Befruchtete GFP-Hühnereier wurden von Prof. Helen Sang, dem Roslin Institute und der University of Edinburgh, UK, geliefert. Die Roslin Transgenic Chicken Facility wird vom Wellcome Trust und vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) finanziert. Die Arbeit wurde teilweise von Great Ormond Street Hospital Children es Charity, London, UK, finanziert und NT unterstützt. Die Autoren danken Ben Jevans vom UCL Institute of Child Health für die Hilfe bei der Vorbereitung von Embryonen für die Pfropfung.

1. Vorbereitung von Mikroskalpell für Neuralrohrablationen
<ol><li>Gestalten Sie ein Mikroskalpell aus einer handelsüblichen Stahlnähnadel.<ol>
<li>Abflachen Sie zunächst die Nadel beidseitig mit einer Schleifscheibe, die auf einem angetriebenen Bankschleifer montiert ist.</li>
		<li>Beginnen Sie mit der Formgebung des Skalpells, zuerst auf einem groben Arkansas-Stein mit einer kontrollierten kreisförmigen Bewegung, in wechselnden Richtungen, auf beiden Seiten der Nadel.</li>
		<li>Tragen Sie auf den gleichen Schärfbewegungen auf einem extra feinen Grade Arkansas Stein, um ein ultrafeines Mikro-Skalpell zu formen, mit einer gut definierten Schneide (Abbildung 1A, B). HINWEIS: Alternativen zum Mikroskalpell könnten elektrolitisch geschärfte Nadeln, handelsübliche Wolframnadeln oder gezogene Glasnadeln sein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Wildtype und GFP-Eier in die gewünschte Phase eintauchen
<ol><li>Dünge Hühnereier und transgene GFP-Hühnereier in einem gekühlten Inkubator bei 14 - 15 °C vor der Inkubation aufbewahren, da die Entwicklung bei dieser Temperatur gestoppt wird. Eier für ein paar Tage, bis zu einer Woche aufbewahren.</li>
	<li>Um mit der Entwicklung zu beginnen, legen Sie Wild-Typ und GFP-Eier horizontal auf ein Tablett und brüten gleichzeitig in einem befeuchteten (58 - 60%) Inkubator bei 37,5 oC, so dass sich Embryonen in einem entsprechenden Stadium für die Neuralrohrtransplantation befinden.</li>
	<li>Um Embryonen im 10 - 12- Entwicklungsstadium für die Durchführung von Vagal-Neuralrohr-Transplantationen zu erhalten, 1,5 Tage (33 - 38 Std.) und Stadium-Embryonen nach den Entwicklungstabellen von Hamburger und Hamilton21zu inkubieren.</li>
</ol>3. Bereiten Sie Eier für Das Windowing und Grafting
<ol><li>Bewegen Sie ein Ei nach dem anderen zu einem maßgeschneiderten Eierhalter zum Fenstern. Machen Sie ein kleines Loch in der Eierschale, indem Sie wiederholt mit gerader Schere auf die Oberseite des spitzen Endes des Eis tippen.</li>
	<li>2 - 3 ml Albumin mit einer hypodermischen Nadel von 181,2 G und einer Spritze von 5 ml aus dem Ei entfernen. Das Entfernen des Albumins senkt das Eigelb und erleichtert das nachfolgende Fenster, ohne den Embryo zu beschädigen.<ol>
<li>Verwerfen Sie das Albumin. Versiegeln Sie das Loch mit einem kleinen Streifen aus klarem Klebeband, das mit einer feinen Schere auf Diegröße geschnitten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tippen Sie mit einer gekrümmten Schere auf ein weiteres Loch in der Oberseite der Eierschale. Setzen Sie die Spitze der Schere in das Loch ein und arbeiten Sie in einer kreisförmigen Bewegung, um ein Fenster mit einem Durchmesser von 2 cm auf der Oberseite der Schale zu schneiden.<ol>
<li>Bewahren Sie die Schere in einer stationären Position auf und drehen Sie das Ei. Entsorgen Sie die entfernte Scheibe der Eierschale. Bei E1.5 ist der Embryo als dunklere gelbe Scheibe auf dem Dotter erkennbar.</li>
		<li>Entfernen Sie alle Schalenabfälle, die in das Ei gefallen sind, mit einer Pinzette. Entsorgen Sie alle unbefruchteten Eier (identifiziert durch einen kleinen weißen Fleck oben auf dem ansonsten hellgelben Eigelb).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bereiten Sie den Wirtsembryon darauf vor, grafiertes Gewebe zu erhalten
<ol><li>Stellen Sie das Stereomikroskop auf Augenhöhe ein und optimieren Sie die Ausrichtung der Schwanenhalslichtquelle, um den Embryo adäquat zu beleuchten, ohne Reflexionen zu verursachen.</li>
	<li>Um den Embryo selbstzu visualisieren, injizieren Sie eine kleine Menge indischer Tinte unter die Mitte der dunkleren gelben Scheibe, mit einem Mundrohr und einer gezogenen Glas-Mikropipette (Abbildung 1C, Oii).<ol>
<li>Bereiten Sie die Tinte 50:50 mit PBS mit Penicillin/Streptomycin in einer Endkonzentration von 100 g/ml vor. Setzen Sie die Mikropipette durch die Dottermembran außerhalb des Umfangs des Blastoderms und winkeln Sie dann vorsichtig ihre Spitze direkt unter dem Embryo.</li>
