Dieses klar definierte Protokoll untersucht die primäre neurale Kammmigration bei Säugetieren. Wir verwenden die primäre neurale Kammmigration, um Geburtsfehler zu untersuchen, die den Neuralkamm beeinflussen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, einen genaueren Blick auf die neuronalen Kammzellen zu werfen, wenn sie aus der neuralen Platte entstehen.
Tests auf Zellverhalten in Geweben, die mutierte Gene tragen, verführeren oder nach pharmazeutischer Behandlung, ermöglichen Gesundheitsscreenings auf die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen oder Umweltveränderungen während der embryonalen Entwicklung. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um neuronale Kammzellen zu untersuchen, die in das Herz oder den Darm wandern, oder um metastasierende Tumorzellen zu untersuchen. Es ist eine Herausforderung, die Anatomie des Embryos richtig zu erraten.
Sein Gewebe ändert sich sehr schnell während der frühen Entwicklung. Wir schlagen vor, Mikrodissektion zu praktizieren, bevor sie ein großes Experiment durchführen. Da die Embryonen lebendig sind und dreidimensional, Geschwindigkeit und Präzision entscheidend sind.
Verwenden Sie am embryonalen Tag 8.5 sterile Werkzeuge und Lösungen, um die Gebärmutter in einen Behälter mit eiskaltem PBS zu ernten. Schneiden Sie das Mesometrium, um jeden Embryo zu trennen. Sezieren Sie die Gebärmutter sorgfältig und trennen Sie jede deziduale Schwellung.
Die Ernte des Embryos im richtigen Entwicklungsstadium ist entscheidend für die Verringerung der Variabilität und die Steigerung des Erfolgs bei der Haftung des Explantationsmittels an der Matrix sowie der Zellmigration. Schieben Sie Dierzange zwischen der Muskelschicht und dem Dezidualgewebe des Embryos und verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um die Muskelschicht zu entfernen. Verwenden Sie die Zange, um die Decidua an den Rändern des mesometrialen Ziehens zu durchbohren und verwenden Sie das zweite Zangenpaar, um das Gewebe senkrecht zum Zug zu reißen.
Schälen Sie das Dezidualgewebe mit den Zangen zurück, um die Ricarts-Membran zu visualisieren, bevor Sie die Membran vorsichtig entfernen. Das viszerale Eigelb wird sichtbar und der Embryo wird im Inneren beobachtet. Entfernen Sie das viszerale Eigelb und das Anion, und positionieren Sie den Embryo, um eine Visualisierung der Kopffalte zu ermöglichen.
Schneiden Sie die Kopffalte über dem Herzen und kratzen Sie das darunter liegende Mesoderm weg, um eine saubere neuronale Platte zu erhalten. Neuralplattengrenzen sollten dann seziert werden. Mit einer gläsernen Pasteurpipette die sezierte Neuralplatte auf eine hydrogelbeschichtete Schale übertragen, die mit konditioniertem Neuralkammmedium gefüllt ist, und wirbeln Sie die Schale sanft, um die neurale Platte in der Mitte des Brunnens zu positionieren.
Dann inkubieren Sie die neurale Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für den entsprechenden experimentellen Zeitraum. Legen Sie die Gewebekulturschale nach 24 Stunden nach der Expflanzung in den Probenhalter eines Gesichtskontrastmikroskops und kleben Sie den Plattendeckel und die Kohlendioxidnadel herunter, um ein Schütteln bei der Multi-Well-Erfassung zu verhindern. Konzentrieren Sie sich dann auf die kranialen neuralen Kammzellen bei einer 10-fachen Vergrößerung mit einem passenden Phasenring im ausgewählten Kondensator.
Um die Migrationskapazität der neuralen Kammzellen zu quantifizieren, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass alle fünf Minuten bei einer 10-fachen Vergrößerung ein Rahmen erfasst wird. Um die Zellmorphologie zu quantifizieren, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass ein Frame pro Minute bei einer 40-fachen Vergrößerung erfasst wird. Um die Dynamik der Lamellipodia zu quantifizieren, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es alle 10 Sekunden für 10 Minuten bei einer 40-fachen Vergrößerung einen Rahmen erfasst.
Für die Multi-Well-Bildgebung, stellen Sie die mechanische Bühne zwischen ausgewählten X, Y-Positionen von Interesse zu bewegen, und bestätigen, dass die Kranial-Neuralkammzellen im Fokus sind und dass die Bühnenpositionen korrekt sind. Klicken Sie dann auf Acquire, um die Zeitraffer-Bildgebung zu starten. Öffnen Sie für die Einzelzellenverfolgung Bild J, und importieren Sie die Daten als tiff-Stack-Dateien.
