This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Alle hierin beschriebenen Experimente wurden von den lokalen Vorstand für Tierversuche von der Radboud Universität Nijmegen in Übereinstimmung mit niederländischen Gesetzen und Vorschriften (RU-DEC 2013-205) zugelassen. 1. extrazellulären Matrix-Gel-Spots <ol><li> Die folgenden Schritte werden einen Tag vor der Trennung: <ol><li> Auftauen eines Aliquots der extrazellulären Matrix-Gel (100 ul) bei 4 ° C für mindestens 1,5 Std. 1:10 verdünnen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium; 4.500 mg / l Glucose, 4 mM L-Glutamin und 110 mg / ml Natriumpyruvat (DMEM). Halten die extrazelluläre Matrix-Gel bei 4 ° C zu allen Zeiten. Hinweis: Plötzliche Temperaturänderungen werden in ungleichmäßigen Beschichtung und Kristallbildung führen. </li><li> Halten Sie das verdünnt extrazellulären Matrix-Gel-Lösung auf Eis für 15 min. </li><li> Pre-Chillen ein 20 &amp; mgr; l-Mikropipette für 10 min. </li><li> Legen Sie 8-Well-Kammer-Objektträgern in eine 100 mm Petrischale und übertragen Sie die Schale auf eine kalte Oberfläche (zB ein Kühlakku) für 10 min.</li><li> Verwenden Sie das vorgekühlte Mikropipette einen Tropfen von 10 ul der extrazellulären Matrix-Gel in jede Vertiefung setzen. Halten Sie die Petrischale auf der kalten Oberfläche für mindestens einen weiteren 7 min (Abbildung 1A). </li><li> Vollständig zu entfernen, die verbleibenden extrazellulären Matrix-Gel (1B), und trocknen Sie die Vertiefungen bei 37 ° C über Nacht. </li></ol></li></ol> 2. Dissection der Hauptmuskeln (Masseter, digastricus und Levator veli palatini) <ol><li> Vor ihrer Zerlegung, bereiten 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 2% Penicillin-Streptomycin (P / S) ergänzt. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nach Euthanasie eines jungen erwachsenen Ratten (9 Wochen) mit CO 2 / O 2, enthaupten den Kopf und entfernen Sie die Haut vom Kopf. Übertragen Sie den Kopf, um eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% P / S in ein 50 ml Röhrchen. </li><li> M. masseter (von der 1. Kiemenbogens abgeleitet) <ol><li> Platzieren Sie den Kopf mit einer Seite auf einem Silikon-Pad und befestigen mit Injektions needles (2A). </li><li> Identifizieren Sie die Ohrspeicheldrüse und der Gesichtsnerven (2A). Setzen Sie die tiefe Faszie Abdecken der Drüse. Schneiden Sie die Blende und entfernen Sie die Verschraubung mit Dissektion Schere. Identifizieren Sie den äußeren Gehörgang. Verfolgen Sie die Gesichtsnerven von den Foramen stylomastoideum und entfernen Sie vorsichtig die zeitlichen, Jochbein und Wangen Zweige mit einer Skalpellklinge No. 15. </li><li> Befreie die oberflächliche Kopf des M. masseter durch Entfernen der Blende. Identifizieren sowohl oberflächliche und tiefe Köpfe des M. masseter. Verfolgen Sie die oberflächliche Kopf, bis seine dicken Sehnen Aponeurose in den Processus zygomaticus der Maxilla eingesetzt. </li><li> Trennen Sie die Sehne von seinem Ursprung am Jochbein mit einer geraden Pinzette. Schneiden Sie es mit einer Skalpellklinge No. 15 oder Dissektion Schere und sorgfältig Leben es (2B). </li><li> Präparieren Sie die oberflächliche Kopf der masseter, bis seine Einführung am Winkel und schlechtere Hälfte ter Mantelfläche des Ramus des Unterkiefers mit einer Skalpellklinge No. 15 (Abbildung 2C). Nun, ganz den Muskel zu entfernen. </li></ol></li><li> Hintere Bauch des M. digastricus (aus der 2. Kiemenbogen abgeleitet) <ol><li> Platzieren Sie den Kopf in Rückenlage auf dem Silikon-Pad und befestigen mit Injektionsnadeln (3A). </li><li> Entfernen Sie das Unterhautfett, die über beide sublingual