		<li>Geben Sie Tinte unter dem Embryo, indem Sie auf das Mundrohr blasen. Wenn Mundpipettieren nicht erlaubt ist, verwenden Sie stattdessen eine 1 ml Spritze. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter dem Embryo einzuführen, die zu einer Kontamination führen können, und entfernen Sie dann vorsichtig die Glas-Mikropipette. Dies ist ein heikler Schritt, der zum Tod des Embryos führen kann, wenn er nicht mit Präzision durchgeführt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inszenieren Sie den Embryo unter Bezugnahme auf Hamburger und Hamilton21 und zeichnen Sie die Bühne in einem Laborbuch auf.</li>
	<li>Mit einem maßgeschneiderten Mikro-Skalpell (oder eine feine Wolframnadel) auf einem Nadelhalter montiert, machen eine sehr kleine Gash in der Vitelline-Membran, neben dem Bereich, wo die Mikro-Chirurgie durchgeführt wird.<ol>
<li>Tragen Sie vorsichtig 2 - 3 Tropfen PBS über den Membranriss (mit einer Glas-Mikropipette und dem Mundrohr) auf, um Raum zwischen embryo und membran zu schaffen. Schneiden Sie ein größeres Fenster in der Membran, um den gesamten Bereich freizulegen, in dem die Mikrochirurgie stattfinden wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den neuronalen Röhrenbereich von Interesse mit dem Mikro-Skalpell, beginnend mit rostralen und kaudalen Transversalschnitten über das gesamte dorsale Neuralrohr (auf der Ebene von 1 bis 7 im Video).<ol>
<li>Bilateral zwischen dem Neuralrohr und den Soden schneiden, um das Neuralrohr von umgebenden Geweben zu trennen, ohne die Soden zu beschädigen.</li>
		<li>Trennen Sie das Neuralrohr sehr sanft vom darunter liegenden Notochord, der intakt bleiben sollte. Beachten Sie, dass eine erfolgreiche Neuralrohrexzision alle umgebenden Gewebe vollkommen intakt lässt (Abbildung 2).</li>
		<li>Entfernen Sie das ausgeschnittene Neuralrohr, indem Sie es in eine Glas-Mikropipette zerkrümen und dann entsorgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeichnen Sie den Grad der Neuralrohrablation in einem Laborbuch auf. Der Wirtsembryo ist nun bereit, das Spender-Neuralrohr zu erhalten.</li>
</ol>5. Bereiten Sie das Spender-Graft-Gewebe vor
<ol><li>Wählen Sie einen fensterförmigen, stufengerechten GFP-Embryo aus, indem Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop mit FITC-Filter betrachten. Die GFP-Fluoreszenz macht es sehr einfach, die Soden zu visualisieren und den Embryo zu inszenieren.</li>
	<li>Sobald ein stadium-matched Embryo identifiziert wurde, entfernen Sie den Embryo aus dem Ei durch 4 Schnitte, mit Pascheff-Wolff Federschere (Abbildung 1C, l) in einer Rechteckform um den Embryo und nehmen Sie ihn dann vorsichtig mit einem Embryolöffel auf.</li>
	<li>Legen Sie den Embryo in ein quadratisches Uhrenglas mit einer Sylgard-Polymerbasis. Schütteln Sie den Embryo vorsichtig mit Dumont #5 Pinzette, um jedes angebrachte Eigelb zu entfernen. Entfernen Sie die Vitelline-Membran und fixieren Sie den Embryo mit rostfreien Minutien-Pins auf die Polymerbasis (Abbildung 1C).</li>
	<li>Mit der Federschere machen Sie 4 Einschnitte in rechteckiger Form um das Neuralrohr und die umgebenden Soden, in der gleichen Region, die aus dem Wirtsembryon entfernt wurde.</li>
	<li>Übertragen Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette das Neuralrohr und das Gewebe aus dem Spender-GFP-Embryo in ein Uhrenglas mit 0,2% Pankreatin in Pen/Strep PBS.</li>
	<li>Lassen Sie die enzymatische Verdauung 10 min bei RT fortsetzen, um die Gewebe zu trennen. Verwenden Sie nach der Inkubation im Enzym die an einem Griff montierten Rost-Minutien-Pins, um das Neuralrohr manuell von allen angrenzenden Geweben zu trennen.</li>
	<li>Mit einer Glas-Mikropipette das dissoziierte Neuralrohr auf ein anderes Uhrenglas übertragen, das DMEM + 10% Serum(z.B.Ziege, Pferd oder fetales Kalb) auf Eis enthält, um die überschüssige Pankreatin zu spülen und die enzymatische Verdauung zu stoppen. Nach 5 min ist das sezierte Neuralrohr bereit, orthotopisch in den Kükenwirt eingepfropft zu werden (Abbildung 2 und S1).</li>
</ol>6. Graft das Gewebe
<ol><li>Übertragen Sie mit einer Glas-Mikropipette das sezierte Neuralrohr vorsichtig vom Uhrenglas auf den Wirtsembryon. Positionieren Sie das Neuralrohr in der korrekten vorderen-hinteren Ausrichtung und schieben Sie das Explant neben dem ausgeschnittenen Bereich des Kükenwirts vorsichtig mit dem Mikroskalpell. Lassen Sie ein kleines Fragment des Ektoderms an der dorsalen Oberfläche befestigt oder durch Schneiden eines kleinen Nicks ein, um die Ausrichtung des Neuralrohrs zu identifizieren.<ol>
