Wir danken Andy Johnson von der Biomedical Research Center an der UBC für die Unterstützung bei FACS-Analyse. Cancer Research Funding im Wong Laboratory wird von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute (Betriebskostenzuschuss # 019250) und vom Forschungszentrum Reinvestment Mittel der Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, UBC zur Verfügung gestellt. JMYW wird durch die Forschung Kanada Stühle und der Michael Smith Foundation for Health Research Career Development Programme unterstützt.

1. Zellpräparation <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Abbildung 0" /> <ol><li> Tafel Zellen eine Dichte von etwa 60% Konfluenz zu erreichen. Die Zellen müssen in der log-Phase zum Zeitpunkt der Sammlung sein. Für MCF7-Zellen, wird dies durch Impfen mit 5 × 10 5 Zellen / 10 cm Platte in den entsprechenden Medien durchgeführt. HT29 und LS180 Zellen werden bei 6 x 10 5 Zellen / 6 cm Platte ausgesät. Wir verwendeten DMEM-Medium mit 10% FBS und 1 x Penicillin / Streptomycin ergänzt. Achten Sie darauf, Saat-Platten für den richtigen positiven und negativen Kontrollen inZusätzlich zu Ihrem Testproben. Dazu gehören die folgenden: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> ich </td><td> Positiv-Kontrolle </td><td> BrdU nur </td></tr><tr><td> ii </td><td> Positiv-Kontrolle </td><td> PI nur </td></tr><tr><td> iii </td><td> Negativ-Kontrolle </td><td> BrdU negativ, PI negativ </td></tr></tbody></table> (Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vorversuch mit mehreren Zeitpunkten wie die in diesem Protokoll beschrieben verwendet werden, um Eingrenzung der Zeitraum, während dessen Durchführung zukünftige Sammlungen werden.) <ol start="2"><li> Die ausplattierten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24-48 h, wodurch Zellen zu gewinnen und zu befestigen. </li><li> Zur Markierung von Zellen mit Bromdesoxyuridin (BrdU)-Pulses wird DMEM ersetzt with frisches Medium mit 10 uM BrdU. Die Zellen werden für 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2 für BrdU-Einbau in die DNA zu ermöglichen. Achten Sie darauf, eine Platte zu unbehandelten als negative Kontrolle agieren zu lassen. </li><li> Die Puls-Etikettenmedium wird entfernt und die Zellen kurz in 1X PBS gespült. </li><li> Frische Wachstumsmedium zugegeben (abzüglich der BrdU) und die Zellen werden darf, weiterhin bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die geeignete Zeitpunkt für die Ernte erreicht wird. </li></ol> 2. Ernte und Fixierung <ol><li> Unbehandelte Zellen aus Schritt 1.3 werden als die Null-Zeitpunkt. In diesem Beispiel kann zusammen mit dem Zeitpunkt 1 h, die unmittelbar nach der Behandlung wurden BrdU geerntet werden. </li><li> Um die Zellen zu ernten, wird das Medium entfernt und die Platten werden einmal mit 1 × PBS gespült. </li><li> Die Zellen werden trypsiniert, gesammelt in Kulturmedien und danach pelletiert durch Zentrifugation bei 1500 UpM für 5 min Supernatant wird verworfen. </li><li> Spülen Sie 1-10 x 10 6 Zellen in 5 ml eiskaltem 1X PBS. Zentrifugieren bei 1500 UpM für 5 min Überstand wird verworfen. </li><li> Das Zellpellet wird dann in 100 ul eiskaltem PBS / 1% FBS resuspendiert. Die Zugabe von 1% FBS in PBS vorbeugend gegen Zellverklumpung. </li><li> In diese Zellen tropfenweise zu 5 ml von -20 ° C, 70% Ethanol, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Inkubieren auf Eis für 30 min oder bei 4 ° C über Nacht. Dies ist ein idealer Schritt, an dem die Entnahme von Proben aus den verschiedenen Zeitpunkten zu stoppen. Die Proben können in Ethanol für mehrere Tage belassen werden, so dass sie gleichzeitig durch den Rest des Protokolls verarbeitet werden. </li></ol> 3. BrdU-und PI-Färbung <ol><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entfernen Sie das Fixativ, aber lassen Sie ~ 50 ul, in dem das Pellet durch Vortexen lösen. </li><li> Um die DNA zu denaturieren, langsam 1 ml 2N HCl / Triton X-100tropfenweise unter Vortexen. Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugieren von Proben für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Zellpellet in 1 ml 0,1 M Natriumtetraborat, pH 8,5, um die Denaturierung zu neutralisieren. </li><li> Zentrifuge Zellen für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 75 ul BrdU Färbung Mix (50 ul 0,5% Tween 20/1% BSA / PBS + 20 ul FITC-konjugierten Anti-BrdU + 5 ul 10 mg / ml RNase). </li><li> Bei Raumtemperatur für 45 min vor Licht geschützt. </li><li> Die Zellen zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Proben für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 5 mg / ml Propidiumiodid. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Um die Zellen zu analysieren, ein Durchflusszytometer mit einem 488 nm-Laser und der ausgestattetgeeignete Filter erforderlich ist. Analyse-Software wie CellQuest ist nötig, die Rollen unten beschrieben zu schaffen. </li><li> Bei der Ausführung der Probe durch das Durchflusszytometer, erstellen Sie eine Forward Scatter (SSC-H) vs Side Scatter (FSC-H) Plot um die richtige Größe Verteilung der Zellen (Abbildung 1A) zu gewährleisten. Diese beiden Parameter werden auf einer linearen Skala aufgetragen. </li><li> Gleichzeitig sehen ein Grundstück von FL3-H (PI-Färbung) vs FL2-W (Abbildung 1B). Diese grafische Darstellung wird verwendet, um ein Gate (R3), um die Fraktion von Zellen, die innerhalb des normalen Verteilungsmuster des Zellzyklus zu isolieren erstellen. Im allgemeinen wird diese Verteilung, das durch zwei Gruppen von Zellen aus dem 2N und 4N DNA-Gehalt von PI-Färbung, die die G1 und G2-Phasen des Zellzyklus, jeweils ist. Eine Reihe von Zellen zwischen diesen 2-Clustern angeordnet ist repräsentativ für laufende DNA-Replikation, die in der S-Phase des Zellzyklus erfolgt. </li><li> Erstellen Sie ein Grundstück displaying der Gated-Zellen (R3) aus Schritt 4.3, mit FL1-H (FITC, log-Kurve) auf der y-Achse und PI (lineare Darstellung) auf der x-Achse (Abbildung 1C). Dieses Grundstück wird verwendet, um die restlichen Parameter mit Hilfe der verschiedenen Steuerelemente in 1.1 skizziert, sowie Daten zur Analyse zu sammeln eingestellt werden. </li><li> Platzieren Sie die PI nur gebeizt Probe auf das Zytometer. Stellen Sie den Gain auf G1 bei ~ 200 Stellen auf der x-Achse. Dies wird es leichter zu visualisieren in einem Histogramm Plot des PI-Färbung. </li><li> Eine zweite Kontrolle betrifft Betrieb eines BrdU-Probe nur am Durchflusszytometer. Stellen Sie die Verstärkung, so dass die zwei Populationen von Zellen (BrdU positive vs BrdU negativ) auf dem Grundstück erscheinen. Idealerweise sind die BrdU-negativen Zellen positioniert ist, um direkt unter 10 -1 zu sehen. </li><li> Die Endkontrolle ist der BrdU / PI negative Probe. Führen diese negative Kontrolle, um sicherzustellen, dass Zellen nicht in einem der oberen rechten Quadranten oder angezeigt. </li><li> Nachdem die Parameter der verschiedenen Parzellen festgelegt wurden, dieDurchflusszytometer ist kalibriert und bereit für die Verarbeitung von BrdU-und PI-gefärbten Zellen. Ein Minimum von 10.000 Zellen, die gated in der richtigen PI-Fraktion (siehe 4.3 Schritt) sind, müssen pro Sammlung gelesen werden. </li><li> Um die gesammelten Daten zu analysieren, die Software wie FlowJo oder FacsDiva genutzt. Jede der oben genannten Handlungen können in dieser Programme neu erstellt werden und quantitative und statistische Analysen durchgeführt. </li><li> Der Endpunkt der Analyse umfasst mehrere aufeinanderfolgende Schritte. Erstellen einer Parzelle von FITC vs PI mit PI-Zellen gated als positiv von der PI vs FL2-W Grundstück ermöglicht es, die Rad-Bevölkerung zu unterscheiden. Ein zweites Tor wird von diesem Grundstück durch Isolierung des BrdU-positiven Bevölkerung geschaffen. Ausdruck dieses unverwechselbare Bevölkerung in einem Histogramm Plot mit PI auf der x-Achse erlaubt es, den zeitlichen Verlauf des Zellzyklus zu verfolgen. Dies kann weiter visualisiert, indem die Anzahl der BrdU-positive Zellen mit G1 oder G2 als eine Funktion der Zeit. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Normalerweise Rad Zellen mit Propidiumiodid gefärbt haben unterschiedliche Peaks bei G1 und G2, entsprechend Zellen mit 2N und 4N DNA-Gehalt, jeweils (2). Puls-Markierung mit BrdU ermöglicht selektive Markierung von einer Subpopulation von Zellen, die aktiv sind Synthetisieren DNA (dh S-Phase). Kurz nach dem Entfernen des BrdU-Reagenz, sind alle markierten Zellen in S-Phase (Abbildung 3). Durch die Beschränkung auf die Kennzeichnung eines kurzen Impulses man in der Lage, diese nun verschiedene Sub-Population von Zellen, während zahlreiche Zeitpunkten folgen, als sie durch den späteren Phasen des Zellzyklus passieren. Dies kann an der 1 h Zeitpunkt in Abbildung 3 als deutlichen Mangel an G1 und G2 Peaks visualisiert. Zusätzliche Informationen können aus dem BrdU-Markierung Schritt abgeleitet werden. Nicht nur kann der Anteil von aktiv teilenden Zellen gemessen werden, aber ein EstiMate von Zellzyklusstadium Verteilung zwischen zwei Proben können ebenso bestimmt werden. Durch Sammeln von Zellen in gleichmäßig beabstandeten Intervallen nach der Entfernung des BrdU-Reagenz, kann Zellen zurückgeführt, wie sie Zyklus Fortschritte G2 fortgesetzt werden und schließlich durch die Zellteilung der ursprünglichen Zellen zu bewegen, endlich dabei als BrdU-positive Tochterzellen mit G1 DNA-Gehalt (Abbildung 4). Ein Beispiel für Zellzyklusphase Quantifizierung und kinetische Analyse ist in 5 vorgesehen. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. (A) gegen Forward Scatter Side Scatter Plot einer repräsentativen MCF7 Zellpopulation. (B) im Vergleich zu PI-Breite (FL-W) Plot einer repräsentativen MCF7 Zellpopulation. Gating wird gezeigt, dass Zell-Dubletten in letzter Instanz (R3) auszuschließen. Zellendubletten wird eine größere Impulsbreite als eine einzelne Zelle, wie sie mehr passieren zu durch den Laserstrahl und therefErz kann aus der Analyse ausgeschlossen werden. (C) im Vergleich zu PI-FITC (BrdU) Plot einer repräsentativen MCF7 Zellpopulation. Gating wird gezeigt, dass nur die FITC (BrdU)-positiven Zellen (R4) umfassen. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Vertreter Histogramm Plot von einer Gesamtbevölkerung von normalerweise proliferierender Zellen. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> 3. Histogramm Diagramm der Zellen, die 1h haben nach dem Entfernen des BrdU-Impuls erfasst, nachdem Gating für FITC (BrdU)-positive Zellen. BrdU-positive Zellen in einem frühen Zeitpunkt nach der Entfernung des Etiketts für PI-Profile, die den Proben-DNA Anzeige Inhalt, der mit Zellen, die in der S-Phase des Zellzyklus sind, über die erfolgreiche Markierung von Zellen nur während der DNA-Synthese entsprechen. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Bild 4&quot; /&gt; Abbildung 4. Vergleich von Zellzyklus-Kinetik zwischen Krebszelllinien, Darmkrebs HT29 (A) und LS180 (B), sowie Brustkrebs MCF7 (C). Die Zellen wurden jede Stunde für 8 Stunden gesammelt, nach dem Entfernen des BrdU Puls. Bei diesem Experiment beobachteten wir ein klares Profil des beschleunigten Fortschreiten des Zellzyklus durch die G2-Phase des Zellzyklus in der kolorektalen Zelllinie LS180. Vergleicht man die Kinetik zwischen den beiden Profilen von Darmkrebs-Zellen, ist die Entstehung eines G1-Peak bei T = 4h post-BrdU zeigt sich in den LS180-Zellen, verglichen mit dem entsprechenden Zeitpunkt für die HT-29-Zellinie, die diesen Gipfel fehlt. Im Vergleich mit entweder einer der beiden kolorektalen Zelllinien MCF7-Zellen werden zu einem deutlich reduzierten Rate Radfahren. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <html> re 5 &quot;/&gt; Bild 5. (A) Quantitative Zellzyklusphase Analyse BrdU-markierten Krebszellen. Der Dekan / Jett / Fox-Algorithmus wurde an HT29, LS180 und MCF7 (dargestellt in Grün) angewendet. Die resultierenden Zellzyklusphase Verteilungen von jeder Probe werden als% insgesamt BrdU-positive Zellen für jede Phase exprimiert. Nur ausgewählte Zeitpunkte für jede Zelllinie angezeigt werden, wie die Analysen für einige der früheren Zeitpunkten produziert falschen Ergebnissen führen. In diesen früheren Zeitpunkten, sind alle BrdU-positive Zellen in S-Phase und daher nicht verschiedene G1 und G2 Peaks, die für Algorithmus Anwendung geeignet sind. (B) Histogramme von Krebszellen zeigt die Kinetik der Progression durch G2 / M-Phasen des Zellzyklus. Progression durch G2 / M Phase ist am schnellsten für LS180-Zellen, von HT29 und MCF7 gefolgt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <html> jpg &quot;alt =&quot; Abbildung S1 &quot;/&gt; Abbildung S1. Durchflusszytometrie Kontrollen. MCF7-Zellen werden als (A) negative Kontrolle, wo Zellen sind weder PI oder BrdU gefärbten gezeigt. (B) nur PI angefärbt. (C) BrdU-FITC markierten Proben. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Abbildung S2" /> Abbildung S2. Schematische Darstellung, die die Beziehung zwischen Fluoreszenzemissionsspektrum des PI gegenüber FITC (BrdU). Die spektralen Fenstern Sammlung für Leuchtstofflampen Kanal 1 (FL1, für FITC) und Fluoreszenz-Kanal 3 (FL3, für PI) in entsprechenden Kästchen angezeigt. Es gibt keine Überschneidungen zwischen Farbstoffspektren FL1 und FL3 Erkennung. Offensichtlich ist Fluoreszenzkompensation nicht erforderlich, wenn experimentelle Daten von PI und FITC-BrdU-markierte Zellen co in den FL1/FL3 Kanäle jeweils gesammelt. Fluoreszenzspektren wurden von BD Biosciences Website erhältlich:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit BrdU-Einbau, wir haben die notwendigen Werkzeuge, um die Kinetik des Zellzyklus zu studieren. Das markante Eigenschaft von BrdU als Thymidinanalogon funktionieren ist das, was für DNA-Gehalt Quantifizierung einer Rad-Zelle. Der Einbau von BrdU in einen wachsenden Tochter-DNA-Strang während der Synthese-Phase des Zellzyklus ist, was erlaubt es, eine Subpopulation von Zellen handelt durch die Replikation der DNA in S-Phase zu folgen, einer Wachstumsphase bei G2 und schl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bromdesoxyuridin </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml Lager </td></tr><tr><td> FITC-anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumtetraborat </td><td> Fischer </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> FACS Caliber </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Präzise Kontrolle der Einleitung, die Progression durch die verschiedenen Phasen des Zellzyklus sind von größter Bedeutung in proliferierenden Zellen. Handy-Zyklus-Teilung ist ein integraler Bestandteil von Wachstum und Vermehrung und Deregulierung wichtiger Zellzyklus Komponenten in den auslösende Ereignisse der Karzinogenese 1,2 gebracht. Molekulare Wirkstoffe in Anti-Krebs-Therapien zielen häufig biologische Pfade für die Regulation und Koordination von Zellzyklus-Division 3. Obwohl Zellzykluskinetik bis nach Zelltyp unterschiedlich neigen, ist die Verteilung der Zellen unter den vier Phasen des