The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die akute lymphatische Leukämie-Zelllinie NALM6 sondern kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden. 1. Lösungen und Reagenzien <ol><li> Komplettes RPMI <ol><li> Hinzuzufügen 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml von 200 mM L-Glutamin in einer 500 ml Flasche mit RPMI-1640-Medium. </li></ol></li><li> BrdU-Stammlösung <ol><li> Vorbereitung 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS). </li></ol></li><li> BrdU komplettem RPMI <ol><li> In 6,2 ul der BrdU-Stammlösung zu 10 ml vollständigem RPMI. </li></ol></li><li> DNase-Lösung <ol><li> Bereiten Sie 1 mg DNase / ml in DPBS. </li></ol></li><li> Färbepuffer <ol><li> Vorbereitung 3% hitzeinaktiviertem FCS und 0,09% Natriumazid in DPBS. </li></ol></li><li> Siehe Materialliste für Definitionen der Fixation Buffer, Permeabilisierung Puffer und Waschpuffer. </li></ol> 2. Zellen Neinte: Die Zellen waren nicht für mehr als 6 Monate kultiviert. Dieses Verfahren ist direkt anwendbar zu jeder nicht-adhärenten Zelllinie mit Anpassungen der Zelldichte und Kulturmedien. Zellen einzusetzen, die exponentiell zu Beginn des Experiments wachsen. <ol><li> Pflegen NALM6 Zellen in T-75 Kulturflaschen in komplettem RPMI. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen mit einem Klasse II Biosicherheitswerkbank. <ol><li> Aufrechtzuerhalten NALM6 Zellen zwischen 1-2 x 10 6 Zellen pro ml durch Aufteilung der Kultur dreimal wöchentlich. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft. </li></ol></li></ol> 3. Pulse Markierung von Zellen mit BrdU VORSICHT: Gehen Sie BrdU mit Sorgfalt, da es eine potentielle mutagen und teratogen. <ol><li> Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min. Hinweis: Übertragen von Zellen in frischem Medium verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. </li><li> Durchführen einer Zellzahl und resuspendieren Zellen in komplettem RPMI mit 2 × 10 6 cEllen / ml. </li><li> Verdünnte Zellen 1 in 2 mit BrdU komplettem RPMI Herstellung einer endgültigen Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 45 min, dann verdünnt 1 in 10 Zellen mit komplettem RPMI. Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min und sorgfältig berücksichtigen keines der überstehenden Flüssigkeit. </li><li> Die Zellen in einem kleinen Volumen (~ 100 &amp; mgr; l) von kompletten RPMI Führen einer Zellzahl und anpassen, um 1 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Pipette 1 ml der Zellen in die Vertiefungen einer 48 Well-Platte. Pipette 1 ml DPBS in jede unbesetzte Brunnen, mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft für die gewünschten Zeitpunkte, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24 Stunden. Anmerkung: Die Länge der Zeit ab, was die Versuchsanordnung zielt darauf ab, zu messen abhängen. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen in FACS-Röhrchen mit einer Pipette. Die auch nacheinander mit 1 ml volu Spülenmes von PBS zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 5 ml. </li><li> Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig alle den Überstand. Zellen sind bereit für die Färbung, führen Sie diese (Abschnitt 4) sofort. </li></ol> 4. Zellfärbung Anmerkung: Wenn eine Oberflächenfärbung von Zellen erforderlich zuführen es vor der Fixierung, so dass die Zellen bei 4 ° C durchgehend beibehalten. <ol><li> Die Zellen in 100 ul Färbepuffer (für optionale Oberflächenfärbung, fügen Sie die empfohlenen Volumen von Antikörper gegen Oberflächenantigene und Inkubation für 30 min bei 4 ° C). </li><li> 1 ml der Färbepuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen. Hinweis: Spezifische Antikörper, Konzentration, Inkubationszeit usw. in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Ziele variieren. </li><li> Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Die Zellen in 100 ul Puffer Fixierung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml of Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul Permeabilisierung Puffer und Inkubation der Zellen für 10 Minuten auf Eis. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul Puffer pro Röhrchen Fixierung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen. Hinweis: Das Protokoll kann hier bei Bedarf angehalten werden. Die fixierten Zellen werden bei 4 ° C mehrere Tage lang stabil, wenn sie in Färbepuffer resuspendiert. Entfernen Sie die Färbepuffer nach der Zentrifugation, bevor Sie fortfahren. </li></ol></li><li> DNase-Behandlung <ol><li> Die Zellen in 100 ul DNase-Lösung (30 ug DNase / 10 6 Zellen) und inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen. </li&gt; </ol></li><li> Antikörper-Färbung Anmerkung: Die Färbung für andere als BrdU intrazellulären Marker können gleichzeitig mit der BrdU-Färbung durchgeführt werden. <ol><li> WICHTIG: Bereiten Kompensationskontrollen, bestehend aus ungefärbten Zellen und Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom markiert. Idealerweise verwenden die gleichen Antikörper für die Entschädigung Kontrollen, wie sie in der experimentellen Röhren verwendet. Wenn dies jedoch nicht möglich ist, ersatz Antikörper stark exprimierten Antigene auf den gleichen Fluorochrom konjugiert ist. </li><li> Die Zellen in 50 ul Waschpuffer und fügen 1 ul / 10 6 Zellen von BrdU-Antikörpers. Anmerkung: direkt konjugierten Antikörpern gegen andere spezifische intrazelluläre Antigene können ebenfalls zugegeben werden. HINWEIS:. Antikörper gegen Histon H3 an Ser10 phosphoryliert kann zwischen den Zellen in der G2 und M zu unterscheiden ist phosphoryliert Histon H3 an Ser10 während der Mitose 10 Antikörper gegen cdc2 phosphoryliert am Tyr15 verwendet, um Zellen zu detektieren have Mitose verpflichtet. 11 </li><li> Inkubieren der Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge Zellen bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Stain DNA für Zellzyklusanalyse <ol><li> Lösen Pellet und fügen Sie 20 ul der 7-AAD-Lösung (0,25 ug). Anmerkung: Es ist wichtig, eine konstante Menge von 7-AAD / Zelle zu verwenden. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Färbepuffer. </li></ol></li></ol> 5. Sammlung von Durchflusszytometrie Daten Der benötigte hängt von der Anzahl und Art der verwendeten Fluorochromen abhängen Maschine. <ol><li> Sammeln Sie die folgenden Parameter: FSC-A, SSC-A, FSC-H und 7-AAD-Fluoreszenz auf einer linearen Skala (FSC-W kann anstelle von FSC-H verwendet werden). Sammeln Sie die APC-Kanal auf einer logarithmischen Skala. Sammeln Sie alle zusätzlichen Kanäle für die Beurteilung der Oberfläche und im Inneren von Etiketten mit einer logarithmischen Skala erforderlich. </li><li> Führen comKompensation von überlappenden Signalen in vor der Analyse der Proben zwischen verschiedenen Fluorochromen Emissionsspektren beobachtet. Hinweis: Die meisten Durchflusszytometer wird dies automatisch durchführen. </li><li> Sammeln Sie mindestens 10.000 Ereignisse für jede Probe. </li></ol> 6. Analyse der Durchflusszytometrie Daten Anmerkung: FlowJo wurde in dieser Studie für die Strömung verwendet Zytometrie Datenanalyse, sondern auch andere Softwarepakete können ebenfalls verwendet werden. Die Gating-Strategie ist in Figur 1 veranschaulicht. <ol><li> Identifizieren Sie die Lebendzellpopulation mit FSC-A und SSC-A-Parameter. </li><li> Innerhalb dieser Population auszuschließen Dubletten und Aggregate mit FSC-A und FSC-H (FSC-W kann natürlich auch verwendet werden). </li><li> Innerhalb dieser Population eingestellt ein Punkt-Diagramm mit 7-AAD auf der x-Achse und BrdU-APC auf der y-Achse. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> Abbildung 1: Gating-Strategie Left pa.nel: ungated Zellen auf einem FCS-A vs. SSC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die lebensfähige Zellpopulation wird durch die gezeigte Gate identifiziert. Mitteltafel: Zellen aus dem linken Fenster gated auf einer FSC-A vs. FSC-H-Punktediagramm (FSC-W kann anstelle der Höhe verwendet werden) gezeigt. Dubletts und Aggregate werden identifiziert und durch die gezeigte Gate ausgeschlossen. Rechts: Zellen aus dem Wams Ausschlussdatum in der Mittelplatte gated sind auf einem 7-AAD vs. APC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die BrdU-Antikörper wird mit APC, die die Identifizierung von Zellen, die BrdU während des Puls-Markierung inkorporiert haben markiert. 7-AAD bietet Informationen über die DNA-Gehalt. Die obere Gate definiert Zellen positiv für BrdU und damit in die S-Phase zu der Zeit des BrdU Puls, der unteren linken Tor, Zellen in G 0/1 und der rechten unteren Gate jene in G 2 / M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.</a> <ol start="4"><li> Cell Cycle A<html> nalyse <ol><li> Öffnen der ersten Datendatei und Gate auf die Zellen in dem Dublett Ausschluss Gate. </li><li> Analysieren Sie diese Bevölkerung für Zellzyklus-Verteilung (unter Plattformen in FloJo Software befindet) und verwenden Sie die Dean-Jett-Fox-Modell. </li><li> Besorgen Sie sich die Positionen der G 0/1 und G 2 / M mit Spitzen erstellen Tore. </li><li> Tor auf der BrdU-positiven Zellen und unterliegen diese Bevölkerung zu gleichen Zellzyklusanalyse. </li><li> Stellen die Positionen der G 0/1 und G 2 / M-Spitzen, die durch die Anwendung der gleichen Toren aus schaffen Gatter und Einstellen Bedingungen (mit den Gates angelegt) für die Positionen der G 0/1 und G 2 / M Spitzen. Dies wird in den ersten 2 Platten der Fig. 2 dargestellt Hinweis: andere Software kann auch verwendet werden, um die Daten zu analysieren, und die Anweisungen würden entsprechend variieren. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Fig. 2: Zellzyklusprogression Die erste Platte (alle Zellen) auf der Zellpopulation durch das Dublett Ausschluss Gate definiert sucht. Diese Population wurde in einem Histogramm auf der X-Achse 7-AAD angezeigt. Der Peak der G 0/1 Peak durch den Pfeil unter der Achse angegeben. In den Folgeplatten BrdU-positiven Zellen wurden auf gated wie in Abbildung 1 dargestellt. Der Wert für das G 0/1 Position erreicht, wenn Gating des Dubletts Ausschluss Gate mit der BrdU positive Zellen in gated FlowJo Zellzyklus-Software angewendet. Jeder nachfolgende Tafel wurde auf der BrdU-positiven Population gated wie in Figur 1 und der Position der G 0/1 Peak, basierend auf der erhaltenen bei der Analyse der Gesamtbevölkerung in den ersten zwei Platten gezeigt Wert dargestellt. Verwendung des BrdU negative Fraktion, um die Position des G 0/1 Population für die BrdU-positiven Zellen in demselben samp identifizierenle steuert für leichte Unterschiede in der Intensität der DNA-Färbung zwischen den Proben. Die Zahl auf jeder Tafel gezeigt ist, stellt die Zeit seit dem BrdU puls beendet. Die berechneten Zellzyklus-Phasen werden in schattierten grün dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Die Fähigkeit, den Zellzyklus zu analysieren ist wichtig für das Verständnis der Krebsbiologie und den Wirkmechanismus beider Medikamente und Gene, die die Zellproliferation und das Wachstum beeinflussen. Zwar gibt es eine Vielzahl von Assays, welche angeblich die Zellproliferation zu messen, wird nur die Mehrheit ein Maß, daß die Anzahl Zellen vorhanden angibt. Dazu gehören Tests, die Zellzahl durch direkte Visualisierung und Zählen, Stoffwechselaktivität oder ATP-Konzentration zu messen. Der Hauptvorteil bei v...