<li>Verwenden Sie bei Bedarf das Mikroskalpell, um die Explantation auf die exakte Größe der ausgeschnittenen Region zu trimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie das Neuralrohr vorsichtig in den abierten Bereich und positionieren Sie es so, dass die Dorsalseite richtig ausgerichtet ist. Verwenden Sie eine Glas-Mikropipette, die an einem Mundrohr befestigt ist, um PBS und/oder Flüssigkeit, die das Transplantat umgibt, zu entfernen. Dies hilft dem Spender und Wirtgewebe zu haften und das Transplantat zu etablieren.</li>
	<li>Versiegeln Sie das gesamte Fenster mit 24 mm breitem Klarband, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.</li>
	<li>Beschriften Sie den chimeric embryo durch Markierung mit einem Bleistift auf der Eierschale und notieren Sie seine Nummer im Laborbuch. Das Ei zur weiteren Entwicklung in den Inkubator zurückbringen.</li>
</ol>7. Injizieren Sie DiI in die Blutgefäße des Wirtsembryons
<ol><li>Zum gewünschten versuchsreichen Zeitpunkt (hier 3 - 10 Tage später) den chimeric embryo aus dem Inkubator holen und das klare Klebeband mit einer geraden Schere entfernen, um Zugang zum Embryo innerhalb des Eis zu erhalten.</li>
	<li>Bei Bedarf vergrößern Sie das Fenster in der Schale mit der Schere. Achten Sie darauf, die chorioallantoische Membran nicht zu beschädigen, wenn sie an der Schale befestigt ist, was zu Blutungen führen und die Kennzeichnung des Blutgefäßes gefährden würde.</li>
	<li>Wählen Sie eine zugängliche Vene auf dem Dotter, um sicherzustellen, dass der Blutfluss auf den Embryo gerichtet ist. Wählen Sie einen Verzweigungspunkt einer der Vitelline-Venen (Abbildung 3B, C). HINWEIS: Bei E6.5 - E7.5 muss die chorioallantoische Membran möglicherweise sanft mit einer Pinzette zur Seite geschoben werden, um auf die Dottervenen zuzugreifen. Nach E8.5 besteht die einzige Möglichkeit darin, eine der chorioallantoischen Membranvenen zu injizieren, da die chorioallantoische Membran zu diesem Zeitpunkt den Embryo vollständig abdeckt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Vitelline-Membran über dem gewählten Injektionspunkt mit zwei Dumont-#5 Pinzette, indem Sie in entgegengesetzte Richtungen reißen.</li>
	<li>Brechen Sie eine gezogene Glasnadel mit einem Dumont-#5 und passen Sie ihren Durchmesser vor dem Laden mit CellTracker CM-DiI an die ungefähre Größe der Vene an. Machen Sie die DiI-Lagerlösung in DMSO bei 40 g/l und lagern Sie sie bei -20 °C. Bereiten Sie die Arbeitslösung in 0,3 M Saccharose/PBS in einer Konzentration von 4 g/l vor.<ol>
<li>Aspirieren Sie zwischen 5 - 10 l DiI in 0,3 M Saccharose/PBS in die Nadel mit Absaugung mit einem Mundrohr. Ältere Embryonen können bis zu 25 l oder mehr benötigen. Ab E8.5 haben Embryonen größere, muskulösere Venen, die möglicherweise mit einem Dumont-#5 in Position gehalten werden müssen, bevor sie mit der DiI-belasteten Glasnadel stechen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel schnell in die Vene ein und blasen Sie sie stetig mit dem Mundrohr, damit der DiI den Blutfluss langsam verbinden kann, ohne ein Gerinnsel zu bilden. Alternativ können Sie einen Druckinjektor für die DiI-Lieferung verwenden.</li>
</ol>8. Ernte Embryonen für Schnitt oder Wholemount-Untersuchung
<ol><li>Um so viel DiI wie möglich im Embryo zu behalten, ernten Sie den Embryo unmittelbar nach der Injektion, indem Sie ihn auf einen perforierten Löffel schaufeln und die Blutgefäße und Bindegewebe mit einer geraden Schere schneiden, um den Embryo vom Eigelb zu befreien.</li>
	<li>Entfernen Sie alle losen Membranen und sezieren Sie die Organe von Interesse(d.h.die Lunge und den Verdauungstrakt in diesem Tutorial), mit großer Sorgfalt nicht das Gewebe zu komprimieren, die Diffusion des DiI schafft. Beheben Sie das Gewebe sofort durch Eintauchen in 4% PFA für 1 - 2 Stunden bei RT.</li>
	<li>Spülen Sie das Gewebe für 5 min in PBS, dann 15 min in PBS mit 5 g/ml DAPI. Montieren Sie die Proben auf einem überbrückten Mikroskopschlitten für die gesamte Montageuntersuchung oder betten Sie sie für Kryo-Sektionen ein.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Hier beschriebene Methode der neuralröhreninternen Neuralrohrtransplantation in Kombination mit der hier beschriebenen Blutgefäßkennzeichnung nutzt den einfachen Zugang des Aviären Embryos innerhalb des Eis (im Vergleich zu anderen Wirbeltierembryonen) voll aus, um die gemeinsame Entwicklung eines Elements des autonomen Nervensystems (ENS) und des Gefäßsystems zu untersuchen.
Für die Kennzeichnung von NCC-Derivaten hat die von uns beschriebene Küken-GFP-Küken-Intraspezies-Transplantationsmethode eine Reihe von Vorteilen gegenüber der klassischen Wachtel-Küken-Chimäre-Methode, die vor über 40 Jahren1-3eingeführt wurde. Erstens ist die GFP-Fluoreszenz unter FITC-Licht extrem hell, da GFP+-Zellen in lebenden chimer Embryonen leicht erkennbar sind. Dies ermöglicht es, den Erfolg des Transplantats in ovozu überprüfen, während die Quail-Küken-Transplantation erfordert, dass der Embryo mit QCPN getötet, verarbeitet und immungefärbt wird, bevor der Erfolg des Transplantats ermittelt werden kann2. Zweitens ist die GFP-Expression im transgenen KükenGFP zytoplasmisch, daher werden nicht nur Zellkörper gelabelet, sondern auch die Projektionen der transplantierten Zellen visualisiert22. Dies ermöglicht die Beobachtung komplizierter neuronaler Netzwerke bei hoher Auflösung (beachten Sie, dass feine Projektionen am besten visualisiert werden, wenn die Probe mit Anti-GFP-Antikörpern immunisiert wird). Da die QCPN-Kennzeichnung auf den Wachtelzellkern beschränkt ist, werden solche Netzwerke nicht mit Wachtel-Küken-Chimären aufgedeckt. Drittens eliminiert die Transplantation nach Innenarten mögliche Artenunterschiede zwischen den Zellen innerhalb des chimären Embryos. Da Wachtelembryonen eine kürzere Inkubationszeit haben als Küken (19 Tage versus 21 Tage) wurde vorgeschlagen, dass Wachtelzellen eine höhere Proliferationsrate als Kükenzellen haben, was potenziell die Entwicklung der chimaschigen Gewebe beeinflussen könnte23. Interessanterweise hat sich auch in Pflanzen gezeigt, dass die Veredelung zwischen Arten umfangreiche Veränderungen in den DNA-Methylierungsmustern im Wirt 24hervorrufen könnte. Viertens erleichtert das KükenGFP Back-Transplantationsexperimente, um Themen wie NCC-Schicksal und Zellbindung25anzusprechen. Fünftens ist das transgene KükenGFP auch für viele andere Techniken nützlich, einschließlich FACS-Sortierung von GFP+-Zellsubpopulationen, organotypische Kultur von Organen, die GFP+-Zellen enthalten, genetische Manipulation von GFP+-veredeltem Gewebe durch Elektroporation von Expressionsplasmiden26und anderen bildgebenden Technologien wie der optischen Projektionstomographie27.
Der Neuronistentransplantationsansatz kann durch mikrochirurgisches Ersetzen kürzerer Mengen an Neuralrohr enthaton verändert werden. Durch die Verwendung kleinerer Segmente von Neuralrohren ist die Mikrochirurgie potenziell weniger schädlich für den Embryo und das Überleben kann verbessert werden. Der Nachteil der Transplantation weniger Neuralrohr ist jedoch, dass die Anzahl der GFP+ NCC im Wirt reduziert werden. Die Benutzer könnten versuchen, ein Gleichgewicht zwischen der Menge der neuronalen Röhrchen transplantiert zu erreichen, um ein optimales Überleben der Embryonen zu geben, und die Anzahl der GFP+ NCC im Wirtsdarm ausreichend, um informative Ergebnisse zu liefern.
