מתלי תאים סרטניים הראתה תיוג ספציפי של תאים סרטניים אנטיגן החיובי עם שני AF680-conjugates 6 שעות לאחר הזרקה. אות הקרינה חזקה של תאי nanobody שכותרתו בהשוואה לתאי נוגדן חד שבטיים שכותרת משקפת את תוצאות NIRF ההדמיה in vivo. חשוב לציין, ניתוחי התזרים cytometric מגלים כי אין תיוג ספציפי של תאי אנטיגן-שלילי עם אחד משנימבנים (איור 3). מיקרוסקופ פלואורסצנטי של cryosections הגידול הראה תיוג חזק וכמעט אחיד של תאי אנטיגן חיובי עם nanobody שעה 6 לאחר הזרקה. Contrariwise, הנוגדן חד שבטי הראה כתמים חלשים מדי ולא הומוגניות (איור 4 א). גידולי Antigen שלילי לא מראים מכתים שעה 6 לאחר ההזרקה של nanobody, ואילו גידולי אנטיגן-שלילי מוזרקים עם הצביעה הקונבנציונלית תכנית הנוגדן ספציפי הפזורות במרחב הבין (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> איור 1: הדמיה Flourescence ובונת נוגדן. (א) התקנת הדמיה להערכת AF680-conjugates: בvivo NIRF הדמיה ואחריו cytometry זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. (B </strong&gt;) סכמטי של AlexaFluor680 כותרת 16a של nanobody + (אדום) ונוגדנים חד שבטיים Nika102 (כחול). כוכבים כתומים מעידים על fluorochromes AlexaFluor680. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> איור 2: בvivo NIRF הדמיה תמונות של אות הקרינה של אנטיגן-חיובי (+) ואנטיגן-שלילי (-) גידולים בעכברים שהוזרקו עם 16a של nanobody + () ונוגדנים חד שבטיים Nika102 (B). . ההדמיה בvivo בוצעה לפני (0 h) ו -6 שעות לאחר הזרקה. עוצמות אות מוצגות כיעילות קורנת (p / sec / 2 סנטימטר / SR) / (μW / 2 סנטימטר). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> איור 3:Vivo לשעבר FACS ניתוחים של מבני נוגדן תא מחויב מהשעיות תאים סרטניים. () אסטרטגית gating לFACS מנתח של תאים סרטניים. (ב) Histograms להציג את הסכום של 16 א + ונוגדן Nika102 של nanobody AF680 מצומדות- המוזרק לוריד במיוחד קשור לתאים הסרטניים בגוף חי. גידולי Antigen שלילי מוצגים כהיסטוגרמות ללא מילוי וגידולי אנטיגן החיובי מוצגים כהיסטוגרמות מלאה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> מיקרוסקופ מיקרוסקופ פלואורסצנטי Ex vivo (א) סקירת הקרינה של cryosections גידול אנטיגן חיובי כל 6 שעות לאחר ההזרקה של s + 16 א או 680 Nika102 680: איור 4.. עוצמות אות של in vivo לוריד בהדחוי AF680-conjugates ללא כל סוכנים משניים תיוג מוצגים באדום. Ex vivo גרעיני counterstained מוצגים בכחול וכלי בירוק. קווים מקווקווים מצביעים על שוליים חיצוניים של כל הגידולים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי תקריב של גידולי אנטיגן חיובי ושלילי אנטיגן (B).

Watch this Scientific Journal Video about Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy at JoVE.com

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

אימות של Nanobody ונוגדנים מבוסס<em&gt; In vivo</em&gt; ניסויי גידול xenograft NIRF הדמיה בעכברים באמצעות<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytometry הזרימה ומיקרוסקופי

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

validation-nanobody-antibody-based-vivo-tumor-xenograft-nirf-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

11.5K Views.  University Medical Center, Hamburg. This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Video: Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound and aortic blood pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is raised then lowered incrementally by intravenous infusion of vasoactive drugs phenylephrine and sodium nitroprusside. Aortic diameter is measured for each pressure step to characterize the pressure-diameter relationship of the ascending aorta. Stiffness indices derived from the pressure-diameter relationship can be calculated from the data collected. Calculation of arterial compliance is described in this protocol.
This technique can be used to investigate mechanisms underlying increased aortic stiffness associated with cardiovascular disease and aging. The technique produces a physiologically relevant measure of stiffness compared to ex vivo approaches because physiological influences on aortic stiffness are incorporated in the measurement. The primary limitation of this technique is the measurement error introduced from the movement of the aorta during the cardiac cycle. This motion can be compensated by adjusting the location of the probe with the aortic movement as well as making multiple measurements of the aortic pressure-diameter relationship and expanding the experimental group size.

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.

מדידה עולה אבי העורקים נוקשים<em&gt; In vivo</em&gt; בעכברים באמצעות אולטראסאונד

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...