Die Beurteilung der Zellzyklus-Funktionen und Änderungen, die in den Zellen auftreten, während der Zellzyklusprogression ist grundlegend für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, insbesondere der Krebsbiologie. Viele Agenten in Entwicklung für die Behandlung von malignen Erkrankungen haben tief greifende Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression oder Zelltod durch Zellzyklus abhängige-Mechanismen. Um Zellzyklus Dynamik oder Zellen in einer bestimmten Phase des Zellzyklus zu untersuchen, ist es üblich, Zellen zu synchronisieren. Synchronisationsverfahren kann jedoch nachteilige Auswirkungen auf die Zellen untersucht, die möglicherweise verwirrende die erhaltenen Ergebnisse. 1 Kürzlich wurde die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Proteinen, die nur in bestimmten Phasen des Zyklus Zellen vorliegen erlaubt hätte Analyse der Zellzyklus-Progression in einzelnen Zellen über die Zeit 2, jedoch sind die Zellen, die untersucht werden müssen, um die genetisch manipuliert werden können, um diese markierten Proteine ​​exprimieren, was ihre Anwendung auf Systeme, in denen diese gelesen werden könnenily erreicht. Der Zellzyklus besteht aus zwei aktiven Phasen: die Synthese (S) Phase, in der DNA repliziert und Mitose (M), wo die Zellteilung erfolgt. Diese Phasen werden durch drei Spaltphasen, G 0, G 1 und G 2 voneinander getrennt. G 0 oder Ruhe ist eine Ruhephase, in der die Zelle den Zyklus verlassen, G 1, wo die Zellen an Größe vor der DNA-Replikation und G 2, wo das Zellwachstum weiterhin zwischen Beendigung der DNA-Replikation, jedoch vor der Zellteilung. Die Progression durch den Zellzyklus wird durch eine Reihe von Kontrollpunkten gesteuert. Der G1 Kontrollpunkt wird aktiviert, wenn die Umweltbedingungen nicht unterstützend der DNA-Synthese und verhindert den Eintritt in die S-Phase. Die intra-S-Phasen-Kontrollpunkt oder Verzögerung kann durch DNA-Schädigung, die in ins Stocken geraten Replikationsgabeln führen kann ausgelöst werden. Während G 2 die Wiedergabetreue des replizierten DNA bestätigt wird und wenn ein Schaden wird dann detektiert die G 2 </sub&gt; Checkpoint aktiviert ermöglicht DNA-Reparatur vor der Zellteilung. Eine endgültige Prüfpunkt während der Mitose sichergestellt, dass Chromatiden wurden korrekt an der mitotischen Platte ausgerichtet, so dass die Zellteilung erfolgreich abgeschlossen werden kann. 3 Aktivierung dieser Kontroll wird häufig verwendet, um Zellpopulationen zu synchronisieren. Zellzyklus-Kontrollpunkte können von einer Reihe von Faktoren ab, sondern in der Krebsbiologie die häufigste ist die Detektion von DNA-Schäden aktiviert wird. Die DNA-Schadensantwort wird durch die PI3-Kinase-like Kinasen Ataxie Teleangiektasien und Rad3 bezogenen (ATR) initiiert und Ataxie Teleangiektasie mutiert (ATM), die den nachgeschalteten Effektor-Kinasen Chk1 und Chk2 aktivieren sind. 3 Eine Reihe von Ereignissen aktiviert Chk1 einschließlich, ins Stocken geraten Replikationsgabeln, DNA-Vernetzungen und UV-Strahlung Schäden während Chk2 wird vor allem von Doppelstrangbrüchen aktiviert. Das übliche Verfahren für die Untersuchung der Wirkung der veränderten Bedingungen auf die Länge des Zellzyklus is, um die Zellen zu synchronisieren in einer bestimmten Phase des Zellzyklus. 1 Dieses kann über verschiedene Verfahren erreicht werden. Die Zellen können physikalisch getrennt basieren auf Größe, Dichte, Seitenstreuung (Granularität) und Zelloberflächenexpression Marker. Praktischer ausgedrückt können Zellen durch chemische Mittel synchronisiert werden. Mehrere Mittel, wie Thymidin, Hydroxyharnstoff und Cytosinarabinosid kann zur DNA-Synthese in der S-Phase des Zellzyklus, was zu einer Anhäufung von Zellen in S-Phase, die auch nach cycling die Mittel entfernt zu hemmen. Oder M-Phase der DNA-Gehalt - Zellen mit Nocodazol, die die Bildung der mitotischen Spindel, Festnahme mit einem G 2 verhindert, behandelt. Beseitigung von Serum aus dem Kulturmedium führt zur Akkumulation von Zellen in G 0 -Phase. Die erneute Zugabe der Nährstoffe in der Kultur Serum führt zum Start des normalen Fahrradfahren der Zellen. Jedoch sind alle diese Synchronisationsverfahren mit normalen Radfahren und Wachstum der Zellen stören und Result in signifikanten Zelltod. Synchronisation der akuten lymphoblastischen Leukämiezellen, ist eine besondere Herausforderung und diese Zellen nicht zugänglich sind Genmanipulation. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Beurteilung von Zellzyklusdynamik und die Untersuchung von Zellen, die in bestimmten Phasen des Zellzyklus ohne traditionelle Synchronisation oder genetischen Veränderung. Dieses Verfahren kann auch für andere Zelltypen, bei denen genetische Veränderung und traditionelle Synchronisationsverfahren nicht leicht erreicht werden. Die Methode basiert auf der seit langem etablierten Einsatz von Bromdesoxyuridin (BrdU) Einbau, die sehr wenig Einfluss auf die kurzfristige Wachstum und die Vermehrung von Zellen hat basierend. 