Für die Gefäßmalerei hat DiI den Vorteil, dass seine Fluoreszenz sehr hell und robust ist. Außerdem hat es die Fähigkeit, während der Fixierung zu diffundieren und die Färbung der feinsten geöffneten Kapillaren zu sichern. Da es sich um einen lebenswichtigen Farbstoff handelt, können Embryonen das Injektionsverfahren überleben und sich mit einem gebeizten Gefäßsystem weiterentwickeln (bis zu 24 Stunden in unseren Händen, obwohl die Färbung im Laufe der Zeit punktueller wird, siehe Abbildung 3E). Die Kombination von KükenGFP-Veredelung mit DiI Gefäßmalerei ist daher kompatibel mit Live-Bildgebung. Neben all diesen Vorteilen ist zu beachten, dass die Gefäßinjektion nur luminisierte Gefäße kennzeichnet und daher keine ungeöffneten Kapillaren, Endothelspitzenzellen oder isolierte Endothelzellen identifiziert. Weitere Fortschritte bei der Aviären Transgenese könnten jedoch neue Wege zur Umgehung solcher Probleme bieten, wie Experimente mit Tg(tie1:H2B-eYFP) Wachtelembryonen zur Untersuchung der vaskulären Morphogenese28zeigen. Eine weitere Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass für eine effektive Gefäßkennzeichnung in Embryonen bei E7.5 und darüber hinaus größere Mengen an Farbstoff injiziert werden müssen, was Experimente teuer machen kann. Eine Modifikation der Technik könnte jedoch eine kostengünstige Blutgefäßkennzeichnung mit Hervorhebungstinte14beinhalten, obwohl dieser Ansatz nicht in unseren Händen erprobt wurde.
Kritische Schritte der Verfahren sind der Prozess der Visualisierung des Embryos durch Injektion von Tinte unter die Blastodisc. Wenn die Membran, die das Eigelb bedeckt, in diesem Stadium von der mit Tinte gefüllten Nadel gerissen wird, ist das Überleben des Embryos stark gefährdet. Auch ist es wichtig, bei der Vorbereitung eines Spender-Neuralrohrs, dass das Gewebe nicht für eine übermäßig lange Zeit in Pankreatin gelassen wird (betrachten sie etwa 10 min als Maximum). Längere Exposition gegenüber Pankreatin schädigt das Gewebe und das Neuralrohr ist dann schwer zu handhaben und es wird nicht gut in den Wirt integrieren. Die Erlangung von Erfahrungen mit der DiI-Injektionstechnik an wilden Embryonen ist vor der Injektion von chimer Embryonen unerlässlich, da für jeden Embryo im Allgemeinen nur ein Injektionsversuch möglich ist. DiI-Volumen und Nadeldurchmesser sind kritische Parameter für jeden Embryo und sollten anhand von Wildtyp-, Stufen-Matched-Kontrollen bewertet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Dual-Labeling-Methode der Neuralrohrtransplantation und DiI-Gefäßmalerei in lebenden Kükenembryonen verwendet werden kann, um die Wechselbeziehungen zwischen NCC und Blutgefäßnetzen während der Organogenese zu untersuchen. Angesichts der Noch weitgehend unbekannten Mechanismen, die für die Festlegung der korrekten Zielinnervation und Vaskularisation während der Organentwicklung verantwortlich sind, birgt diese Methode Potenzial für zukünftige Entdeckungen in diesem Bereich.

Der Hühnerembryon ist ein unschätzbarer Modellorganismus in der Wirbeltierentwicklungsbiologie, nicht zuletzt, weil seine Entwicklung in ovo experimentelle Manipulationen ermöglicht, die sonst bei Wirbeltieren, die sich in uteroentwickeln, unmöglich sind. Diese Zugänglichkeit und einfache Manipulation hat dazu geführt, dass der Küken-Embryo eine Schlüsselrolle bei vielen bahnbrechenden Entdeckungen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie spielt. Zu den mächtigsten Techniken gehörte die Verwendung von Wachtel-Küken-Chimer-Embryonen zur Untersuchung des Zellschicksals, eine Methode, die von Professor Nicole Le Douarin in den 1970er Jahren1-3entwickelt wurde. Insbesondere Wachtelküken-Chimären waren besonders nützlich, um während der frühen Entwicklung stark wandernde neurale Kammzellpopulationen (NCC) genetisch zu markieren und zu folgen. NCC sind eine multipotente Population von Zugzellen, die im dorsalen Ektoderm an den Rändern des Neuralrohrs entstehen und zu einer Vielzahl von Zelltypen im gesamten Wirbeltierembryon führen. Dazu gehören craniofacial Strukturen (Knorpel, Knochen, Muskeln), Neuronen und Glia (im sensorischen und autonomen Nervensystem), Melanozyten, und eine Subpopulation von Zellen des endokrinen Systems2,4,5. Einer der wichtigsten Faktoren, die das NCC-Schicksal beeinflussen, ist ihre ursprüngliche Position entlang der vorderen-hinteren Achse des Neuralrohrs. Zum Beispiel entstehen enterische NCC, die die Neuronen und Glia des enterischen Nervensystems (ENS) hervorrufen, aus zwei diskreten Subpopulationen: die erste in der vagalen (kaudalen Hinterhirn) Region und die zweite in der sakralen Region des Neuralrohrs6-13. Inter- oder Intra-Spezies-Transplantation der entsprechenden Regionen des Neuralrohrs waren die Techniken der Wahl, um diese Zellen dauerhaft zu kennzeichnen und anschließend die Verfolgung von ihrer Geburt an den Rändern des Neuralrohrs bis zu ihren endgültigen Bestimmungspunkten innerhalb des Verdauungstraktes zu ermöglichen6,7,10.
