Neuralleistenzellen wandern aus kranialen Neuralfalten in Embryonen oder wenn sie in Kultur gebracht werden. Dies bietet eine bequeme Methode, um primäre wandernde Neuralleistenzellen ohne Zelldissoziation zu isolieren. Während die Neuralleistenmigration typischerweise innerhalb der dreidimensionalen embryonalen Umgebung stattfindet, ermöglicht die zweidimensionale Kultur die Visualisierung und Untersuchung migrationsbezogener Prozesse.
Obwohl kraniale neuronale Faltenkulturprotokolle existieren, erfordert diese Methode Training und organismusspezifische Schritte. Dieses Video zeigt Techniken, die die reproduzierbare Vorbereitung von kükenkranialen Neuralfaltenkulturen erleichtern. Anfänger haben oft Schwierigkeiten, neuronale Falten zu sezieren und zu plattieren und Kulturergebnisse zu bewerten.
Die Einhaltung der Dissektionsrichtlinien und die Anwendung der hier beschriebenen morphometrischen Analyse ermöglicht konsistente, quantitative Ergebnisse. Legen Sie zunächst die befruchteten Eier in eine aufrechte Position in einen befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius. Nachdem Sie die Eier aus dem Inkubator genommen haben, desinfizieren Sie die Schalen, indem Sie 70% Ethanol gründlich besprühen und trocknen lassen.
Verwenden Sie zum Fixieren und Färben der Kulturen Glasabdeckungsgläser, die in eine Multi-Well-Gewebekulturschale gelegt werden, und pipetten Sie genügend Fibronektinlösung, um den Boden der Vertiefung zu bedecken. Als nächstes ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte mit Fibronektinlösung in einem befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, während Sie Neuralfalten sezieren. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein kleines Loch in die Schale bei 1/4 bis 1/3 der Eilänge zu stechen.
Führen Sie die stumpfe Pinzette vorsichtig in das kleine Loch ein, um das Eigelb nicht zu stören. Dann schneiden Sie durch die Eierschale um das Ei, entfernen Sie die Oberseite der Eierschale und positionieren Sie den Embryo zur Isolierung. Bereiten Sie den Embryo vor, indem Sie vorsichtig den flachen Rand der geschlossenen stumpfen Pinzette verwenden, um überschüssiges Albumin auf der Oberfläche des Eigelbs, die den Embryo bedeckt, abzuwischen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Filterpapierträgerrahmen über den Embryo zu legen, wobei sich der Embryo im Fenster des Rahmens befindet. Drücken Sie vorsichtig auf das Filterpapier, um am Eigelb zu haften. Mit einer Sezierschere um die Außenseite des Filterpapierrahmens schneiden.
Verwenden Sie eine Pinzette oder Scherenspitzen, um den Rand des Rahmens zu greifen, und heben Sie den Embryo vorsichtig vom Eigelb weg. Legen Sie den Embryo mit dem Papierrahmen mit der Seite nach unten in eine 60- oder 100-Milliliter-Petrischale, die mit Ringers mit Pen-Streptokokken gefüllt ist. Halten Sie die Schale der Embryonen auf Eis, wenn Sie sie für eine RNA- oder proteinempfindliche nachgeschaltete Anwendung sammeln.
Einen Embryo in eine saubere Schale geben, die Ringers Streptokokkenlösung enthält. Schwenken Sie den Embryo vorsichtig hin und her, um das Eigelb zu entfernen, das die Sicht verdeckt, und tauschen Sie die Streptokokkenlösung des Ringers aus oder übertragen Sie sie in eine frische Schale, wenn sie trüb wird. Positionieren Sie den Embryo dorsal und die Rahmenseite nach oben unter einem Seziermikroskop.
Lassen Sie den Embryo auf dem Papierrahmen, um ihn gedehnt und an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie dann die Vitellinmembran mit einer Pinzette, um die Neuralfalten freizulegen. Schließen Sie kaudales Gewebe zu den expandierenden optischen Vesikeln und rostral zum Hinterhirn ein, wo Rhombomer-Verengungen gerade erst auftreten.
Schneiden Sie mit einer Federschere vorsichtig die Neuralfalten des Mittelhirns aus. Achten Sie darauf, den dorsalsten Aspekt der Neuralfalte mit minimaler Kontamination des Neuralrohrs und des nicht-neuralen Ektoderms zu entfernen, und übertragen Sie die Neuralfalten in eine saubere Schale, die Ringers Pen-Streptokokkenlösung enthält, mit einem P20-Pipettor oder einer sterilen Glaspasteur-Pipette, die mit Eigelb Ringers Pen-Streptokokken-Lösung gespült wurde. Sammeln Sie gesammelte Falten auf Eis und sezieren Sie zusätzliche Falten.
