Name: temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die akute lymphatische Leukämie-Zelllinie NALM6 sondern kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden. 1. Lösungen und Reagenzien <ol><li> Komplettes RPMI <ol><li> Hinzuzufügen 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml von 200 mM L-Glutamin in einer 500 ml Flasche mit RPMI-1640-Medium. </li></ol></li><li> BrdU-Stammlösung <ol><li> Vorbereitung 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS). </li></ol></li><li> BrdU komplettem RPMI <ol><li> In 6,2 ul der BrdU-Stammlösung zu 10 ml vollständigem RPMI. </li></ol></li><li> DNase-Lösung <ol><li> Bereiten Sie 1 mg DNase / ml in DPBS. </li></ol></li><li> Färbepuffer <ol><li> Vorbereitung 3% hitzeinaktiviertem FCS und 0,09% Natriumazid in DPBS. </li></ol></li><li> Siehe Materialliste für Definitionen der Fixation Buffer, Permeabilisierung Puffer und Waschpuffer. </li></ol> 2. Zellen Neinte: Die Zellen waren nicht für mehr als 6 Monate kultiviert. Dieses Verfahren ist direkt anwendbar zu jeder nicht-adhärenten Zelllinie mit Anpassungen der Zelldichte und Kulturmedien. Zellen einzusetzen, die exponentiell zu Beginn des Experiments wachsen. <ol><li> Pflegen NALM6 Zellen in T-75 Kulturflaschen in komplettem RPMI. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen mit einem Klasse II Biosicherheitswerkbank. <ol><li> Aufrechtzuerhalten NALM6 Zellen zwischen 1-2 x 10 6 Zellen pro ml durch Aufteilung der Kultur dreimal wöchentlich. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft. </li></ol></li></ol> 3. Pulse Markierung von Zellen mit BrdU VORSICHT: Gehen Sie BrdU mit Sorgfalt, da es eine potentielle mutagen und teratogen. <ol><li> Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min. Hinweis: Übertragen von Zellen in frischem Medium verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. </li><li> Durchführen einer Zellzahl und resuspendieren Zellen in komplettem RPMI mit 2 × 10 6 cEllen / ml. </li><li> Verdünnte Zellen 1 in 2 mit BrdU komplettem RPMI Herstellung einer endgültigen Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 45 min, dann verdünnt 1 in 10 Zellen mit komplettem RPMI. Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min und sorgfältig berücksichtigen keines der überstehenden Flüssigkeit. </li><li> Die Zellen in einem kleinen Volumen (~ 100 &amp; mgr; l) von kompletten RPMI Führen einer Zellzahl und anpassen, um 1 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Pipette 1 ml der Zellen in die Vertiefungen einer 48 Well-Platte. Pipette 1 ml DPBS in jede unbesetzte Brunnen, mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft für die gewünschten Zeitpunkte, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24 Stunden. Anmerkung: Die Länge der Zeit ab, was die Versuchsanordnung zielt darauf ab, zu messen abhängen. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen in FACS-Röhrchen mit einer Pipette. Die auch nacheinander mit 1 ml volu Spülenmes von PBS zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 5 ml. </li><li> Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig alle den Überstand. Zellen sind bereit für die Färbung, führen Sie diese (Abschnitt 4) sofort. </li></ol> 4. Zellfärbung Anmerkung: Wenn eine Oberflächenfärbung von Zellen erforderlich zuführen es vor der Fixierung, so dass die Zellen bei 4 ° C durchgehend beibehalten. <ol><li> Die Zellen in 100 ul Färbepuffer (für optionale Oberflächenfärbung, fügen Sie die empfohlenen Volumen von Antikörper gegen Oberflächenantigene und Inkubation für 30 min bei 4 ° C). </li><li> 1 ml der Färbepuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen. Hinweis: Spezifische Antikörper, Konzentration, Inkubationszeit usw. in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Ziele variieren. </li><li> Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Die Zellen in 100 ul Puffer Fixierung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml of Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul Permeabilisierung Puffer und Inkubation der Zellen für 10 Minuten auf Eis. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul Puffer pro Röhrchen Fixierung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen. Hinweis: Das Protokoll kann hier bei Bedarf angehalten werden. Die fixierten Zellen werden bei 4 ° C mehrere Tage lang stabil, wenn sie in Färbepuffer resuspendiert. Entfernen Sie die Färbepuffer nach der Zentrifugation, bevor Sie fortfahren. </li></ol></li><li> DNase-Behandlung <ol><li> Die Zellen in 100 ul DNase-Lösung (30 ug DNase / 10 6 Zellen) und inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen. </li&gt; </ol></li><li> Antikörper-Färbung Anmerkung: Die Färbung für andere als BrdU intrazellulären Marker können gleichzeitig mit der BrdU-Färbung durchgeführt werden. <ol><li> WICHTIG: Bereiten Kompensationskontrollen, bestehend aus ungefärbten Zellen und Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom markiert. Idealerweise verwenden die gleichen Antikörper für die Entschädigung Kontrollen, wie sie in der experimentellen Röhren verwendet. Wenn dies jedoch nicht möglich ist, ersatz Antikörper stark exprimierten Antigene auf den gleichen Fluorochrom konjugiert ist. </li><li> Die Zellen in 50 ul Waschpuffer und fügen 1 ul / 10 6 Zellen von BrdU-Antikörpers. Anmerkung: direkt konjugierten Antikörpern gegen andere spezifische intrazelluläre Antigene können ebenfalls zugegeben werden. HINWEIS:. Antikörper gegen Histon H3 an Ser10 phosphoryliert kann zwischen den Zellen in der G2 und M zu unterscheiden ist phosphoryliert Histon H3 an Ser10 während der Mitose 10 Antikörper gegen cdc2 phosphoryliert am Tyr15 verwendet, um Zellen zu detektieren have Mitose verpflichtet. 11 </li><li> Inkubieren der Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge Zellen bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Stain DNA für Zellzyklusanalyse <ol><li> Lösen Pellet und fügen Sie 20 ul der 7-AAD-Lösung (0,25 ug). Anmerkung: Es ist wichtig, eine konstante Menge von 7-AAD / Zelle zu verwenden. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Färbepuffer. </li></ol></li></ol> 5. Sammlung von Durchflusszytometrie Daten Der benötigte hängt von der Anzahl und Art der verwendeten Fluorochromen abhängen Maschine. <ol><li> Sammeln Sie die folgenden Parameter: FSC-A, SSC-A, FSC-H und 7-AAD-Fluoreszenz auf einer linearen Skala (FSC-W kann anstelle von FSC-H verwendet werden). Sammeln Sie die APC-Kanal auf einer logarithmischen Skala. Sammeln Sie alle zusätzlichen Kanäle für die Beurteilung der Oberfläche und im Inneren von Etiketten mit einer logarithmischen Skala erforderlich. </li><li> Führen comKompensation von überlappenden Signalen in vor der Analyse der Proben zwischen verschiedenen Fluorochromen Emissionsspektren beobachtet. Hinweis: Die meisten Durchflusszytometer wird dies automatisch durchführen. </li><li> Sammeln Sie mindestens 10.000 Ereignisse für jede Probe. </li></ol> 6. Analyse der Durchflusszytometrie Daten Anmerkung: FlowJo wurde in dieser Studie für die Strömung verwendet Zytometrie Datenanalyse, sondern auch andere Softwarepakete können ebenfalls verwendet werden. Die Gating-Strategie ist in Figur 1 veranschaulicht. <ol><li> Identifizieren Sie die Lebendzellpopulation mit FSC-A und SSC-A-Parameter. </li><li> Innerhalb dieser Population auszuschließen Dubletten und Aggregate mit FSC-A und FSC-H (FSC-W kann natürlich auch verwendet werden). </li><li> Innerhalb dieser Population eingestellt ein Punkt-Diagramm mit 7-AAD auf der x-Achse und BrdU-APC auf der y-Achse. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> Abbildung 1: Gating-Strategie Left pa.nel: ungated Zellen auf einem FCS-A vs. SSC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die lebensfähige Zellpopulation wird durch die gezeigte Gate identifiziert. Mitteltafel: Zellen aus dem linken Fenster gated auf einer FSC-A vs. FSC-H-Punktediagramm (FSC-W kann anstelle der Höhe verwendet werden) gezeigt. Dubletts und Aggregate werden identifiziert und durch die gezeigte Gate ausgeschlossen. Rechts: Zellen aus dem Wams Ausschlussdatum in der Mittelplatte gated sind auf einem 7-AAD vs. APC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die BrdU-Antikörper wird mit APC, die die Identifizierung von Zellen, die BrdU während des Puls-Markierung inkorporiert haben markiert. 7-AAD bietet Informationen über die DNA-Gehalt. Die obere Gate definiert Zellen positiv für BrdU und damit in die S-Phase zu der Zeit des BrdU Puls, der unteren linken Tor, Zellen in G 0/1 und der rechten unteren Gate jene in G 2 / M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.</a> <ol start="4"><li> Cell Cycle A<html> nalyse <ol><li> Öffnen der ersten Datendatei und Gate auf die Zellen in dem Dublett Ausschluss Gate. </li><li> Analysieren Sie diese Bevölkerung für Zellzyklus-Verteilung (unter Plattformen in FloJo Software befindet) und verwenden Sie die Dean-Jett-Fox-Modell. </li><li> Besorgen Sie sich die Positionen der G 0/1 und G 2 / M mit Spitzen erstellen Tore. </li><li> Tor auf der BrdU-positiven Zellen und unterliegen diese Bevölkerung zu gleichen Zellzyklusanalyse. </li><li> Stellen die Positionen der G 0/1 und G 2 / M-Spitzen, die durch die Anwendung der gleichen Toren aus schaffen Gatter und Einstellen Bedingungen (mit den Gates angelegt) für die Positionen der G 0/1 und G 2 / M Spitzen. Dies wird in den ersten 2 Platten der Fig. 2 dargestellt Hinweis: andere Software kann auch verwendet werden, um die Daten zu analysieren, und die Anweisungen würden entsprechend variieren. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Fig. 2: Zellzyklusprogression Die erste Platte (alle Zellen) auf der Zellpopulation durch das Dublett Ausschluss Gate definiert sucht. Diese Population wurde in einem Histogramm auf der X-Achse 7-AAD angezeigt. Der Peak der G 0/1 Peak durch den Pfeil unter der Achse angegeben. In den Folgeplatten BrdU-positiven Zellen wurden auf gated wie in Abbildung 1 dargestellt. Der Wert für das G 0/1 Position erreicht, wenn Gating des Dubletts Ausschluss Gate mit der BrdU positive Zellen in gated FlowJo Zellzyklus-Software angewendet. Jeder nachfolgende Tafel wurde auf der BrdU-positiven Population gated wie in Figur 1 und der Position der G 0/1 Peak, basierend auf der erhaltenen bei der Analyse der Gesamtbevölkerung in den ersten zwei Platten gezeigt Wert dargestellt. Verwendung des BrdU negative Fraktion, um die Position des G 0/1 Population für die BrdU-positiven Zellen in demselben samp identifizierenle steuert für leichte Unterschiede in der Intensität der DNA-Färbung zwischen den Proben. Die Zahl auf jeder Tafel gezeigt ist, stellt die Zeit seit dem BrdU puls beendet. Die berechneten Zellzyklus-Phasen werden in schattierten grün dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Die Fähigkeit, den Zellzyklus zu analysieren ist wichtig für das Verständnis der Krebsbiologie und den Wirkmechanismus beider Medikamente und Gene, die die Zellproliferation und das Wachstum beeinflussen. Zwar gibt es eine Vielzahl von Assays, welche angeblich die Zellproliferation zu messen, wird nur die Mehrheit ein Maß, daß die Anzahl Zellen vorhanden angibt. Dazu gehören Tests, die Zellzahl durch direkte Visualisierung und Zählen, Stoffwechselaktivität oder ATP-Konzentration zu messen. Der Hauptvorteil bei v...

Die Beurteilung der Zellzyklus-Funktionen und Änderungen, die in den Zellen auftreten, während der Zellzyklusprogression ist grundlegend für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, insbesondere der Krebsbiologie. Viele Agenten in Entwicklung für die Behandlung von malignen Erkrankungen haben tief greifende Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression oder Zelltod durch Zellzyklus abhängige-Mechanismen. Um Zellzyklus Dynamik oder Zellen in einer bestimmten Phase des Zellzyklus zu untersuchen, ist es üblich, Zellen zu synchronisieren. Synchronisationsverfahren kann jedoch nachteilige Auswirkungen auf die Zellen untersucht, die möglicherweise verwirrende die erhaltenen Ergebnisse. 1 Kürzlich wurde die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Proteinen, die nur in bestimmten Phasen des Zyklus Zellen vorliegen erlaubt hätte Analyse der Zellzyklus-Progression in einzelnen Zellen über die Zeit 2, jedoch sind die Zellen, die untersucht werden müssen, um die genetisch manipuliert werden können, um diese markierten Proteine ​​exprimieren, was ihre Anwendung auf Systeme, in denen diese gelesen werden könnenily erreicht. Der Zellzyklus besteht aus zwei aktiven Phasen: die Synthese (S) Phase, in der DNA repliziert und Mitose (M), wo die Zellteilung erfolgt. Diese Phasen werden durch drei Spaltphasen, G 0, G 1 und G 2 voneinander getrennt. G 0 oder Ruhe ist eine Ruhephase, in der die Zelle den Zyklus verlassen, G 1, wo die Zellen an Größe vor der DNA-Replikation und G 2, wo das Zellwachstum weiterhin zwischen Beendigung der DNA-Replikation, jedoch vor der Zellteilung. Die Progression durch den Zellzyklus wird durch eine Reihe von Kontrollpunkten gesteuert. Der G1 Kontrollpunkt wird aktiviert, wenn die Umweltbedingungen nicht unterstützend der DNA-Synthese und verhindert den Eintritt in die S-Phase. Die intra-S-Phasen-Kontrollpunkt oder Verzögerung kann durch DNA-Schädigung, die in ins Stocken geraten Replikationsgabeln führen kann ausgelöst werden. Während G 2 die Wiedergabetreue des replizierten DNA bestätigt wird und wenn ein Schaden wird dann detektiert die G 2 </sub&gt; Checkpoint aktiviert ermöglicht DNA-Reparatur vor der Zellteilung. Eine endgültige Prüfpunkt während der Mitose sichergestellt, dass Chromatiden wurden korrekt an der mitotischen Platte ausgerichtet, so dass die Zellteilung erfolgreich abgeschlossen werden kann. 3 Aktivierung dieser Kontroll wird häufig verwendet, um Zellpopulationen zu synchronisieren. Zellzyklus-Kontrollpunkte können von einer Reihe von Faktoren ab, sondern in der Krebsbiologie die häufigste ist die Detektion von DNA-Schäden aktiviert wird. Die DNA-Schadensantwort wird durch die PI3-Kinase-like Kinasen Ataxie Teleangiektasien und Rad3 bezogenen (ATR) initiiert und Ataxie Teleangiektasie mutiert (ATM), die den nachgeschalteten Effektor-Kinasen Chk1 und Chk2 aktivieren sind. 3 Eine Reihe von Ereignissen aktiviert Chk1 einschließlich, ins Stocken geraten Replikationsgabeln, DNA-Vernetzungen und UV-Strahlung Schäden während Chk2 wird vor allem von Doppelstrangbrüchen aktiviert. Das übliche Verfahren für die Untersuchung der Wirkung der veränderten Bedingungen auf die Länge des Zellzyklus is, um die Zellen zu synchronisieren in einer bestimmten Phase des Zellzyklus. 1 Dieses kann über verschiedene Verfahren erreicht werden. Die Zellen können physikalisch getrennt basieren auf Größe, Dichte, Seitenstreuung (Granularität) und Zelloberflächenexpression Marker. Praktischer ausgedrückt können Zellen durch chemische Mittel synchronisiert werden. Mehrere Mittel, wie Thymidin, Hydroxyharnstoff und Cytosinarabinosid kann zur DNA-Synthese in der S-Phase des Zellzyklus, was zu einer Anhäufung von Zellen in S-Phase, die auch nach cycling die Mittel entfernt zu hemmen. Oder M-Phase der DNA-Gehalt - Zellen mit Nocodazol, die die Bildung der mitotischen Spindel, Festnahme mit einem G 2 verhindert, behandelt. Beseitigung von Serum aus dem Kulturmedium führt zur Akkumulation von Zellen in G 0 -Phase. Die erneute Zugabe der Nährstoffe in der Kultur Serum führt zum Start des normalen Fahrradfahren der Zellen. Jedoch sind alle diese Synchronisationsverfahren mit normalen Radfahren und Wachstum der Zellen stören und Result in signifikanten Zelltod. Synchronisation der akuten lymphoblastischen Leukämiezellen, ist eine besondere Herausforderung und diese Zellen nicht zugänglich sind Genmanipulation. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Beurteilung von Zellzyklusdynamik und die Untersuchung von Zellen, die in bestimmten Phasen des Zellzyklus ohne traditionelle Synchronisation oder genetischen Veränderung. Dieses Verfahren kann auch für andere Zelltypen, bei denen genetische Veränderung und traditionelle Synchronisationsverfahren nicht leicht erreicht werden. Die Methode basiert auf der seit langem etablierten Einsatz von Bromdesoxyuridin (BrdU) Einbau, die sehr wenig Einfluss auf die kurzfristige Wachstum und die Vermehrung von Zellen hat basierend. 4 Gegründet BrdU-Protokolle nutzen den Einbau von BrdU in die neu synthetisierte DNA während der S-Phase . Dies markiert dauerhaft Zellen mit BrdU während der Belichtung in der S-Phase gewesen. Diese Population kann zu späteren Zeitpunkten durch Färbung auf BrdU incorpor identifiziert werdenation und damit zu handeln als Synchron Bevölkerung, die folgten und mit der Zeit zu beurteilen erlaubt die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf die Zellzyklustransit werden kann. BrdU muss vor der Antikörperfärbung ausgesetzt sind, werden in der Regel folgende DNase oder Säurebehandlung erreicht. 6,7 mittels Durchflusszytometrie zu erkennen eingebautem BrdU ermöglicht die Aufnahme von zusätzlichen Markern. Die wichtigste ist die Verwendung von Farbstoffen auf den DNA-Gehalt zu messen, so dass die Beurteilung der Zellzyklusphasenverteilung der Zellen, in die S-Phase zu Beginn der Studie waren. 8 ferner zusätzliche Oberfläche oder intrazelluläre Antigene können ebenfalls untersucht werden. 9 Dies kann zu Zellzyklusereignisse wie Ki67 beziehen oder auf scheinbar unabhängige Zellfunktionen wie Apoptose-Marker wie gespalten Caspase-3. Die Einsatzmöglichkeiten sind durch die Phantasie des Forschers begrenzt.

