We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

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The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir Phenomic Ansätze für die funktionelle Charakterisierung von putativen Phagen-Gene. Techniken umfassen eine entwickelte Assay in der Lage Überwachung Host anabolen Stoffwechsel, die Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten), zusätzlich zu den etablierten Verfahren der Metabolomik, die Messung von Auswirkungen auf Energiestoffwechsel. Wir stellten zusätzliche Werkzeuge, um die großen Datenmengen von diesen Technologien resultierenden verwalten, so dass für hohe Durchsatzverarbeitung und Analyse 24. Schließlich durch den Vergleich eines kommentierten Phagen Kapsidprotein, Phagen Thioredoxin, zwei mutmaßliche metabolische Phagen-Genen, und die durchschnittliche experimentelle Reaktion schlagen wir verschiedene Strategien, um beide Datensätze und Gen-Klassen zu interpretieren, wobei der Schwerpunkt auf der Identifizierung von Trends und phänotypische Identifizierung von Ausreißern. Wie bereits erwähnt, beide Ansätze quantitativ zu messen nur die Hälfte der Wirtsstoffwechsels. Um die relative Funktion der einen der interpretierenneuartige Proteine ​​untersuchten Daten aus beiden Verfahren ist erforderlich, um Hinweise auf Funktion bereitzustellen. Zwar ist dies nicht ein Schwerpunkt unserer aktuellen Manuskript wird Datenausgänge von jedem Phenomic Verfahren durch kombinatorische Analysen, die auf Clustering-Techniken konzentrieren, wie Zufalls Wald und Hauptkomponentenanalyse setzen. Darüber hinaus müssen Hypothesen der kombinierten Analyse resultierenden anschließend von traditionellen genetischen Methoden validiert werden. Schließlich stellte die Verfahren sind stark von bakteriellen Physiologie beeinflusst und damit die gleichen Standards zu folgen. Bei der Durchführung jedem Verfahren müssen Überlegungen anzustellen, um unabhängige, klonalen Gruppen mit experimentiert zu gewährleisten; Kontamination verhindert wird; eine einzelne Variable getestet wird; und entsprechende Kontrollen werden gleichzeitig liefen. Die Nichtbeachtung dieser Punktekonto wird in unklare Ergebnisse, ähnlich wie bei jedem physiologischen Test führen. Multi-Phänotyp-Assay-Platten(MAPs) Die Entwicklung von MAPs bietet einen hohen Durchsatz und anpassungsfähige Test im Vergleich zu derzeit verfügbaren Technologien (5A und Tabellen 1,2). Der Test verwendet Versorgung, Ausrüstung und grundlegende Techniken in allen mikrobiologischen Labors. Der Einbau einer Rechenpipeline PMAnalyzer 24 zur nachfolgenden Datenverarbeitung und Analyse stellt eine schnelle Interpretation der Daten. Darüber hinaus können beide experimentellen und analytischen Aspekte der Ansatz leicht eingestellt oder für kundenspezifische Zwecke abgestimmt werden. Zum Beispiel, wenn ein Großteil der Daten nicht zur Filterung in Abschnitt 4 beschrieben weitergeben, kann man manuell über den Wachstumskurven zu sichten, um Probleme zu identifizieren. Wenn das Problem entsteht aufgrund der strengen Filterparameter können Anpassungen an das Skript werden. Alternativ kann, wenn Probleme mit dem experimentellen Prozess verbunden (dh verlängert Kondensation; unsachgemäße Übertragung von bakteriellen cells, etc.) werden zusätzliche Wiederholungen ohne weiteres wiederholt werden. Wie in Cuevas et al. 24 beschrieben, ist die PMAnalyzer eine einzige bash-Programm als ein Wrapper-Skript, das die Analyse und Analyse Skripte als zusammenhängende, automatisierten Pipeline führt geschrieben. Alle Skripte sind, indem der Mittelwert für jeden Zeitpunkt in dreifacher Ausfertigung Daten frei zugänglich von einem Git-Repository bei 25, und anschließend parametriert die logistische Kurve, um die Verzögerungszeit zu erhalten, maximale Wachstumsrate, Asymptote, und eine neue Sicht Wachstumsniveau. Der Median-Wert wurde über die mittlere in unserer Studie, um die Wirkung von großen Ausreißer reduzieren gewählt, jedoch kann das Skript leicht angepasst, um den Mittelwert Replikatdatenserver berechnen. Aufgrund der reduzierten Variation (SE) über Replikatdatenserver (2A) ersichtlich wir aufrechterhalten die Verwendung des Medianwertes PMAnalyzer zum Anbringen einer logistischen Kurve. Zusätzlich wird die für das Wachstum abgeschnitten in dieser Studie (GL ≥ 0,4) war die Detedurch den Vergleich, wie Daten über Wachstumsstufe und maximale Wachstumsrate getrennt rmined (1A, B). In Abhängigkeit von der Instrumente und Modellsystem verwendet diesen Begriff können variieren, Neudefinition dieses erfordern abgeschnitten Wert. Ein Hauptvorteil unserer Assay ist die Fähigkeit, Phänotypen mit einem einzigen Parameter, der Gesamtmikrobenwachstum, die wir als Wachstumsniveau (GL) zu vergleichen. GL ist eine harmonische Mittel und mindert daher die Auswirkungen der großen Abweichung in den Daten. Die Verwendung eines harmonischen Mittelwert mit verschoben logistic ausgestattete Werte zur Verfügung zu stellen eine Zusammenfassung des Wachstums wurde bei durch Versuch und Irrtum angekommen. Andere Methoden versucht, unterscheiden Wachstum enthalten: Zeit, die spezifischen Kurvenparameter (Halb μ max, μ max und Tragfähigkeit), die Bestimmungskoeffizienten (R 2), und Kombinationen der R 2, multipliziert mit bestimmten Kurvenparameter zu erreichen. Mit Hilfe eines harmonische Mittel mit verschobenlogistic-fit Werte für den GL vorgesehen die größte Reichweite bei der Bewertung Wachstum, so wurde es die Methode der Wahl. Eine Überlegung zu beachten ist, dass dynamische Wachstumskurve Muster haben das Potential, bei der Verwendung eines einzelnen Parameters oder eines angepassten Modells verloren. Zum Beispiel sind die einzelnen Kurvenparameter der logistischen Kurve und der GL unfähig darstellt biphasische Wachstum. In einer einzigen Kohlen Umwelt, diese Wirkung auf das Wachstum impliziert Vermittlung des viralen Proteins zu beiden Umsetzung des Substrats oder der Substratverwertung Verschiebung. Zusätzliche Effekte möglicherweise verloren, wenn nicht unter Berücksichtigung mehrerer Wachstumsparameter umfassen: verlängerte Verzögerungszeit, schlägt eine erhöhte Belastung der viralen Maschinen oder Produkte; schnell beschleunigt exponentiellen Phase, was auf virale Proteine ​​gekoppelt sind, um die Energieproduktion Wege auszurichten; oder höhere Biomassebildung, was impliziert, viralen Träger in Wirtsnährstoffaufnahme und Anabolismus (Daten nicht gezeigt). So Plotten im Entstehen begriffenen Wachstumskurven ( <strong&gt; 2A, B) enthält Informationen zu Trends im Zeitverlauf, während die GL berücksichtigt die wichtigsten Variablen der logistischen Modell und bietet eine einzige quantitative Zahl für den Gesamterfolg eines Klons dar. Bei der Betrachtung der unterschiedlichen Reaktionen von strukturellen und metabolischen Gene in den MAPs beigetragen, stellt man fest, dass die unterschiedlichen Substratklassen in Frage stellen den größten Beweis für die Proteinfunktion. Beispielsweise werden Proteine ​​häufig mit metabolischen Nahme der limitierende Nährstoff, die unspezifisch an Zentralstoff 16,32 Host assoziiert sind. Vorläufige MAP Experimente zeigen, dass Klone vermeintlichen Stoffwechsel Phagen-Gene eine erhöhte Lag-Phase, als am zentralen Stoffwechsel Kohlenstoffquellen (2A) gewachsen. Umgekehrt Klone, die mutmaßlichen Strukturgene, die große Anteile an Gastgeber Energie und dNTP-Pools erfordern, führen zu einer falsch positiven Reaktion auf das Wachstum für central und Aminosäurestoffwechsel Kohlenstoffsubstraten. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Ansammlung von unlöslichen Proteinen, was zu Host Filamentierung und / oder Einschlusskörper als über Mikroskopie (2A und Daten nicht gezeigt) beobachtet. Während weitere Analyse erforderlich ist, um diese vorläufigen Ergebnisse bestätigen, sind die Karten in der Lage ist das Abrufen phänotypischen Antworten, die die Funktionen von spezifischen Phagen-Gen-Klassen Hypothese zu korrelieren. Neben der Aufklärung der unbekannten viralen Proteine ​​sind die MAPs eine neuartige Ressource, um die funktionelle und metabolische Diversität eines einzelnen Bakterium oder eine Gemeinschaft von Bakterien zu untersuchen. MAP-Komponenten sind für die einfache Veränderung, um das Wachstum einer Reihe von Bakterien unterstützen entworfen; einschließlich Meeres, auxotroph, und anaerobe Mikroben. Zur Erleichterung dieser Bemühungen die definierten Basis-und pre-Wachstumsmedien erfordern zusätzliche oder eingestellt chemischen Spezies, bevor eine andere Bakteriengattung in den MAPs unterstützt werden.Ein Hinweis auf diese Verwendung der Karten ist es, definierte Medien zu erhalten, das Verbot der Verwendung von Inhaltsstoffen wie Trypton, Hefeextrakt und Pepton. Metabolomics Der Bereich der Metabolomics ist abhängig von Stoffwechseldatenbanken, die durch Massenspektrometrie identifiziert isoliert