und submandibularis. Dann entfernen Sie den oberflächliche Faszie und Drüsen mit Dissektion Schere. Setzen Sie den M. digastricus (vordere und hintere Bauch). </li><li> Halten Sie den vorderen Sehne des hinteren Bauch mit einem geraden Pinzette, schneiden Sie es, und sezieren sie vorsichtig, bis seinen Ursprung in der Bulla tympanica (3B). Wiederholen Sie den Vorgang auf der Gegenseite. </li></ol></li><li> Levator veli palatini Muskel (ab dem 4. Kiemenbogen abgeleitet) <ol><li> Nach Präparation der hintere Bauch des M. digastricus, Lokalisieren M. stylohyoideus, ziehen Sie es seitlich, und ziehen Sie sie vorsichtig (4A). </li><li> Lokalisieren Sie die Sehne des Levator veli palatini, die an der Bulla tympanica (4A) einfügt. Sezieren sie sorgfältig und schneiden Sie es auf beiden Seiten. </li><li> Suchen Sie nach der Luftröhre und der Speiseröhre, die dahinter läuft. Heben Sie die Speiseröhre, und setzen die Rachen, Kehlkopf und den weichen Gaumen. </li><li> Lokalisieren Sie den Bereich des weichen Gaumens, wo die levator veli palatini eingesetzt und schneiden Sie es lose (4B). Hinweis: Direkt nach der Sektion, entfernen Sie vorsichtig Sehnen und Bindegewebe aus jeder Muskel unter dem Stereomikroskop. Tauchen Sie alle Proben schnell in Ethanol 70%, und sie auf eiskaltem PBS ergänzt 2% P / S in einem 15-ml-Tube. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung von Satelliten-Zellen <ol><li> Führen Sie die folgenden Vorbereitungsschritte für SC Isolation von 3 Muskelgruppen: <ol><li>Vorbereitung 7,5 ml 0,1% Pronase in DMEM. Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Filter. Vorwärmen der Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min vor der Isolierung. </li><li> Vorbereitung 35 ml DMEM mit 10% Pferdeserum (HS) und 1% P / S ergänzt. Auch vor, eine warme bei 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Vorbereitung 15 ml Kulturmedium, das aus DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS), 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt (CEE). Pre-warmen bei 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Vorstrich sechs Plastikpipetten (10 ml) mit HS und trocken für mindestens 10 min vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> In der Kultur Haube, übertragen jeden Muskel in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Mit Hilfe der Dissektion Schere, schnitt die Muskeln in kleine Stücke von etwa 2 mm. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu viel Blatt vor den Mund. </li><li> 2,5 ml 0,1% Pronase-Lösung sorgfältig auf jede weitere gut und bei 37 ° C für 60 min. Die Platte Schütteln Sie nach 20, 40 und 60 min. Hinweis: Die genaue duration der Inkubation ist abhängig von Faktoren wie Alter und Belastung der Tiere. </li><li> Überwachung unter dem Mikroskop. Überprüfen Sie die Muskelfragmente und stoppen die enzymatische Verdauung, wenn die Fasern Bündel einen gelockerten Aussehen (Abbildung 5). </li><li> Hinzuzufügen 2,5 ml DMEM, ergänzt mit 10% HS und 1% P / S. Transfer in ein 15 ml Zentrifugenrohr und die Rohre bei 400 xg für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren. </li><li> 5 ml DMEM mit 10% HS und 1% P / S ergänzt. Pipettieren der Lösung nach oben und unten mit einer 10 ml Kunststoffpipette (Verreibung) für mindestens 20 Mal, um das Gewebe zu homogenisieren. </li><li> Zentrifugieren der Röhren bei 200 g für 4 min. Sammeln Sie den Überstand und Überführung in eine 15-ml-Tube. </li><li> 5 ml DMEM mit 10% HS und 1% P / S ergänzt. Pipette wieder mit einer 10 ml Kunststoffpipette bis die Gewebefragmente verläuft leicht durch die Pipette. </li><li> Zentrifugieren der Röhren bei 200 g für 4 min und sammle den Überstand in ein 15 ml Röhrchen. </li><li> Put eine Zelle Sieb (40 &amp; mgr; m) auf ein 50-ml-Tube und den Überstand, der die dissoziierten Zellen auf den Filter. Mit 1 ml DMEM für maximale Erholung der Zellen zu waschen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 × g für 10 min und den Überstand verwerfen mit einer Pipette. </li><li> Das Pellet in 300 ul Kulturmedium und zähle die Zellen in einem Hämocytometer. </li></ol> 4. Differenzierung von Satellitenzellen auf extrazellulären Matrix-Gel-Spots <ol><li> Verdünne die Zellsuspension auf 1.5 x 10 3 Zellen in 10 ul Kulturmedium zu erhalten. </li><li> Die Abdeckungen der Kammern Folien mit Klebeband und markieren Sie die Stellen mit einem schwarzen Marker auf der Unterseite des Objektglas. </li><li> Mit einer Mikropipette, einen Tropfen von 10 ul Zellsuspension auf die extrazelluläre Matrix-Gel vor Ort. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Tropfen Zellsuspension korrekt auf der Stelle platziert. Inkubieren für 6 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Vorsichtigly werden 400 ul Kulturmedium (DMEM mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% CEE) und Inkubation für drei Tage bei 37 ° C. Hinweis: An dieser Stelle werden frisch isolierten SC zu massiven Trauma (enzymatischer Verdau und harte Verreiben) unterzogen und sie wiederherstellen müssen. Während der ersten drei Tage 37. Weiter die Zellen nicht stören, kann das Kulturmedium in Abhängigkeit von der Art des Experiments geändert werden. Die extrazelluläre Matrix Gelflecken mit hoher Zelldichte (1,5-2,5 x 10 3/20 ul) für die Differenzierung Assay ausgesät werden. Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt) kann alle drei Tage ausgetauscht werden. </li><li> Alternativ, wenn Erweiterung und Weitergabe ist erwünscht, befolgen Sie bitte folgende Schritte: <ol><li> Auftauen eines Aliquots der extrazellulären Matrix-Gel (500 ul) bei 4 ° C für mindestens 1,5 Std. Verdünnen 1:10 in DMEM und folgen Sie den Empfehlungen in Ziffer 1.1.1. </li><li> Pre-Chill eine 10 ml Pipette für 10 Minuten bei 4 &amp;# 176; C. </li><li> Bringen Sie drei T75-Kolben auf eine kalte Oberfläche (zB ein Kühlakku) für 10 min. </li><li> Verwenden Sie das vorgekühlte Pipette 1 ml extrazellulären Matrix Gel in jedem Kolben gegeben. Überprüfen Sie, dass die Oberfläche vollständig bedeckt ist. Halten Sie die Flaschen auf der kalten Oberfläche für mindestens einen weiteren 7 min (Abbildung 1A). </li><li> Vollständig zu entfernen, die verbleibenden extrazellulären Matrix-Gel mit einer 10 ml Pipette, und trocknen Sie die Vertiefungen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach dem Zählen resuspendieren frisch isolierten SCs in 10 ml Kulturmedium (DMEM mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt) ergänzt und in den Samen vorbeschichtet T75-Flaschen. </li><li> Nach drei Tagen, ändern Sie das Medium (und jeden dritten Tag), bis 80% Konfluenz erreicht ist. Für Passagieren, waschen Sie die T75-Kolben dreimal mit PBS. Next 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung und Inkubation für drei Minuten bei 37 ° C. Resuspendieren in 9 ml Kulturmedium (DMEM, supplementiert mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sund 1% Hühnerembryoextrakt) und zentrifugiert bei 200 g für 5 min. Überstand verwerfen. Nach dem Zählen resuspendieren 1 x 10 6 Zellen in 1000 ul des Kulturmediums und Einfrieren der Zellen. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SCs aus verschiedenen branchiomeric Kopf Muskeln wurden von einer 9 Wochen alten Wistar-Ratte und kultiviert direkt auf der extrazellulären Matrix-Gel-Spots ohne vorherige Expansion und Passagieren isoliert. Nach der Isolierung wurden die Zellen gezählt und ausgesät gleichzeitig Zelldichte. Für die parallele Isolierung von drei verschiedenen Muskeln, nimmt diese Methode etwa 4 Stunden. Kultur Kontamination zu vermeiden, ist ein entscheidender Schritt der schnellen Waschen in Alkohol 70% nach der Sektion der Muskeln. Während SC Isolierung ist es wichtig, die Muskeln in kleine Stücke (ca. 2 mm) geschnitten, aber vermeiden Sie zu viel Fleischwolf, da dies in einem kleinen Zellausbeute wegen der Zellschäden führen. Außerdem muß die Dauer der enzymatischen Verdauung genau unter dem Mikroskop überprüft werden, um weitere Schäden zu vermeiden. Das Ziel der Verdauung ist es, die Muskelfasern zu trennen. Da mehr als 90% der isolierten Zellen exprimieren Pax7, ist keine weitere Reinigung erforderlich ist (Figuren 6-8).Dies vermeidet zusätzliche Reinigungsschritte in anderen Verfahren wie Vorgalvanisierung auf unbeschichtetem Schalen 14,37,38, Fraktionierung auf Percoll 39,40 oder Fluoreszenz- oder magnetische Zellsortierung 41,43. Zum Zerreiben ist es wesentlich, Scherung zwischen den Gewebefragmente und die Öffnung der Pipettenspitze zu induzieren, weil damit die mechanische Freisetzung des SCs. Wenn das Verreiben mit einer 10 ml Pipette (Innendurchmesser-Tipp: 1 mm) ist es schwierig, ein 5 ml (Innendurchmesser Spitze: 2 mm) kann Pipette zuerst verwendet werden. Alternativ können Glaspasteurpipetten beim gewünschten Durchmesser geschnitten werden und verwendet werden. Dieses Verfahren ist einfach, effizient und ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von SC aus verschiedenen Muskelproben. Die Kulturplatten für SCs können mit Gelatine oder Kollagen überzogen sein, aber unsere früheren Studien zeigen, dass die extrazelluläre Matrix-Gel ist viel besser für die Aufrechterhaltung der myogenen Potential als Kollagen 38. Die extrazelluläre Matrix Gel FleckenMillimeter (10 ul / Ø 2 mm oder 20 &amp; mgr; l / Ø 4 mm) ermöglicht die Untersuchung der Proliferation und Differenzierung von SCs mit begrenzter Anzahl von Zellen. Zur Differenzierung Assay etwa 8 bis 20 mal weniger Zellen benötigt werden, verglichen mit einem 24-Well-Platte (Ø 15,6 mm) und etwa 80 bis 200 Mal weniger, verglichen mit 35 mm Petrischalen (Ø 35 mm) 14,38. Da extrazelluläre Matrix Gel teuer ist, ist dieses Verfahren auch kostengünstiger. Darüber hinaus kann die Kammer-Objektträgern von Plastikabdeckung ersetzt werden gleitet, um die Kosten weiter zu reduzieren. Zur Herstellung der extrazellulären Matrix Gelflecken Nacht Trocknen der Kammer gleitet wesentlich. Da die extrazelluläre Matrix Gelflecken transparent sind, ist es notwendig, die Punkte auf der Unterseite wieder mit Licht markieren. Die Kammern Träger werden in einer Petrischale für die einfache Manipulation fixiert. Weitere Zellkultur Erweiterung ist nicht erforderlich, was die Möglichkeit, die SCs von smal Studie bietetler Muskeln oder kleine Muskelproben. Alternativ können zB für PCR oder Muskel-Konstrukte, wenn mehr Zellen benötigt werden, können die frisch isolierten SCs ersten in T75-Flaschen erweitert werden, wie oben angegeben. SCs isoliert unter Verwendung dieses Protokolls sind nicht geeignet für die weitere Reinigung mit Durchflusszytometrie unmittelbar nach der Isolierung. Der Verdau mit Pronase bewirkt umfangreichen Verdauung der Oberflächenantigene 14. Pferdeserum und fötalem Rinderserum, das für die Zellkultur verwendet werden, müssen zuerst ordnungsgemäß vor der Isolierung gekennzeichnet werden, wie unterschiedlichen Chargennummern Myoblasten