<table><tbody><tr><td>APC BrdU Flow Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm&lt;br/&gt; Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td></tr><tr><td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>Referred to as Permeabilization buffer</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Referred to as Wash buffer</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&amp;nbsp;mm FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; vented Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 25&amp;nbsp;ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 1&amp;nbsp;ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Diese Methode kann verwendet werden, um eine Reihe von Informationen zu erhalten. Einige Anwendungen sind hier aufgeführt. Ermittlung der Dauer des Zellzyklus Die Zeit für die Zellen durch den Zellzyklus erforderlich ist, um Durchgangs bestimmen, werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BrdU puls geerntet. Die Intervalle zwischen den Bewertungen können auf die jeweiligen Zellen analysiert angepasst werden. Hämatopoetischen Zelllinien wurden st?...

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Zeitliche Verfolgung des Zellzyklusverlaufs mithilfe der Durchflusszytometrie ohne die Notwendigkeit einer Synchronisierung | Biologie | Video

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

19.1K Aufrufe.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten. 

Serie: Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Forschung

Genetik

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Krebsforschung

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologie

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Immunologie und Infektion

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
The cell cycle is a universal process of life. During the cell cycle, a cell undergoes several modifications to divide into two daughter cells. This mechanism occurs throughout an organism&#39;s life in response to its needs. Cell divisions and embryonic development produce a full organism from a single-celled zygote. During adulthood, the cell cycle is central to many critical biological processes, such as tissue repairs.
Mechanisms of cell division are tightly controlled events where the cell undergoes stepwise modifications before final division. Cells that are not yet in the cycle are described as being in the Gap 0 (G0) phase. During this stage the cell is considered quiescent. When the cell starts to cycle, four distinct phases are recognized: Gap 1 (G1), Synthesis (S), Gap 2 (G2) and Mitosis (M). G1 phase is a checkpoint for resources needed by the cell for DNA synthesis. Then, S phase occurs, and DNA replication starts, followed by the G2 interphase, another checkpoint that controls all elements necessary to for the cell to divide. Finally, the cell enters mitosis and divides into two daughter cells.
Cell division is a highly informative parameter in many different biological systems. In the field of immunology, analysis of leukocyte proliferation can indicate the mechanism of the immune response. Other domains of investigation also rely on cell cycle analysis. For instance, analysis of the cell cycle during tumor development has improved our understanding of cancer.
Many fluorescent dyes are now available for tracking cell proliferation. These dyes differ in their chemical and spectral properties. Two different classes of dyes exist: protein dyes permanently combine with protein by forming a covalent bond, and membrane dyes stably intercalate within cell membranes via strong hydrophobic associations. In vitro and in vivo studies of immune cell proliferation by flow cytometry are among the most common applications of both classes of cell tracking dyes (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) is a fluorescent dye that marks dividing cells. Initially, all the cells receive the same amount of dye; dividing cells evenly split the dye they received between their two daughter cells. Consequently, the cell cycle can be followed by the progressive decrease of dye intensity in the cells. CFSE staining is followed by conventional multi-parametric flow cytometry, a high-throughput, fluorescence-based technology that allows phenotypic and functional characterization of cells based on their degree of CFSE staining (3).
In the following experiment, we assess the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells in-vitro, following CD3 stimulation, using CFSE staining and flow cytometry.

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Immunologie

Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation

Source: Welschinger R. et al. <a href="https://www.jove.com/t/52840">Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video describes the stepwise pulse labeling assay of mammalian cells with bromodeoxyuridine (BrdU) for measuring cell proliferation. The BrdU uptake permits the temporal tracking of cells that were in the synthesis phase at a specific point in time, without requiring the cells to be synchronized.

Bromodeoxyuridin-Pulsmarkierungsassay: Eine Technik zur Messung der Zellproliferation

Source: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)
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