Nachdem Sie die Kulturschale aus dem Inkubator entfernt haben, verwenden Sie einen Pipettierer oder eine Pasteur-Pipette, um die Fibronektinlösung aus den Deckblättern, der Schale oder dem Brunnen zu entfernen. Nach dem Spülen des mit Fibronektin beschichteten Substrats mit Ringers Pen-Streptokokken-Lösung ein entsprechendes Volumen kompletter Nährmedien in die Schale oder Vertiefung geben. Um den Kunststoff zu blockieren und ein Anhaften des Gewebes zu verhindern, verwenden Sie einen P20- oder P200-Pipettor und spülen Sie die Pipettenspitze mit der Pen-Streptokokkenlösung von Yolky Ringer ab.
Übertragen Sie dann die isolierten Neuralfalten in Richtung der Mitte des mit Fibronektin beschichteten Deckstreifens und achten Sie darauf, so wenig Ringers Pen-Streptokokken-Lösung wie möglich zu übertragen. Nachdem Sie die Explantate 10 bis 15 Minuten ruhen lassen, legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 38 Grad Celsius, indem Sie die Kulturschale langsam und vorsichtig mit plattierten Neuralfalten tragen. Entfernen Sie die Nährmedien mit einer Pasteur-Pipette und spülen Sie die Vertiefungen mit filtersterilisiertem PBS ab.
Fügen Sie 4% Paraformaldehyd hinzu und halten Sie es 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattformschüttler. Am Ende der Inkubation Paraformaldehyd entfernen, die Vertiefungen dreimal mit PBS spülen und PBST mit 5% Serum hinzufügen. Pipettieren Sie nun 30 Mikroliter 200-Nanomolar Oregon Green konjugiertes Phalloidin auf eine glatte Oberfläche für jeden Deckschlicker.
Entfernen Sie mit einer Pinzette den Deckschleim aus dem PBST, der 5% Serum enthält, und stellen Sie sicher, dass die Zellen nach oben ausgerichtet sind. Überschüssige Flüssigkeit ableiten, indem Sie kurz den Rand des Deckblatts zu einem empfindlichen Arbeitswischer berühren. Legen Sie jede Deckzelle vorsichtig mit der Seite nach unten auf den Tropfen verdünntes Phalloidin und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Heben Sie nach der Inkubationszeit den Deckstreifen von der Färbelösung an und legen Sie ihn wieder in die Kulturschale, wobei Sie ihn umdrehen, so dass die Zellseite oben ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den Deckschein mit PBST abdecken, und legen Sie ihn 10 Minuten lang auf einen Plattformschüttler, wobei die Deckblätter abgedeckt und im Dunkeln gehalten werden. Entfernen Sie PBST und waschen Sie die Bezugsscheine zweimal für insgesamt drei 10-minütige Waschgänge.
Legen Sie einen Tropfen Montagemedien auf einen Objektträger. Montieren Sie die Abdeckungszelle mit der Seite nach unten, indem Sie den Abdeckungsschlicker langsam schräg auf das Montagemedium absenken, um Blasen zu vermeiden, und lassen Sie das Medium vor der Aufnahme absetzen. Bilden Sie schließlich die gefärbten Zellen ab und exportieren Sie sie als TIFF-Dateien.
Die Neuralleistenzellen begannen innerhalb von drei bis vier Stunden nach der Inkubation aus adhärenten Neuralfaltenexplantaten zu schlüpfen, und die Migration war nach etwa 20 Stunden abgeschlossen. Die wandernden Neuralleistenzellen wurden mit HNK-1 markiert, und die meisten Zellen schienen HNK-1-positiv zu sein. Die migrierten Neuralleistenzellen wurden durch Färbung von filamentösem Aktin mit Phalloidin sichtbar gemacht.
Bilder der Phalloidin-gefärbten Zellen wurden mit ImageJ verarbeitet, um ein Schwellenbild zu erzeugen, in dem Zellen schwarz mit weißem Hintergrund erschienen. Das Schwellenbild wurde analysiert und verschiedene Messungen in kontrastierenden Balkendiagrammen oder Geigendiagrammen dargestellt. Zum Beispiel betrug die durchschnittliche Fläche der 69 analysierten Zellen ungefähr 802,11 Quadratmikrometer, die von 60,27 bis 2.664,53 Quadratmikrometer reichten.
Die Zirkularität spiegelt die Protrusivität der Zelle wider und reicht von 0,101 bis 0,875. Die niedrigeren Werte zeigen eine längliche Form an, während ein Wert von eins einen perfekten Kreis anzeigt. Die meisten Zellen zeigten eine längliche Form, die am leichtesten in der Geigenhandlung zu sehen ist.
Wandernde Neuralleistenzellen in diesem Feld hatten ein durchschnittliches Seitenverhältnis von etwa 2,13, und ein Seitenverhältnis von eins zeigt eine symmetrische Form an. Sorgfältige Exzision und Explantierung sind entscheidend für erfolgreiche Kulturen. Lassen Sie die Neuralfalten 10 bis 15 Minuten lang mit der Seite nach unten abschneiden und übertragen Sie sie dann langsam in den Inkubator, um die Adhäsion zu fördern.
Variationen dieser Techniken umfassen vorübergehende genetische Manipulation vor der Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung während der Inkubation. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Sammlung von primären und wandernden Neuralleistenzellpopulationen für die Analyse auf Omics-Ebene.