Proliferation und Differenzierung unterschiedlich betroffen. In den letzten Jahren gibt es ein wachsendes Interesse an den Muskeln der Kiemenbögen und Kopfmesoderm (zB die Augenmuskeln) 24 abgeleitet. Es hat sich deutlich gezeigt, dass Kopf- und Beinmuskeln sehr unterschiedliche Eigenschaften besitzen. M. masseter von alten Tieren scheint neuTain ihre Regenerationsfähigkeit im Vergleich zu den Beinmuskeln 25,26. SCs aus den Augenmuskeln besitzen eine robuste Proliferation und Differenzierung Kapazität vergleichbar mit SCs von Kopf Muskeln und zeigen ein größeres Potential als engraftment Extremität Muskel SCS 24. Der Fasertyp Verteilung und Myosin Zusammensetzung variiert zwischen den Muskelgruppen und auch zwischen den Arten. Muskeln Ursprung aus dem ersten Kiemenbogen im Menschen enthalten sowohl langsame als auch schnelle Fasern (Subtypen IIA und IIX), neonatalen Myosine und Myosine typisch für die Entwicklung von Herzmuskel. Bei Nagetieren diese Muskeln enthalten etwa 95% schneller Fasern Myosin IIa und IIb) 44-46. Untersuchungen an Hühner Muskeln zeigen, dass SCs aus verschiedenen Muskelfasertypen variieren in Differenzierungskapazität. SCs von schnellen Fasern nur in schnellen Muskelfasern zu differenzieren, während VZ von langsamen Fasern können in beide Fasertypen 47 zu differenzieren. Darüber hinaus ist der Anteil der SCs in schnellen MuskelFasern niedriger ist als in langsamen Muskelfasern 48,49. Dies zeigt an, dass der Fasertyp Verteilung zu berücksichtigen, für Studien über Muskeln im Gesichtsschädelbereich genommen werden. Ähnlich wie Gaumenspalte Muskeln, die LVP bei Nagern enthält fast ausschließlich schnellen Fasern 50. Aus diesem Grund sind SCs aus der LVP für präklinische Studien im Bereich der Gaumenspalte. Dieses Protokoll bietet neue Möglichkeiten, um SCs aus branchiomeric Kopf Muskeln oder andere kleinere Muskeln oder kleineren Muskeln Proben abgeleitet studieren. Dadurch wird die Entwicklung neuer Therapien erleichtern, um die Regeneration von Muskeln in der Kiefer- und Gesichtsbereich bei Zuständen wie Gaumenspalte, sondern auch in anderer Erkrankungen kleineren Muskeln zu verbessern.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Etwa 1: 500 bis 1: 1000 Neugeborene weisen eine Spalte, die die Lippe und / oder Gaumen (CLP); somit ist dies die häufigste angeborene Fehlbildung bei Menschen 1. Die Muskeln des weichen Gaumens sind entscheidend für das Funktionieren des weichen Gaumens beim Sprechen, Schlucken und Saugen. Wenn eine Spalte des weichen Gaumens vorhanden ist, werden diese Muskeln abnorm in das hintere Ende der Gaumenknochen eingesetzt. Der weiche Gaumen auf und ab bewegt beim Sprechen, Luft verhindert, durch die Nase zu entkommen. Kinder mit einer Spalte im Gaumen nicht über diese Steuerungsfunktion, was zu einem Phänomen, das als velopharyngeale Dysfunktion 2,3 bekannt. Obwohl die Behandlungsprotokolle sind variabel, chirurgische Reparatur des weichen Gaumens erfolgt im frühen Kindesalter (6-36 Monate alt) 4. Die abnorm eingefügt Muskeln des weichen Gaumens können chirurgisch korrigiert 5-7 werden jedoch weiterhin besteht velopharyngeale Dysfunktion bei 7% bis 30%der Patienten 2,3,8-10. Die Fähigkeit der Skelettmuskeln durch die Einwirkung von Satellitenzellen (SC) zu regenerieren ist gut etabliert, 11,12. Bei Muskelverletzung, SCs aktiviert und wandern zu der Stelle der Verletzung. Dann vermehren, differenzieren und zu verschmelzen, um neue Muskelfasern oder Reparatur beschädigten 13 zu bilden. Ruhe SCs Ausdruck der Transkriptionsfaktor Pax7 14,15, während ihre Nachkommen, die proliferierenden Myoblasten, zusätzlich die Bestimmung