Eine weitere embryonale Manipulation, die bei Küken im Vergleich zu anderen Tiermodellen leichter durchzuführen ist, ist die lebenswichtige Kennzeichnung des Gefäßsystems. Tatsächlich liegt der Kükenembryon, während er sich entwickelt, auf einem extraembryonalen Gefäßnetz, das Sauerstoff und Nährstoffe aus dem Eigelb zirkuliert. Dieses zugängliche Gefäßnetz, das sich auf der Oberfläche des Dotters befindet, kann als Tor zur Kennzeichnung des sich entwickelnden Gefäßsystems des Embryos während der Organogenese12,14-17verwendet werden. Die intravaskuläre Injektion verschiedener Farbstoffe, wie z.B. des lipophilen Farbstoffs DiI, ermöglicht es, alle luminisierten Gefäße des entstehenden Gefäßnetzes abzuschrägen/zu färben.
Da sich entwickelnde Organe sowohl mit dem Nervensystem (für die sensorische und motorische Steuerung) als auch mit dem Gefäßsystem (für Gasaustausch, Flüssigkeits- und Nährstoffversorgung) verbunden sein müssen, entwickeln sich die beiden Netzwerke nebeneinander und haben in ihrer Verzweigungsarchitektur18-20frierende Ähnlichkeiten. Hier berichten wir von embryonalen Manipulationen, die es uns ermöglichen, die gleichzeitige Entwicklung des nCC-abgeleiteten ENS zusammen mit dem Gefäßsystem während der Organogenese zu untersuchen. Dies wird durch die Erzeugung von Hähnchenchimären durch Transplantation diskreter Segmente des Neuralrohrs, einschließlich des Neuralkamms, in Kombination mit einer vaskulären DiI-Injektion erreicht. Als Fortschritt von Wachtel-Huhn-Chimären verwendet unsere Methode transgene GFP-Küken-Embryonen für die Transplantation innerhalb der Spezies, wodurch die Transplantationstechnik in Bezug auf bildgebende Zellen und ihre Projektionen leistungsfähiger wird und mögliche Verzerrungen im Zusammenhang mit Artenunterschieden beseitigt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="58">
			<td height="79" rowspan="2" style="height:80px;width:528px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:312px;">Company&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:320px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Fertilised chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">Henry Stewart and Co, Louth, UK</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">Fertilised GFP chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Egg incubator (Profi-H Hatcher)</td>
			<td>Lyon Technologies, CA, USA</td>
			<td style="width:320px;">910-033</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">14C Incubator</td>
			<td style="width:312px;">Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK</td>
			<td style="width:320px;">Model LT2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo-microscope&#160;</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">Model MZ 12.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">DC500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">IM50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Goose neck halogen cold light source</td>
			<td style="width:312px;">Advanced Imaging Concepts, Inc</td>
			<td>KL 1500 LCD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">181&#8260;2 G hypodermic needle&#160;</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">HSWNH181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancreatin</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">P3292</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>D5030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>G6767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">5ml syringe</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z248010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Mouth tube</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">A5177</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in.</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">S6018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Transfer pipettes, polyethylene</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z350796&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY8 30-0035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holders (Nickel-plated pin holder)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:320px;">15371-92</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Minutien pins&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">26002-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perforated spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10370-18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten needles (0.125mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10130-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sellotape (clear, 24mm width)</td>
			<td style="width:312px;">Any Supplier</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution</td>
			<td style="width:312px;">VWR international</td>
			<td>101447-068&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:312px;">Dow Corning</td>
			<td>S09 512 516</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pelikan black ink</td>
			<td style="width:312px;">Pelikan</td>
			<td>211-169</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">C-7001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Settings for glass needle puller&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller model P-86</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection

Alle sich entwickelnden Organe müssen sowohl mit dem Nervensystem (zur sensorischen und motorischen Steuerung) als auch mit dem Gefäßsystem (für Gasaustausch, Flüssigkeits- und Nährstoffversorgung) verbunden sein. Folglich entwickeln sich sowohl das Nerven- als auch das Gefäßsystem nebeneinander und haben auffallende Ähnlichkeiten in ihrer verzweigten Architektur. Hier berichten wir embryonale Manipulationen, die es uns ermöglichen, die gleichzeitige Entwicklung von neuronalem Kamm-abgeleitetem Nervengewebe (in diesem Fall dem enterischen Nervensystem) und dem Gefäßsystem zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Hühnerchimäre durch Transplantation diskreter Segmente des Neuralrohrs und des zugehörigen Neuralkamms in Kombination mit einer vaskulären DiI-Injektion im selben Embryo erzeugt werden. Unsere Methode verwendet transgene KükenGFP-Embryonen für die Transplantation nach Denspezies, was die Transplantationstechnik leistungsfähiger macht als das klassische Wachtel-Küken-Interspezies-Transplantationsprotokoll, das seit den 1970er Jahren mit großer Wirkung verwendet wird. ChickGFP-chick Intraspecies Transplantation erleichtert die Bildgebung von transplantierten Zellen und deren Projektionen in intakten Geweben und eliminiert mögliche Verzerrungen in der Zellentwicklung im Zusammenhang mit Artenunterschieden. Diese Methode nutzt den einfachen Zugang des Vogelembryons (im Vergleich zu anderen Wirbeltierembryonen) voll aus, um die Ko-Entwicklung des enterischen Nervensystems und des Gefäßsystems zu untersuchen.