Metaboliten enthalten. Die Core Facility hier gewählt hat eine der größten Metabolomics-Datenbanken. Interessanterweise waren mehr als die Hälfte der Stoffwechselprodukte aus unserer Experimente resultierenden identifizierbaren (~ 65%), während andere noch nie zuvor in unserer Gast aufgezeichnet wurde, Escherichia coli (Beispiele: Indol-3-Essigsäure 33, Salicylsäure 34 und Dihydroabietinsäure 35). Dies könnte entweder auf eine starke Tendenz der Datenbank zu Pflanzenstoffe, oder die spezifischen Proteine ​​in Untersuchung zurückzuführen. Unabhängig davon ist das Ergebnis einer begrenzten Anzahl von bekannten Metaboliten zur Datendarstellung und Analyse zur Verfügung. In der futur, mehrere Metabolomik Methoden mit verschiedenen Datenbanken würde für eine größere Stoffwechselabdeckung zulassen. Derzeit bekannte und unbekannte Metaboliten werden beim Vergleich und die Gegen unserer neuartigen virale Proteine. Mit diesem Ansatz stellen wir die Hypothese, dass Klone, funktionell ähnliche Proteine ​​eine erhöhte Ähnlichkeit in ihrer vollständigen metabolomic Profil teilen. Vorab metabolomics Analyse zeigte, dass während strukturelle und metabolische Gene nicht eindeutig voneinander trennen, diese Gene ähnliche Effekte auf die Wirts aufweist, wenn er nicht überexprimiert korreliert (Figur 6). Zum Beispiel können die kommentierten Capsid Gencluster eng mit den mutmaßlichen metabolischen Gene markiert in dieser Studie EDT2440 und EDT2441. Untersuchungen die einen öffentlich zugänglichen Transmembrantopologie und Signalpeptid-Vorhersageprogramm ergaben sich Hinweise, dass beide mutmaßlichen metabolischen Gene beherbergen eine einzelne Transmembrandomäne. Interessanter 5 von the 9-Klone in der ersten Cluster-Gruppe (die meisten linken Teil der Dendrogramm) sind Transmembrandomänen mit der gleichen Topologie Programm vorhergesagt. Weitere Untersuchungen erforderlich sind, ist es jedoch wahrscheinlich, daß die bei der Überexpression dieser Klone Metaboliten sind mit zellulären Stress-Antwort von Membran oder Strukturlasten zu verbunden. Dieser Beweis stützt, dass während der Daten metabolomics besitzt eine erhöhte Menge an Rauschen, der fähig ist hervorgehoben Signale allgemeinen Wirkungen von Genen, sowohl innerhalb eines Gens Klasse unterscheiden, ist das Verfahren. Um festzustellen, ob die Methode, die das Auslesen aus spezifischen Informationen der Genfunktion ist, wurden Metaboliten in die spezifische Stoffwechselwege gruppiert. Die Hypothese, der ist, wenn ein Klon wirkt spezifisch für eine einzelne Bahn Metaboliten, dann ist das überexprimiert Gen in diesem Weg aktiv. Vor der Einrichtung unserer Metabolomik Qualitätssicherung Pipeline, ergab vorläufige Daten, die über eined repräsentiert Metaboliten waren typischerweise &quot;unbekannt&quot; bleibt, dass sie nur wenig Informationen über die Wege der sie zugeordnet sind (Daten nicht gezeigt). Vorverarbeiteten metabolomics Daten offenbart jedoch, dass die Mehrzahl der Metabolit Profile ähnlich sind und nur eine ausgewählte Anzahl von unbekannten und bekannten Metaboliten Häufigkeiten variieren von Klonen, beispielsweise Putrescin und Uracil (Abbildung 6). Um eine höhere Auflösung der Proteinfunktion Bemühen stellen werden unternommen, um experimentell zu vergleichen, die die neuen Phagen-Gene gegen bekannte Phagen-Gene, die verwendet werden kann, um in die &quot;Löcher&quot; von Metaboliten auf Basis funktionelle Charakterisierung zu füllen. Unter Verwendung dieser Technik bietet die zugeordnete Funktion von bekannten viralen Genen eine Referenz für die Funktion der unbekannten Genen. Dennoch der limitierende Faktor der Metabolomics-Analyse ist die Größe und Bedeutung der Datenbank. Um dieser Einschränkungen metabolomic Datenbanken relatable dieser Forschung entwickelt werden müssen zu korrigieren; soals Datenbank von Metaboliten und deren Häufigkeiten der spezifisch auf die ASKA Sammlung von E. coli Klone, bei denen ein einzelner ORF überexprimiert 36. Der Nachweis für die Notwendigkeit einer solchen Datenbanken wurde im Jahr 2013 zur Verfügung gestellt, als Forscher an der Lawerence Berkeley National Laboratory kompiliert die erste umfassende Datenbank der spezifischen gesamten Mutantenbibliotheken von Modell Bakterien 37 Metaboliten. Diese Forschung werden neue Einblicke in Genen, die für Verwendung von bestimmten Metaboliten erforderlich ist, enthüllt die klaren Zusammenhang zwischen Phänotyp und Genotyp. