Name: isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
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Diese Arbeit wurde teilweise von einem Fund-A-Fellow-Stipendium der Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) und dem Scientist Development Grant von der American Heart Association (16SDG29320001) unterstützt.

Wildtype und Nestin-GFP-transgene Mäuse wurden in der Tierfabrik an der University of Minnesota untergebracht. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Minnesota genehmigt und waren im Einklang mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Muskel-Dissektion und Einzelzell-Isolation <ol><li> Euthanisieren erwachsene Mäuse (6-10 Wochen, männlich und weiblich) mit Tribromethanol (250 mg / kg, ip) und sterilisieren ihre Bauchhaut mit 70% Ethanol. HINWEIS: Tribromethanol wurde hier anstelle von Ketamin für Anästhesie / Euthanasie verwendet, da Ketamin bekannt ist, mit den NMDA-Rezeptoren zu interagieren, was möglicherweise Auswirkungen auf die Studie haben könnte. </li><li> Legen Sie die Mäuse in die Rückenlage und verwenden Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt auf der Bauchhaut zu machen. Ziehen Sie die Haut von Hand ab und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, um die Hinterbeinmuskeln auszusetzen. </li><li> CollecDie Muskeln von beiden Hinterbeinen mit Pinzette und Schere. Lagern Sie sie in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis. </li><li> Waschen Sie die seziertes Hindlimb-Muskeln in eiskaltem PBS, das mit 1% P / S zweimal ergänzt wird, und übertragen Sie es auf eine sterile 10 cm Platte. </li><li> Sorgfältig sezieren Nerven, Blutgefäße und Bindegewebe aus den Muskeln mit Pinzette und Schere unter einem Seziermikroskop bei 2facher Vergrößerung. </li><li> Die Muskeln in kleine Stücke (1-2 mm 3 ) mit sterilen Scheren und Klingen fein hacken und zerkleinern. Wenn nötig, füge eine kleine Menge Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht ausgetrocknet sind. </li><li> Mechanisch das Gewebe durch Pipettieren auf und ab durch eine 10 mL serologische Pipette 10 mal brechen. </li><li> Fügen Sie frisch hergestellte Verdauungslösung (DMEM, ergänzt mit 0,2% Typ 2 Kollagenase) zu der Mischung hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h mit GentlAufregung bei 35 Umdrehungen / min. </li><li> Triturat unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um die Mischung zu homogenisieren. Dann bei 500 xg für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und dann das Pellet in 0,25% Trypsin / EDTA resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zwei weitere Male. </li><li> Zugabe von 10 ml DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) zur Lösung und zentrifugieren bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in rotem Blutzellen-Lysepuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA) resuspendieren. </li><li> Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Sortierpuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA und 1% BSA in Ca / Mg 2+ -freiem PBS, pH 7,0). Filtriere die Mischung durch einen 40 μm-Zellsieb, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten. </li><li> Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Sortierpuffer resuspendieren. </li><li> Zähle dieZellzahl mit einem Hämocytometer und verdünnen die Einzeller-Suspension auf 5 x 10 6 / ml in Sortierpuffer. </li></ol> 2. Zellfärbung und Sortierung <ol><li> Bereiten Sie die Kontrollen und die Probe wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Färben Sie die Einzelzellsuspension mit den jeweiligen Antikörpern auf Eis für 30 min, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und die Pellets zweimal mit Sortierpuffer waschen. </li><li> Fügen Sie DAPI zu den Einzelzelllösungen hinzu, wie in Tabelle 1 angegeben. Verwenden Sie für die DAPI-Einfarbenkontrolle 5 μg / ml DAPI (Endkonzentration) und 1 μg / ml DAPI für die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle und die Probe. Halten Sie alle Röhren auf Eis während des Experiments. </li><li> Schalten Sie den Sortierer und die Software ein. Scannen und Einfügen eines 100 μm Sortierchips, wenn Sie dazu aufgefordert werden. </li><li> Führen Sie die automatische Einrichtung ( dh Chip-Ausrichtung, Tröpfchen-Kalibrierung, Seitenstrom-Kalibrierung und Sortierverzögerung KalibrierungOn) durch Laden der automatischen Setup-Perlen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. </li><li> Wenn das automatische Setup abgeschlossen ist, gehen Sie auf die Registerkarte &quot;Experiment&quot;, klicken Sie auf &quot;Neu&quot; und wählen Sie die &quot;Leere Vorlage&quot; aus &quot;Öffentliche Vorlagen&quot;. </li><li> Unter &quot;Messeinstellungen&quot; geben Sie &quot;DAPI&quot; für &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; für &quot;FL2&quot; und &quot;PDGFRβ&quot; für &quot;FL3&quot; ein. Deaktivieren Sie die Felder für &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li> Überprüfen Sie die Kästchen, um die 405, 488 und 561 Laser zu aktivieren und klicken Sie auf &quot;Neues Experiment erstellen&quot;. </li><li> Wählen Sie den &quot;Start Compensation Wizard&quot; -Option und folgen Sie den &quot;Compensation Wizard&quot; Software-Aufforderungen, um die Kompensation einzurichten. <ol><li> Laden Sie das ungefärbte Steuerelement und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Klicken Sie auf &quot;Detector &amp; Threshold Settings&quot; und stellen Sie die Sensorverstärkung der FSC- und BSC-Detektoren ein, um die Population auf die Waage zu stellen. </li><li> AnzeigeNur die Verstärkungsstufen der FL1-FL3 Fluoreszenzkanäle, um die negativen Populationen auf der linken Seite der Histogramme zu platzieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. </li><li> Laden Sie einfarbige Kontrollen eins nach dem anderen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf &quot;Start und Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. Passen Sie die Tore für die positiven Populationen an den Histogrammen an. Weiter klicken.&quot; </li><li> Gehen Sie auf &quot;Matrix berechnen&quot; auf der Registerkarte &quot;Kompensation&quot; und klicken Sie im Feld &quot;Berechnungsberechnung berechnen&quot; auf &quot;Berechnen&quot;, um die Kompensation durchzuführen. Klicken Sie auf &quot;Finish&quot;, um den &quot;Compensation Wizard&quot; zu verlassen. </li></ol></li><li> Laden Sie das PDGFRβ-PE-FMO-Steuerelement und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Zeichnen Sie ein Polygon-Tor (Gate A) um die Zellen von Interesse unter dem &quot;All Events&quot; -Plot. </li><li> Doppelklicken Sie auf Gate A, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die Y-Achse in DAPI und zeichnen Sie ein Polygon-Gate (Gate B) um lebende (DAPI- low ) Zellen. Doppelklicken Sie auf iNside Gate B, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse in FSC-H und die Y-Achse in FSC-W und ziehen Sie ein Polygon-Gate (Gate C) um die Singlets, um Dubletten zu eliminieren. </li><li> Doppelklicken Sie auf Gate C, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse zu Nestin-GFP und die Y-Achse zu PDGFRβ-PE. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. </li><li> Laden Sie die Probe und wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.12. Nach der Aufnahme klicken Sie auf &quot;Pause&quot;, um das Sample zu behalten. </li><li> Definieren Sie die Gating-Grenzen für PDGFRβ + und Nestin-GFP + -Zellen auf Basis der PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle. Zeichnen Sie Tore für die PDGFRβ + Nestin-GFP- und PDGFRβ + Nestin-GFP + Populationen. </li><li> Unter &quot;Sortiermethode&quot; wählen Sie &quot;2-Wege-Tubes&quot; und weisen &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP-&quot; - und &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; Zellen den linken und rechten Sammelröhren zuGesund Montieren Sie die Sortierpuffer-gefüllten 15 ml Sammelröhrchen auf der Sammelstufe und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Sammlung laden&quot;. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Fortsetzen&quot;, um das Sample zu beenden. Klicken Sie auf &quot;Start Sort&quot;, um PDGFRβ + Nestin-GFP - (Typ I Perizyten) und PDGFRβ + Nestin-GFP + (Typ II Perizyten) Zellen zu sammeln. </li></ol> 3. Nachsortierung von Analysen <ol><li> Die sortierten Zellen bei 500 xg für 5 min zentrifugieren, das Pellet in 1 ml Pericyt- Medium resuspendieren (siehe Materialtabelle ) und die Zelldichte mit einem Hämocytometer zählen. </li><li> Samen Typ I und Typ II Perizyten auf Poly-D-Lysin (PDL) -beschichtete Deckgläser bei ~ 1 x 10 4 Zellen / cm 2 . In Perizy-Medium für 3 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 wachsen. </li><li> Am Tag 3 untersuchen Sie die Perizy-Morphologie (unter Phasenkontrast) und die endogene Nestin-GFP-Expression mit einem fluoreszierenden MikroUmfang (Anregungslaser: 488 nm, Anregungsfilter: 470/40 nm und Emissionsfilter: 515/30 nm). Nehmen Sie Bilder unter einem 20X Ziel (0.45 NA). </li><li> Ersetzen Sie das Pericyt-Medium durch adipogene (Maus-MSC-basale Medium + adipogene stimulatorische Ergänzung) und myogenes (DMEM + 2% Pferdeserum) Medium, um adipogene und myogene Differenzierung zu initiieren, wie zuvor beschrieben 20 . Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Fixieren Sie die Zellen am Tag 17 (14 Tage nach adipogener / myogener Differenzierung) in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Vorsicht, PFA ist ein Karzinogen. </li><li> Führen Sie die Immunzytochemie gegen Perilipin (Adipozytenmarker) und S-Myosin (reifer Myotube / Myofaser-Marker) durch, wie in früheren Publikationen 19 , 20 beschrieben. <ol><li> Die festen Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Blockierpuffer hinzufügen (PBSErgänzt mit 5% Eselserum, 3% BSA und 0,3% Triton X-100) und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Perilipin (2 &amp; mgr; g / ml) und / oder Anti-S-Myosin (2 &amp; mgr; g / ml) Antikörper bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa 555 Esel Anti-Kaninchen (4 μg / ml) und / oder Alexa555 Esel Anti-Maus (4 μg / ml) Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Montieren Sie die immunfärbenden Zellen mit dem DAPI enthaltenden Befestigungsmedium (siehe Tabelle der Materialien). Untersuchen Sie die Perilipin- und S-Myosin-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, 540/45 nm Anregung und 600/50 nm Emission) und nehmen Sie Bilder unter einem 40X-Objektiv (0,60 NA) auf. </li></ol></li></ol>

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Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt zur Offenlegung.

Perizythen sind multipotenten perivaskulären Zellen 22 , 23, die sich auf der abluminalen Oberfläche der Kapillaren 21 , 26 befinden . In Skelettmuskeln können Perizyten entlang der adipogenen und / oder myogenen Wege 19 , 20 , 24 differenzieren. Jüngste Studien zeigten zwei Subpopulationen von Perizyten mit...

Muskeldystrophie ist eine Muskel-degenerative Erkrankung, die bisher keine wirksamen Behandlungen hat. Die Entwicklung von Therapien, die die Geweberegeneration fördern, war schon immer von großem Interesse. Geweberegeneration und Reparatur nach Schädigung hängen von residenten Stammzellen / Vorläuferzellen ab 1 . Satellitenzellen sind myogene Vorläuferzellen, die zur Muskelregeneration beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre begrenzte Migration und niedrige Überlebensrate nach der Injektion sowie durch ihre verminderte Differenzierungsfähigkeit nach in vitro Verstärkung 8 , 9 , 10 , 11 behindert. Zusätzlich zu satelliTe-Zellen, Skelettmuskeln enthalten auch viele andere Zellpopulationen mit myogenem Potenzial 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , wie Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitielle Zellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Muskel-abgeleitete PDGFRβ + -Zellen in der Lage sind, sich in myogene Zellen zu differenzieren und die Muskelpathologie und die Funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 zu verbessern. PDGFRβ dominiert überwiegend Perizyten 21 , die perivaskuläre Zellen mit Pluripotenz 22 , 23 sind . Zusätzlich zu PDGFRβ werden auch viele andere Marker, darunter Neuron-Glial 2 (NG2) und CD146, verwendetZirbeln 21 Es ist jedoch zu beachten, dass keiner dieser Marker pericytspezifisch ist. Jüngste Studien zeigten zwei Subtypen von Muskelpericyten, genannt Typ I und Typ II, die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Funktionen ausführen 19 , 24 , 25 . Biochemisch sind Typ I Perizyten NG2 + Nestin - , während Typ II Perizyten NG2 + Nestin + 19 , 24 sind . Funktionell können Typ I Perizyten adipogene Differenzierung unterliegen, was zur Fettansammlung und / oder Fibrose beiträgt, während Typ-Periziten des Typs II entlang des myogenen Weges differenzieren können, was zur Muskelregeneration 19 , 24 , 25 beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass: (1) Typ I Perizyten kann bE in der Behandlung von fetthaltigen degenerativen Störungen / Fibrose gezielt, und (2) Typ II Perizyten haben ein großes therapeutisches Potential für die Muskeldystrophie. Eine weitere Untersuchung und Charakterisierung dieser Populationen erfordert ein Isolationsprotokoll, das die Trennung von Typ I und Typ II Perizyten auf einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht. Derzeit besteht die Isolierung von Pericyt-Subpopulationen auf NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen 19 , 24 . Die Verfügbarkeit von NG2-DsRed-Mäusen und die Qualität der meisten NG2-Antikörper begrenzen die weit verbreitete Anwendung dieser Methode. Da alle NG2 + pericytes auch PDGFRβ in den Skelettmuskeln 19 , 20 , 24 exprimieren, wird vermutet, dass NG2 durch PDGFRβ zur Isolierung von Perizyten und deren Subpopulationen ersetzt werden kann. Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, dasVerwendet PDGFRβ-Färbung und das Nestin-GFP-Signal. Diese Methode ist weniger anspruchsvoll für die Ermittler, weil: (1) es nicht den NG2-DsRed-Hintergrund erfordert und (2) es verwendet kommerziell erhältliche PDGFRβ-Antikörper, die gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ermöglicht es die gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten in hoher Reinheit, was eine weitere Untersuchung der biologischen und therapeutischen Potenziale dieser Pericyt-Subpopulationen ermöglicht. Nach der Reinigung können diese Zellen in Kultur gezüchtet werden, und ihre Morphologien können sichtbar gemacht werden. Diese Arbeit zeigt auch, dass Typ I und Typ II Perizyme, die nach dieser Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus doppelt-transgenen Mäusen gereinigt wurden, adipogene und myogene sind.