Abbildung 1 zeigt typische Instrumente, die für die mikrochirurgische Isolierung und Transplantation des Neuralrohrs erforderlich sind. Abbildung 2 zeigt das Transplantationsverfahren. Nach der Transplantation werden Embryonen auf Transplantationserfolg untersucht. Dabei wird der Embryo unter einem Stereofluoreszenzmikroskop, typischerweise am Morgen nach der Mikrochirurgie, auf das Vorhandensein von transplantatabgeleiteten (GFP+) NCC untersucht. Wenn die Transplantation erfolgreich war, kann GFP+ NCC in der Nähe des Neuralrohrs und in frühen Migrationswegen beobachtet werden, die zum Vorgut führen. Wenn das Verfahren nicht erfolgreich war, wird GFP+ NCC nicht außerhalb des Neuralrohrs beobachtet, oder wenn sie im Wirt vorhanden sind, können sie in kleineren Zahlen vorhanden sein. Diese erfolglosen Embryonen werden verworfen. In der Regel werden 5-8 Neuralrohrtransplantationen an einem Tag durchgeführt, und von diesen 80% sind erfolgreich. Gründe für eine erfolglose Neuralrohrtransplantation sind der Tod des Embryos aufgrund von Gewebeschäden, die während der Mikrochirurgie entstanden sind, oder das Versagen des Neuralrohrs, sich in den Wirtsembryon zu integrieren. Letzteres kann auf eine schlechte Platzierung des Neuralrohrs innerhalb des Wirts oder durch ein neuronales Rohr von schlechter Qualität aufgrund einer schlechten Dissektionstechnik oder durch übermäßige Exposition gegenüber Dissoziationsenzym zurückzuführen sein. Der erste Screening-Schritt sowie ähnliche spätere Untersuchungen für GFP+-Zellen sind nützlich, da dies bedeutet, dass Zeit und Ressourcen nicht durch Experimente an Embryonen verschwendet werden, die keine GFP-markierte NCC im Darm haben.
Abbildung 3 zeigt das Verfahren zur DiI-Injektion der Blutgefäße. Die Effizienz/Erfolg der DiI-Injektionstechnik hängt davon ab: erstens, die Injektionsnadel auf den optimalen Durchmesser für die zielgerichtete Vene zu schneiden, zweitens eine präzise Geste beim Einsetzen der Nadel in die Vene (also nicht durch die andere Seite zu durchbohren), und drittens, um zu vermeiden, dass die Nadel während der Injektion durch eine konstante Rate verstopft wird. Wenn einer dieser drei Parameter falsch ausgeführt wird, wird der Embryo ausbluten oder mehrere Stunden brauchen, um sich zu erholen, bevor ein zweiter Versuch unternommen wird, da die Blutung es fast unmöglich macht, sofort wieder injizieren zu können. Erfolgreiche Embryonen sollten sofort unter einem Stereofluoreszenzmikroskop ausgewählt und schnell seziert werden. Bei erfolgreichen Embryonen sind DiI-gekennzeichnete Blutgefäße im gesamten Embryo vorhanden (Abbildung 3C,D) einschließlich Kapillarbetten (Abbildung 3D).