Zellzyklus und nicht konsistent innerhalb einer bestimmten Zelllinie durch die ständige Praxis Mitogen und Wachstumsfaktor Ausdruck. Gentoxische Ereignisse und andere zelluläre Stressoren können in einem temporären Block des Zellzyklus führen, was zu einer vorübergehenden Festnahme oder Pause in einer bestimmten Zelle Zyklusphase für Institutionen ermöglichensuchung der entsprechenden Antwort-Mechanismus. Die Fähigkeit, experimentell zu beobachten, das Verhalten einer Zellpopulation mit Bezug auf die Zellzyklusprogression Stufe ist ein wichtiger Fortschritt in der Zellbiologie. Gemeinsame Verfahren wie die mitotische abzuschütteln, differentielle Zentrifugation oder auf Basis der Durchflusszytometrie Sortierung werden verwendet, um Zellen in bestimmten Phasen des Zellzyklus 4-6 zu isolieren. Diese fraktionierte, Zellzyklus-Phase angereicherte Populationen werden dann auf experimentelle Behandlungen unterzogen. Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit der getrennten Fraktionen können oft kompromittiert Verwendung dieser physikalische Trennverfahren werden. Wie gut, kann die Zeitspanne zwischen Trennung der Zellpopulationen und dem Beginn der experimentellen Behandlung, wobei die Zellen aus der fraktionierten ausgewählten Zellzyklus-Stadium fortschreiten kann, vor erhebliche Herausforderungen bei der erfolgreichen Umsetzung und Interpretation dieser Experimente. Andere Ansätze zur Study Zellzyklusstadien umfassen die Verwendung von Chemikalien, um Zellen zu synchronisieren. Behandlung der Zellen mit chemischen Inhibitoren der wichtigsten Stoffwechselprozesse für jede Phase des Zellzyklus sind nützlich bei der Blockierung der Verlauf des Zellzyklus zur nächsten Stufe. Zum Beispiel, begrenzen die Ribonucleotid-Reduktase-Inhibitor Hydroxyharnstoff hält Zellen in der G1 / S Stelle durch die Zufuhr von Desoxynukleotiden, die Bausteine ​​von DNA. Andere bemerkenswerte Chemikalien umfassen eine Behandlung mit Aphidicolin, um eine Polymerase-Inhibitor alpha für G1-Arrest, Behandlung mit Colchicin und Nocodazol, die beide mit mitotischen Spindel stören Zellen in M-Phase zu stoppen und schließlich die Behandlung mit dem DNA-Kettenterminator 5-fluorodeoxyridine zu initiieren S-Phase Festnahme 09.07. Die Behandlung mit diesen Chemikalien ist ein wirksames Mittel zur Synchronisation eines gesamten Population von Zellen in einer bestimmten Phase. Mit Entfernung der chemischen herkommend Zellen den Zellzyklus unisono. Die Behandlung des Testmittels folgenden Releaseaus dem Zellzyklus blockierende chemische sichergestellt, dass die Reaktion auf Arzneimittel hervorgerufen von einer gleichförmigen, Phase des Zellzyklus-spezifischen Population ist. Allerdings sind da viele der chemischen Synchronisierungen genotoxische Verbindungen bekannt, Hänseleien auseinander die Beteiligung der verschiedenen Response-Wege (zu den Synchronisierungen im Vergleich zu den Test-Agenten) ist eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur metabolischen Markierung nach einer Subpopulation von Zellen aktiv Radfahren durch ihre Progression aus der DNA-Replikation Phase, durch die Teilung und Trennung von ihren Tochterzellen. In Verbindung mit Durchflusszytometrie Quantifizierung ermöglicht dieses Protokoll für die Messung der kinetischen Fortschreiten des Zellzyklus in Abwesenheit von entweder mechanisch oder chemisch induzierte zelluläre betont gewöhnlich mit anderen Zellzyklus-Synchronisation Methoden 10 zugeordnet ist. In den folgenden Abschnitten werden wir die Methodik, sowie einige seiner Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Aufrufe.  University of British Columbia. Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Serie: Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...