Ändern Sie die Ausrichtung und Helligkeit und Kontraststufen und klicken Sie auf Analysieren und Festlegen der Skalierung, um die Punkt-Stk-Dateien in Pixel-Mikrometern entsprechend den Mikroskopeinstellungen zu kalibrieren. Klicken Sie auf Plug-Ins, Tracking und manuelles Tracking, um das manuelle Bild-J-Zellenverfolgungs-Plugin zu öffnen und Track hinzufügen auszuwählen, um mit der Zellverfolgung zu beginnen. Verfolgen Sie dann Zellen durch alle Frames von Zeitrafferfilmen, indem Sie den Kern als Referenzpunkt verwenden.
Um die Migrationskapazität des neuronalen Kamms zu bewerten, öffnen Sie ein geeignetes Migrationsanalyse-Softwareprogramm, und klicken Sie auf die Registerkarte Daten importieren, um die Zellverfolgungsdaten als Punkt-Txt-Datei zu importieren. Wählen Sie unter Datensätze und Initialisierung die Anzahl der zu analysierenden Slices oder Frames aus, und legen Sie die X Y-Kalibrierung und das Zeitintervall zwischen Frames fest. Wählen Sie Einstellungen anwenden aus, um die Einstellungen zu speichern.
Wählen Sie dann das Diagrammdatensymbol aus, um Flugbahndiagramme zu bilden, und wählen Sie das Statistiksymbol aus, um die Entfernungs- und Geschwindigkeitsmessungen zu quantifizieren. Um den Zellkreis und die Zirkularität des neuronalen Kammzells zu quantifizieren, öffnen Sie Bild J und können Sie unter Analysieren und Festlegen von Messungen die Zellenformparameter, den Zellbereich, den Umfang und den Formdeskriptor auswählen. Verwenden Sie das Werkzeug zur freien Handauswahl, um manuell einen Umriss um jede Zelle zu zeichnen, indem Sie die Zellmembrangrenzen als Leitfaden verwenden.
Drücken Sie die Control+B-Tasten auf der Tastatur, um die Zellumriss-Overlay auf dem Bild beizubehalten und für jede Zelle über jeden Zeitrafferrahmen zu wiederholen. Klicken Sie auf Bild-Overlay, um den Interessenmanager zu erreichen, und wählen Sie die gewünschten Zellen aus. Klicken Sie dann auf Measure, um die Werte für die ausgewählten Zellformparameter von Interesse zu erhalten.
Innerhalb von 24 Stunden nach der Explantation und Kultur kann eine Region des präwandernden epitheliale Kranial-Neuralkamms deutlich beobachtet werden, um das neurale Plattenexplant zu umgeben. Darüber hinaus wird eine Subpopulation von neuralen Kammzellen epitheliale bis mesenchymale Übergang durchlaufen haben und erscheinen vollständig mesenchymal. Explant-Kulturen, die entweder auf einem extrazellulären Matrix-basierten Hydrogel oder Fibronectin plattiert sind, bilden ähnliche Explantationsstrukturen, die aus neuralen Vorwanderungs-Neuralkamm und wandernden neuralen Kammzellpopulationen bestehen.
Jedoch Explanten auf Fibronectin plattiert produzieren Zellen mit prominenter Lamellipodie an der Zellvorderkante scheinbar mehr polarisiert in Richtung der Migration. Die Zeitraffermikroskopie ermöglicht die Verfolgung von X-, Y-Koordinaten einzelner Zellen und die Analyse der neuralen Kammzellmigration und die Analyse der mikroialen Neuronkchenzellmorphologieim Im Laufe der Zeit. Durch die Umrissung einzelner Zellmembranen können Zellflächen- und Umfangsmessungen aus allen Frames der Filme berechnet werden, um die anschließende Quantifizierung der Zellfläche und zirkulathealität einzelner und Zellgruppen zu ermöglichen.
Beachten Sie, dass die Zell, wenn sie vom Explant wegwandern, signifikant zunimmt, während die Kreisförmigkeit der Zellen relativ konstant bleibt, was darauf hindeutet, dass Zellen, wenn sie von der Epithelkante abgehen und Zellzuzeichen an Zellkontakte verlieren, einen erhöhten Zellstreubereich aufweisen. Achten Sie besonders darauf, das zugrunde liegende Mesoderm wegzukratzen, um eine saubere neuronale Platte zu erhalten, da dies die Migration von neuronalen Kammzellen aus dem Gewebe fördert. Viele andere Techniken wie Immunfärbung, RTPCR oder Einzelzellanalyse können durchgeführt werden, um verschiedene Proteine oder Gene von Interesse unter verschiedenen Populationen von Kulturzellen zu analysieren.
Wir interessieren uns für die Entwicklungsrollen einiger wichtiger Neuroblastom-Gene, die an der Migration von neuronalen Kammzellen beteiligt sein könnten, und an der Verwendung dieses Ansatzes zur Untersuchung menschlicher Krankheitsgene.