Bei der Ernte von Embryonen und der Untersuchung von Gewebeabschnitten oder ganzen Typische Ergebnisse zeigen GFP+ NCC innerhalb des primitiven ENS und die feine Struktur der DiI-markierten Darm-Blutgefäßnetze (Abbildung 4) Ganzmontagepräparate können mittels konfokaler Mikroskopie untersucht werden, wobei Bildstapel dreidimensionale (3D) Rekonstruktionen erzeugen, die die Zusammenhänge zwischen den feinen Projektionen der GFP+ ENS-Zellen und dem DiI-gebeizten Gefäßsystem zeigen ( Abbildung4 A-C; G-I; Videos 1 und 2).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg"> Abbildung 1. Empfohlene Mikrochirurgie-Instrumente. (A) Mikroskalpell formiert aus einer Nähnadel. (B) feiner Arkansas-Stein zur Gestaltung eines Mikroskalpells. (C) a) gerade Schere, b) gebogene Schere, c) 5 ml Spritze mit 181,2 G hypodermischer Nadel, d) Kunststoffpipette, e) maßgefertigter Eierhalter, f) schwarze Tinte, g) quadratische Uhr Glas, h) quadratische Uhr Glas mit schwarzer Sylgard Basis, i) Mikro-Skalpell auf Nadelhalter, j) minutien Stifte, k) Minutien oder Wolframnadel auf Nadelhalter, l) Pascheff-Wolff Federschere, m) Dumont #5 Pinzette, n) perforiert Löffel, oi) kurze Feuer-gezogene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg"> Abbildung 2. Intraspecies Neuralrohrtransplantation. Kükenembryo/GFP Neuralröhrenbilder wurden von Delalande et al.modifiziert. 12. Die Vaskularisation ist für die Darmbesiedlung durch enterische Neuralkammzellen nicht notwendig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg"> Abbildung 3. Intravenöse DiI-Injektion. (A) Empfohlene Instrumente: a) CellTracker CM-DiI Tropfen auf Parafilm, b) gezogene Glasinjektionsnadel, c) Mundrohr. (B) Schematische Darstellung der intravenösen DiI-Injektion in E4 chimäre Kükenembryon. (C) in der intravenösen Injektion von ovo DiI mit feiner Glasnadel, die DiI enthält, die in die Vene (Pfeil) eingeführt wird. (D) E4 chimeric embryo post DiI injection (red) with GFP+ neural tube (arrow). (E) DiI gefärbtes Feines Blutgefäßnetz in einem lebenden Embryo, 24 Stunden nach der Injektion. Br: Gehirn; H: Herz; LB: Gliedmaßenknospe; A: Allantois. Die Bilder in (C) und (D) wurden von Delalande et al. 12 Die Vaskularisation ist für die Darmbesiedlung durch enterische neurale Kammzellen nicht notwendig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse im Magen und Caecum eines E5.5-Küken-Embryos. (A-C) 3dimensionale (3D) Rekonstruktion eines konfokalen Bildstapels im Bereich des Magens, der (D) die GFP+ enterischen Neuralkammzellen (ENCC) (E) das DiI-gefärbte Gefäßsystem und (F) ein zusammengeführtes Bild beider Netzwerke D-F histologische Abschnitte auf der Ebene des Magens zeigt (G) das GFP+ ENCC (H) das DiI-gebeiztes Gefäßsystem und (I) ein zusammengeführtes Bild beider Netzwerke D-F histologische Abschnitte auf der Ebene des Magens zeigt (G) das GFP+ ENCC (H) das DiI-gebeiztes Gefäßsystem und (I) ein zusammengeführtes Bild beider Netzwerke D-F histologische Abschnitte auf der Ebene des Magens, das (G) das GFP+ ENCC (H) das DiI-gebeiztes Gefäßsystem und (I) ein zusammengeführtes Bild beider Netzwerke zeigt. Kerne sind mit DAPI (Cyan) gefärbt. (G-H) 3D-Rekonstruktion eines konfokalen Bildstapels im Caecum-Bereich, der (A) die GFP+ ENCC-Migrationsfront in Grün, (B) das DiI-gebeiztes Gefäßsystem in Rot und (C) ein zusammengeführtes Bild beider Netzwerke zeigt. Bilder (A-F) wurden von Delalande et al.modifiziert. 12 Die Vaskularisation ist für die Darmbesiedlung durch enterische neurale Kammzellen nicht notwendig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg"> Abbildung S1. Isolierung eines Spenders GFP+ Neuralrohr aus dem umgebenden Gewebe durch enzymatische Verdauung und Mikrosektion. (A) GFP+ Neuralrohr und benachbarte Sos, die aus dem Spenderembryon seziert wurden. (B) Isoliertes Neuralrohr nach Pankreatinverdauung und Mikrosektion mit rostfreien Minutienstiften. Also: das ist so; NT: Neuralrohr; Nc: Notochord.
<img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg"> Video 1. 3-dimensionale 360°-Drehung des Bildes in Abbildung 4C, die das Gefäßsystem und das ENCC im Magen bei E5.5 (HH27-28) zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg"> Video 2. 3-dimensionale 360°-Drehung des Bildes in Abbildung 4I, die das Gefäßsystem und die ENCC-Migrationsfront im Bereich des Caecums bei E5.5 (HH27-28) zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen.</a>

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Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Hier berichten wir über die doppelte Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen mit KükenGFP Neuralröhre Intraspezies Transplantation kombiniert mit intravaskulären DiI-Injektion. Diese experimentelle Technik ermöglicht es uns, die Entwicklung des NCC-abgeleiteten (enterischen) Nervensystems und des Gefäßsystems während der Organogenese gleichzeitig zu visualisieren und zu untersuchen.

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

dual-labeling-neural-crest-cells-blood-vessels-within-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

8.0K Aufrufe.  UCL Institute of Child Health. Hier berichten wir über die doppelte Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen mit KükenGFP Neuralröhre Intraspezies Transplantation kombiniert mit intravaskulären DiI-Injektion. Diese experimentelle Technik ermöglicht es uns, die Entwicklung des NCC-abgeleiteten (enterischen) Nervensystems und des Gefäßsystems während der Organogenese gleichzeitig zu visualisieren und zu untersuchen. 

Serie: Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...