4 Gegründet BrdU-Protokolle nutzen den Einbau von BrdU in die neu synthetisierte DNA während der S-Phase . Dies markiert dauerhaft Zellen mit BrdU während der Belichtung in der S-Phase gewesen. Diese Population kann zu späteren Zeitpunkten durch Färbung auf BrdU incorpor identifiziert werdenation und damit zu handeln als Synchron Bevölkerung, die folgten und mit der Zeit zu beurteilen erlaubt die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf die Zellzyklustransit werden kann. BrdU muss vor der Antikörperfärbung ausgesetzt sind, werden in der Regel folgende DNase oder Säurebehandlung erreicht. 6,7 mittels Durchflusszytometrie zu erkennen eingebautem BrdU ermöglicht die Aufnahme von zusätzlichen Markern. Die wichtigste ist die Verwendung von Farbstoffen auf den DNA-Gehalt zu messen, so dass die Beurteilung der Zellzyklusphasenverteilung der Zellen, in die S-Phase zu Beginn der Studie waren. 8 ferner zusätzliche Oberfläche oder intrazelluläre Antigene können ebenfalls untersucht werden. 9 Dies kann zu Zellzyklusereignisse wie Ki67 beziehen oder auf scheinbar unabhängige Zellfunktionen wie Apoptose-Marker wie gespalten Caspase-3. Die Einsatzmöglichkeiten sind durch die Phantasie des Forschers begrenzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC BrdU Flow Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552598</td>
			<td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm 
			Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561651</td>
			<td>Referred to as Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Referred to as Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FORTESSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P20, P100, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>FisherBiotec</td>
			<td>FBS-7100113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon TC 150cm2 vented Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 200&#181;L</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 1mL</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Spintron</td>
			<td>GT-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>C 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9708S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>2197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td><a name="RANGE!C23">2348S</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NALM6&#160;</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Diese Methode kann verwendet werden, um eine Reihe von Informationen zu erhalten. Einige Anwendungen sind hier aufgeführt. Ermittlung der Dauer des Zellzyklus Die Zeit für die Zellen durch den Zellzyklus erforderlich ist, um Durchgangs bestimmen, werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BrdU puls geerntet. Die Intervalle zwischen den Bewertungen können auf die jeweiligen Zellen analysiert angepasst werden. Hämatopoetischen Zelllinien wurden st?...

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Zeitliche Verfolgung des Zellzyklusverlaufs mithilfe der Durchflusszytometrie ohne die Notwendigkeit einer Synchronisierung | Biologie | Video

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

19.1K Aufrufe.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten. 

Serie: Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Forschung

Biologie

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) has been utilized to investigate replicative/S-phase progression, whereas antibodies against phospho-histone H3 have been utilized to mark mitotic nuclei and cells. A combination of both labels would enable the classification of G0/G1 (Gap phase), S (replicative), and M (mitotic) phases and serve as an important tool to evaluate the effects of mitotic gene knockdowns or null mutants on cell cycle progression. However, the reagents used to mark EdU-labelled cells are incompatible with several secondary antibody-fluorescent tags. This complicates immunostaining, where primary and tagged secondary antibodies are used to mark pH3-positive mitotic cells. This paper describes a step-by-step protocol for the dual-labeling of EdU and pH3 in Drosophila larval neural stem cells, a system utilized extensively to study mitotic factors. Additionally, a protocol is provided for image analysis and quantification to allocate labeled cells in 3 distinct categories, G0/G1, S, S&gt;G2/M (progression from S to G2/M), and M phases.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Cell cycle analysis with 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and phospho-histone H3 (pH3) labeling is a multi-step procedure that may require extensive optimization. Here, we present a detailed protocol that describes all steps for this procedure including image analysis and quantification to distinguish cells in different cell cycle phases.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...