Die Autoren sind vom schwedischen Forschungsrat, die Schwedische Stiftung für strategische Forschung, dem schwedischen Cancer Society, der schwedischen Kinder-Krebs-Gesellschaft, Åke Wibergs Stiftung und Jeanssons Stiftung unterstützt.

1. Die Einführung der Sonde in Zellen <ol><li> Co-Transfektion von Zellen mit einer FRET-basierten Sonde und ein Plasmid Resistenz. Wählen Sie eine Transfektion Methode, die effizient in Ihr Handy-Typ von Interesse. Für U2OS Zellen, geben Standard-Calciumphosphat-Transfektion Methoden angemessene Ergebnisse 15. </li><li> Markieren Sie die Zellen in dem entsprechenden Antibiotikum für mindestens 7 Tage. Dies bereichert die Menge an Zellen, die die Sonde und begrenzt die Menge an Zellen mit toxischen Expressionsniveaus oder Expressionsniveaus, die stark beeinflusst den Zellzyklus. </li><li> (Optional) für eine stabile Klone zu selektieren. </li><li> Mit festen oder lebende Zellen sicher, dass sowohl CFP und YFP in allen Zellen vorhanden auf etwa dem gleichen Verhältnis werden. </li><li> Bei einigen Zellen nur CFP oder YFP enthalten, hat Rekombination wahrscheinlich aufgetreten. Die Rekombination kann entweder während das Wachstum von Bakterien oder nach der Transfektion der Sonde und kann in diesem Fall auf dem Plasmid Qualität abhängen. Wiederholen Sie die Plasmid pWiedergutmachung und Linearisierung des Plasmids vor der Transfektion, wenn das Problem weiterhin besteht. </li></ol> 2. Überwachung ratiometrische FRET <ol><li> Seed-Zellen auf Glas unteren Gerichte oder Deckgläser für den Einbau in eine Kammer. Stellen Sie sicher, dass Geschirr / Deckgläser kein 1.5 (170 um dick). </li><li> Berg-Zellen in Wachstumsmedium ohne Phenolrot auf einem motorisierten Epifluoreszenzmikroskop mit Temperatur-Regler auf 37 ° C. Stellen Sie sicher, pH-Regulierung der Medien, entweder durch CO 2 oder mit CO 2-unabhängigen Medien wie Liebowitz-15. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Zellen mit Hilfe von Durchlicht. Schauen Sie nicht auf Zellen mit fluoreszierenden Licht. </li><li> Starten Sie durch den Erwerb einer 12 oder 16 Bit-Bild mit YFP-Anregung (YFPex) und YFP-Emission (YFPem) Filter und eine geeignete dichroitische Spiegel. Verwenden Sie maximal Binning zur Verfügung, die noch erlaubt die erforderliche subzelluläre Auflösung. Mit einem hohen Binning auf Belichtungszeit oder die Intensität zu verringern ist entscheidend für Phototoxizität zu vermeiden. </li><li> Mirasure oder Schätzung der Hintergrund-Intensität und die ungefähre Lärm durch Messung oder Abschätzung der groben Durchschnitt, Minimum und Maximum Pixelwerte in einem Gebiet ohne Zellen. Ändern Sie Belichtungszeit und Neutralfilter so dass die durchschnittliche Signal in der Zelle ist ungefähr Hintergrund Intensität plus fünf vor zehn mal den Unterschied zwischen max und min Hintergrund Intensitäten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Bilder nicht in der Nähe nicht gesättigt. Die maximale Intensität im Bild sollte weniger als die Hälfte der Dynamikumfang (zB max 2000 in einem 12-Bit-Bild), um Intensitätsunterschiede erlauben, wenn die Zellen Mitose geben. </li><li> Wiederholen Sie Schritt von 2,4 bis 2,6 mit CFP Anregungs-und YFP-Emission-Filter und eine geeignete dichroitische Spiegel. </li><li> Wählen Sie mehrere Regionen mit transfizierten Zellen, mit Ausnahme der Regionen für Punkt von 2,4 bis 2,7 verwendet werden, und sicherzustellen, dass die maximale Intensität ist weniger als die Hälfte der Dynamikumfang in allen Zellen. </li><li> Starten Sie eine Zeitraffer-Experiment erwirbt zwei Bilder alle 45 min mit YFPex - YFPem und CFPex - YFPem Filter-Sets. </li></ol> 3. Überprüfung und Optimierung der Bedingungen <ol><li> Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder und Überwachung der Dauer des Zellzyklus von Mitose zu Mitose für Zellen, die transfiziert Sonde zum Ausdruck bringen. </li><li> Vergleichen Sie die gemessene Dauer des Zellzyklus zu veröffentlichenden Daten für den jeweiligen Zelltyp. Alternativ untransfizierte Dünnschichtzellen durch den Erwerb eines Bildes von Durchlicht nur (z. B. DIC oder Phasen-Kontrast) jede Stunde um Referenzzelle Zykluszeiten zu bekommen. </li><li> Bei der Zeit von Mitose zu Mitose entspricht Zellzyklus Timings Referenz, fahren Sie mit Schritt 4 fort. Alternativ wieder erwerben Bilder mit schwerer Belastung, mehr Zeit-Punkten oder mehreren z-Ebenen und Schritt 3 wiederholen. </li><li> Bei der Zeit von Mitose zu Mitose entspricht nicht Zellzyklus-Timings Referenz, transfiziert Dünnschichtzellen durch den Erwerb eines Bildes von Durchlicht nur (z. B. DIC oder Phasen-Kontrast-) stündlich durch ein Bild, gefolgt am Endedes Experiments zu transfizierten Zellen zu identifizieren. </li><li> Wenn die transfizierten Zellen noch mehr Zellzyklus mal zeigen, wiederholen Sie Schritt 1, aber transfizieren weniger Sonde oder wählen Sie für eine stabile Klone, die sehr geringe Mengen der Sonde enthalten. </li><li> Wenn die transfizierten Zellen des normalen Zellzyklus mal zeigen, in der Abwesenheit von Fluoreszenzlicht, wiederholen Sie Schritt 2, aber niedriger Belichtung, indem Sie Binning, Neutralfilter, Belichtungszeit, und die Zeit zwischen den Bildern. </li></ol> 4. Analyse FRET <ol><li> Die Analyse kann von den meisten Software gewidmet Mikroskopie durchgeführt werden. Hier beschreiben wir, wie die Analyse mit Hilfe der Freeware ImageJ (durchführen <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) unter Verwendung des Plugins Verhältnis Plus ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html</a> ). </li><li> Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Falls Ihr Bilder sind im Format eines mehrfarbigen stack (z. B. Deltavision), trennen Sie die einzelnen Kanäle durch erste Umwandlung einer HyperStack: zu HyperStack Image-HyperStack-Stack und anschließend teilen Sie sie auf einzelne Kanal-Stacks mit: Image-HyperStack-Dimensionalität zu reduzieren </li><li> Multiplizieren Sie die YFPex - YFPem Stapel mit 3 Verwendung: Process-Math-Multiply Dieser Schritt ist optional, da sie nur dazu bestimmt ist, die visuelle Klarheit der Bilder, indem sichergestellt wird, dass Verhältnisse nicht in den Bereich zwischen 0 und 1 zu erhöhen. </li><li> In der YFPex - YFPem Stack, zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) in einem Gebiet, das frei von Zellen ist, aber das liegt in der Nähe einer Zelle zu messen. Verschiedene Zellen in das gleiche Bild können unterschiedliche Regionen, da beide Hintergrund und Signalintensität in der Regel am stärksten ist in der Mitte des Bildes. </li><li> Fügen Sie den ROI zu ROI-Manager: Analysieren-tools-ROI-Manager. </li><li> Messen Sie die mittlere Intensität der ROI sowohl in der YFPex - YFPem und die CFPex - YFPem stack: Analyze-Measure </em&gt;. </li><li> Wiederholen Sie bei mehreren Zeitpunkten und sicherstellen, dass Hintergrund-Intensitäten in der Nähe der Zelle von Interesse sind, ähnlich den ganzen Film. </li><li> Set Messungen minimal Intensität gehören: Analyse-Set Messungen-Min-und Max-Grauwert. </li><li> Zeichnen Sie eine Region von Interesse für die meisten von einer Zelle und messen Sie die minimale Intensität sowohl in der YFPex - YFPem und die CFPex - YFPem Stapel. Nehmen Sie die Differenz zwischen der gemessenen minimalen Intensität und die Hintergrund-Intensität von 4,6 und dividieren sie durch zwei. Dies stellt einen Ausgangspunkt Schätzung für eine Clipping-Wert. </li><li> Öffnen Verhältnis Plus. Wählen Sie die YFPex - YFPem und die CFPex - YFPem Stapel. Für FRET-Verhältnis, wählen CFPex - YFPem als Stapel 1, für den invertierten FRET Verhältnis Visualisierung Sonden, wo die Effizienz sinkt FRET auf Phosphorylierung, wählen YFPex - YFPem als Stapel 1. </li><li> Legen Sie die gemessenen Intensitäten Hintergrund-und Clipping-Werte. </li><li> Stellen Sie die Skalierung der resultierende Verhältnis Stack und wenden Sie einen passenden Look up-Tabelle (LUT)-Verhältnis Veränderungen sichtbar zu machen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Plk1 Aktivität wird zuerst sichtbar in den Kern in der G2-Phase und Gipfel während der Mitose. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit minimal Phototoxizität Einstellungen wie in Abschnitt 2 beschrieben. Bitte beachten Sie, dass dies eine repräsentative erste Ergebnis ist, und dass die Exposition Bedingungen oder zwischen den Bildern kann geändert werden, um Signal-Rausch-Verhältnis oder zeitliche Auflösung zu erhöhen. Abbildung 3D zeigt, dass ein Großteil der Zellen, die die Sonde wuchern mit einem Zellzyklus-Zeit zwischen 20 und 25 Stunden, was darauf hinweist, dass die Aufnahmebedingungen und Expression der Sonde nicht beeinflussen Zellzyklus Timings. Zwar gibt es erheblichen Lärm, wodurch der Trend der Plk1 Aktivität in G2 und gipfelt in der Mitose 14 ist deutlich zu erkennen (Abb. 3A). Die Verarbeitung der Rohdaten, die hier durch meine Filterung präsentiert als Kymographion (Abb. 3B), oder die Quantifizierung der durchschnittlichen invertiert ra<html> tio (Abb. 3C) kann der Klarheit. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip einer FRET-basierten Sonde an Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten überwachen. Zwei Fluorophore, in der Regel CFP (blau) und YFP (grün), werden durch einen phospho-bindende Domäne (orange) und ein phosphorylierbaren Sequenz (gelb) verbunden. Phosphorylierung (rot) vermittelt die Bindung an die phospho-bindende Domäne, dabei wird eine Konformationsänderung in der Sonde. Die Konformationsänderung führt zu einem Unterschied in der Ferne oder die Orientierung zwischen den beiden Fluorophoren, die FRET-Effizienz zwischen CFP und YFP beeinflusst. FRET kann visualisiert werden durch spannende CFP und YFP-Emission Monitoring (gestrichelte Linien). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des experimentellen Verfahren. p_upload/3410/3410fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Plk1 Aktivität wird zuerst sichtbar in den Kern in der G2-Phase und Gipfel während der Mitose. U2OS Zellen, die einen FRET-basierten Sonde Überwachung Plk1 Aktivität 9,14 wurden für 60 h mit einem Deltavision Spectris Imaging-System mit einem 20x NA 0,7 Luft objektive und eine Quecksilberlampe ausgestattet gefilmt. Imaging Bedingungen wurden gewählt, um minimal Phototoxizität verursachen, wie in Abschnitt 2 umrissenen, mit 4x Binning und Neutralfilter, dass Block 99% des einfallenden Lichts. A, falsche Farbdarstellung invertiert FRET-Ratio nach einer Zelle bis 4 Divisionen. B, Kymographion der Zelle in A nach dem Auftragen eine mittlere Filter angezeigt. C, Quantifizierung des invertierten FRET Verhältnis der Zelle in A. D dargestellt, kumulative mitotischen Eintrag von 50 FRET-Sonde exprimierenden Zellen, einschließlich Abteilungen der Tochterzellen.

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	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Überwachung FRET während des Zellzyklus erfordert Überlegungen, die weniger wichtig sind bei der Beurteilung der kurzfristigen Reaktionen auf äußere Reize. Zuerst wird das Fortschreiten des Zellzyklus leicht gestört durch Stress-Signalisierung, verlangen, dass Phototoxizität auf ein Minimum gehalten wird. Zweitens können alle Reporter möglicherweise beeinflussen zelluläre Prozesse durch Titration aus Kinasen, Phosphatasen oder Interaktion Domains. Der wohl einfachste Weg, um zu beurteilen, wenn die experimente...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, kein Phenolrot </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierten Reportern 1 erlauben die Beurteilung der endogenen Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen. Solche Sonden bestehen typischerweise aus Varianten von GFP und YFP, durch eine phosphorylierbaren Sequenz und einer phospho-bindende Domäne eingegriffen. Nach der Phosphorylierung FRET der Sonde ändert Konformation, die zu einer Veränderung des Abstandes oder der Orientierung zwischen CFP und YFP Ergebnisse, die zu einer Veränderung der Effizienz (Abb. 1). Mehrere Sonden haben in den letzten zehn Jahren veröffentlicht worden, die Überwachung der Aktivität Balance mehrerer Kinasen und Phosphatasen, darunter Reporter von PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 und Plk1 9 . Angesichts des modularen Aufbaus sind zusätzliche Sonden wahrscheinlich in naher Zukunft 10 austreten. Progression durch den Zellzyklus wird durch Stress signali betroffenng Wege 11. Bemerkenswert ist, dass der Zellzyklus unterschiedlich während ungestörte Wachstum im Vergleich zu, wenn die Zellen vor Stress erholt 12 geregelt. Zeitraffer-Bildgebung von Zellen durch den Zellzyklus erfordert daher besondere Vorsicht. Dies wird zu einem Problem vor allem beim Einsatz ratiometrische Bildgebung, da zwei Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich sind, um richtig zu interpretieren die Ergebnisse. Ratiometric FRET Bildgebung von Zell-Zyklus abhängig Veränderungen im Bereich der Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten vorwiegend muss Teilbereiche des Zellzyklus 8,9,13,14 beschränkt. Hier diskutieren wir eine Methode zur FRET-Sonden mit ratiometrische Bildgebung in der gesamten menschlichen Zellzyklus kontrollieren. Die Methode stützt sich auf die Einrichtungen, zur Verfügung zu viele Forscher in den Biowissenschaften ist und erfordert keine Fachkenntnisse der Mikroskopie oder Bildverarbeitung.

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Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Aufrufe.  Karolinska Institutet. FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Serie: Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Drawing Blood von Ratten durch die Vena saphena und durch Herzpunktion

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Forschung

Biologie

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...