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;-PE Antibody</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antibody</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antibody</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit antibody&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

Pericytes sind perivaskuläre multipotenten Zellen, die Heterogenität in verschiedenen Organen oder sogar innerhalb desselben Gewebes zeigen. In Skelettmuskeln gibt es mindestens zwei pericyte Subpopulationen (genannt Typ I und Typ II), die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten aufweisen. Unter Verwendung von NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen wurden Typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) und Typ-II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) Perizyten erfolgreich isoliert. Die Verfügbarkeit dieser doppelt-transgenen Mäuse verhindert jedoch die weit verbreitete Anwendung dieser Reinigungsmethode. Diese Arbeit beschreibt ein alternatives Protokoll, das die einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Technik und zielt auf PDGFRβ und nicht auf NG2 zusammen mit dem Nestin-GFP-Signal. Nach der Isolation geben Sie I und ty einPe II pericytes zeigen deutliche Morphologien. Darüber hinaus sind Typ I und Typ II Perizyte, die mit dieser neuen Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus den doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, adipogen und myogenisch. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um pericyte Subpopulationen aus Skelettmuskeln und möglicherweise aus anderen Geweben zu isolieren.

FACS-Parameter, einschließlich Laserintensität und Kanalkompensation, werden auf der Grundlage der Ergebnisse der ungefärbten Steuerung und der einfarbigen Steuerung korrigiert. Die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle wird verwendet, um das Gating für die PDGFRβ-PE + -Population einzustellen (Abbildung 1A ). Unter den PDGFRβ-PE - Zellen sind zwei Populationen, die Nestin-GFP + und Nestin-GFP - Zellen darstellen, klar ge...

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Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Aufrufe.  University of Minnesota.  Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. 

Serie: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biologie

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Medizin

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells (MuSCs) have the ability to make new muscle, whereas fibro-adipogenic progenitors (FAPs) contribute to stromal supporting tissues and have the ability to make fibroblasts and adipocytes. Both MuSCs and FAPs reside in a state of prolonged reversible cell cycle exit, called quiescence. The quiescent state is key to their function. Quiescent stem cells are commonly purified from multiple muscle tissues pooled together in a single sample. However, recent studies have revealed distinct differences in the molecular profiles and quiescence depth of MuSCs isolated from different muscles. The present protocol describes the isolation and study of MuSCs and FAPs from individual skeletal muscles and presents strategies to perform molecular analysis of stem cell activation. It details how to isolate and digest muscles of different developmental origin, thicknesses, and functions, such as the diaphragm, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), and the masseter muscles. MuSCs and FAPs are purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and analyzed by immunofluorescence staining and 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay.

This protocol describes the isolation of muscle stem cells and fibro-adipogenic progenitors from individual skeletal muscles in mice. The protocol involves single muscle dissection, stem cell isolation by fluorescence activated cell sorting, purity assessment by immunofluorescence staining, and quantitative measurement of S-phase entry by 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine incorporation assay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...