myogenen Faktor 1 (MyoD) 16 zum Ausdruck bringen. Differenzieren Myoblasten starten, um auszudrücken, Myogenin (MYOG) 17. Die terminale Differenzierung von Myoblasten durch die Bildung von Muskelfasern und der Expression muskelspezifischer Proteine ​​wie Myosin schwere Kette (MyHC) 16,18 gekennzeichnet. In letzter Zeit wurden mehrere Strategien in der regenerativen Medizin verwendet worden, um die Muskelregeneration von Beinmuskeln 19-23 verbessern. Spezifische Studien überbranchiomeric Hauptmuskeln sind auch wichtig, weil es wurde kürzlich gezeigt, dass sie von anderen Muskeln in mehreren Aspekten von 24 abweichen. Im Gegensatz zu den Beinmuskeln, wurde vorgeschlagen, dass branchiomeric Kopf Muskeln enthalten weniger VZ 25, regeneriert langsamer, und Bindegewebe wird nach der Verletzung 26 Darüber hinaus gebildet, wuchernden SCs aus branchiomeric Kopfmuskeln auch andere Transkriptionsfaktoren zum Ausdruck bringen. Beispielsweise wird Tcf21, ein Transkriptionsfaktor für kraniofazialen Muskelbildung stark Regenerieren Hauptmuskeln, aber kaum bei der Regeneration Beinmuskeln 25 ausgedrückt. Die Muskeln in den weichen Gaumen der CLP-Patienten sind in der Regel kleiner und weniger gut organisiert im Vergleich zu normalen Gaumenmuskulatur 27,28. Langsame und schnelle Fasern sind sowohl in den weichen Gaumen Muskeln vorhanden, aber die langsamen Fasern sind reichlich vorhanden. Im Gegensatz dazu enthalten Spalt Muskeln einen höheren Anteil an schnellen Fasern und auch eine reduzierte Kapillarzuführungim Vergleich zu normalen Gaumenmuskulatur 29-31. Schnellen Fasern sind anfälliger für Kontraktion induzierte Schädigung 31-33. Die begleitende schlechte kapillare Versorgung kann auch zu fördern Fibrose 34,35. All diese Aspekte können für die Armen Regeneration des weichen Gaumens Muskeln nach dem chirurgischen Verschluss Spalt 36 bei. Im Hinblick darauf ist ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von branchiomeric Kopf Muskel SCs entscheidend. Dies bietet die Möglichkeit, SC Biologie branchiomeric Kopf Muskeln zu studieren. Darüber hinaus können neue Therapien auf Basis von Tissue Engineering entwickelt, um die Muskelregeneration nach der Operation in CLP und andere Bedingungen zu riskieren, kraniofazialen Bereich zu fördern. Im Allgemeinen kann SCs nach Dissoziation von Muskelgewebe 14 erhalten werden. Mincing, enzymatische Verdauung, und Verreiben in der Regel erforderlich, um SCs aus ihrer Nische zu lösen. SCs können durch Pre-Plattierung auf unbeschichteten Gerichte 14,37,38 gereinigt werden, fractionation auf Percoll 39,40 oder Fluoreszenz- oder magnetischen Zellsortierung 41-43. Hier präsentieren wir eine neue wirtschaftliche und schnelle Protokoll zur Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopfmuskeln der jungen erwachsenen Ratten. Dieses Protokoll basiert auf einer früheren Manuskript 14 und speziell für kleine Gewebeproben angepasst basiert. Die Isolierung von SCs aus repräsentativen Muskeln aus der 1., 2., und 4. Kiemenbögen Ursprung beschrieben. Nach der Isolierung sind geringe Zahl von Satelliten-Zellen auf extrazelluläre Matrix-Gel-Spots von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Anforderung für den Ausbau und die Passage des SCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Mit diesem Protokoll, das M. masseter (eine Seite) ergibt 0,8-1 × 10 6 Zellen der M. digastricus (Venter posterior) ergibt 1,5-2 x 10 5 Zellen und levator veli palatini Muskel Erträge 1-1,5 x 10 5 Zellen. Zellausbeuten hängen von der Muskeltyp-Stamm und dem Alter des Tieres. Zum Vergleich zwischen den drei Muskelgruppen wurden frisch isolierte SCs gleichzeitig Zelldichte (1,5 x 10 3/10 ul) geimpft. Direkt nach der Isolierung von mehr als 90% der frisch isolierten Zellen exprimieren Pax7 (Abbildung 6). Tag 4, 7 und 10 Kulturen wurden mit Antikörpern gegen Pax7, MyoD, MYOG und MyHC Immunfärbung gefärbt. Fünf willkürliche Felder wurden pro Kultur mit einem 20x-Objektiv gezählt. Am Tag 4 Pax 7 und Myo D wird in allen Muskelgruppen zum Ausdruck (6 und 7 und 8), aber die Nachkommen SatCs vom masseter und M. digastricus Muskeln beginnen expressingen Myogenin früher als die levator veli palatini Muskel (Abbildung 9). Am Tag 10 wird die Expression MYOG stark in allen Gruppen reduziert werden (Abbildung 9). Ein paar Tage nach der Aussaat auf den extrazellulären Matrix-Gel-Spots, beginnen die wuchernden Zellen zu verschmelzen und bilden mehrkernigen Myotuben, die Myosin schwere Kette zum Ausdruck bringen. Kleine Myotuben sind am Tag 7 (Figur 10) sichtbar. Am Tag 10 kann Zucken der Myotuben zu beachten (Video 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Abb. 1: extrazelluläre Matrix-Gel-Spots in einer Kammer Schieber (A) für die einfache Handhabung, platzieren Sie den 8-Well-Kammerobjektträger in eine 100 mm Petrischale. Pipettieren Sie 10 ul der extrazellulären Matrix-Gel in jeder Kammer und legte sie auf einer kalten Oberfläche (7 min). (B) Kammer Folie, nach der überschüssige extrazelluläre Matrix gel wird entfernt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Abb. 2: Präparation des M. masseter (A) Kopf des Tieres in einer Seitenansicht. Ohr (E), Ohrspeicheldrüse (P) und Gesichtsnerv (VII). (B) Sehnen Aponeurose (Te) der oberflächlichen Kopf des M. masseter (Ms) und Schläfenmuskel (T). Trennen Sie die Sehne von seinem Ansatz mit einer Pinzette. (C) vorsichtig die Muskeln zu zerlegen, bis sein Einsetzen in den Ramus des Unterkiefers. E: Ohr, P: Ohrspeicheldrüse, VII: Gesichtsnerv, T: Schläfenmuskel, Ms: oberflächliche Kopf des M. masseter, Te: Sehnen, Mp: deep Kopf des M. masseter. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Abbildung 3: Dissektion der hintere Bauch des M. digastricus (.A) Kopf des Tieres in Rückenlage. Lokalisieren Sie den Unterkieferspeicheldrüse (Sg), M. masseter (M), Gesichtsnerv (VII) und M. sternocleidomastoideus (SCM). Entfernen Sie den Unterkieferspeicheldrüse. (B) Lokalisieren Sie den M. digastricus vorderen (AD) und hintere Bauch (PD). Mit einer geraden Zange nehmen Sie die vordere Sehne des hinteren Bauch, schneiden Sie es und sezieren sie vorsichtig, bis seinen Ursprung in der Bulla tympanica (ty). E: Ohr, Sg: Unterkieferspeicheldrüse, VII: Gesichtsnerv, M: M. masseter, SMC: M. sternocleidomastoideus, AD: vordere Bauch M. digastricus, PD: hintere Bauch M. digastricus, Ty: Bulla tympanica. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Abb. 4: Dissektion der levator veli palatini Muskel (A) Allgemeine Ansicht nach Präparation des M. digastricus (Venter posterior). M. stylohyoideus (St) und Sehne des Levatorveli palatini lokalisiert werden. Beachten Sie die Luftröhre (T) und der Speiseröhre (Es) dahinter läuft. (B) Nach dem Anheben der Luftröhre und die Speiseröhre des Rachens (P) ausgesetzt ist. Das Einsetzen des levator veli palatini in den weichen Gaumen ist jetzt sichtbar. Der Pfeil zeigt die seziert weichen Gaumens mit den levator veli palatini Muskeln auf beiden Seiten. E: Ohr, St: M. stylohyoideus, VII: Gesichtsnerv, M: M. masseter, AD: vordere Bauch M. digastricus, PD: hintere Bauch M. digastricus, T: Luftröhre, Es: Speiseröhre, P: Rachen, * levator veli palatini Muskel . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Abbildung 5: Darstellung des Muskelgewebes (A) vor und (B) nach der enzymatischen Digestion mit Pronase. Beachten Sie, dass Muskelbündel scheinen nach dem enzymatischen Abbau gelöst werden. Abbildung 6: Pax 7 Immunofärbung Frisch isolierte SCs, an extrazelluläre Matrix Gel am Ende der Isolierung aufgebracht (ungefähr 6 Stunden nach der ersten Gewebe Verdauung).. Fünf beliebige Körper wurden unter Verwendung eines 10X-Objektiv mit einem Durchschnitt von 210 Zellen pro Feld gezählt. Etwa 90% der Zellen sind Pax 7 positiv. DAPI: blau, Pax7: rot. Maßstabsbalken, 100 um. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Fig. 7: Pax 7, MyoD Immunofärbung Tag 4, 7 und 10 Kulturen wurden mit Antikörpern gegen Pax7 und MyoD Immunfärbung gefärbt. (A - C) und (D - F) Repräsentative Mikrophotographien von Tag 4 und 7 Kulturen von M. masseter. (G und H </strong&gt;) Die Anzahl der Pax7 + und MyoD + Kerne pro mikroskopischen Feld wurde gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl von Kernen (DAPI) ausgedrückt. DAPI: blau, Pax7: rot, und MyoD: grün. Scales bar, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Abb. 8: Verteilung der Pax7 ± / MyoD ± in Kulturen von mononukleären Zellen in Kulturen aus masseter, M. digastricus und levator veli Gaumenmuskel (A - C) Tag 4, 7 und 10 Kulturen wurden mit Antikörpern gegen Pax7 und MyoD Immunfärbung gefärbt. Die Gesamtzahl der Zellen an der Gesamtzahl von Kernen (DAPI) basiert. (D) Daten Quantifizierung Pax7 ± / MyoD ± cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Fig. 9: Myogenin Immunofärbung Tag 4, 7 und 10 Kulturen wurden mit Antikörpern gegen Myogenin gefärbt. (A - D) Repräsentative Mikrophotographien von Tag 4 und 7 Kulturen aus dem levator veli Gaumenmuskel. (E) Die Anzahl der Kerne pro MYOG + mikroskopischen Feld wurde gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl von Kernen (DAPI) ausgedrückt. (F) Daten Quantifizierung MYOG + Zellen. DAPI: blau, Myogenin: grün. Scales bar, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figur ansehen</a>e. <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Abb. 10: Myosin Heavy Chain Immunfärbung Tag 4, 7 und 10 Kulturen wurden mit Antikörpern gegen Myosin schwere Kette (MyHC) gefärbt. Repräsentative Mikrophotographien von Tag 4, 7 und 10 Kulturen vom digastric (DIG) Muskel. Am Tag 7 vorhanden sind kleine Myotuben, während am Tag 10 lange und gut organisierte Myotuben sind offensichtlich. Scales bar, 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Video 1:.. Myotube Zucken Beispiele für zwei repräsentative Felder mit zuck Myotuben für Tag 10 Kulturen von M. digastricus gezeigt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

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Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopf Muskeln über ein 9 Wochen alten Ratte. Die Muskeln aus unterschiedlichen Kiemenbögen. Anschließend werden die Satellitenzellen auf einem Spotlackierung von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Expansion und Passagieren von Satellitenzellen.

Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Aufrufe.  Radboud University Medical Center.  Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopf Muskeln über ein 9 Wochen alten Ratte. Die Muskeln aus unterschiedlichen Kiemenbögen. Anschließend werden die Satellitenzellen auf einem Spotlackierung von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Expansion und Passagieren von Satellitenzellen. 

Serie: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymaler Stromazellen Herzzellen von Endomyocardial bioptischen Proben von Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...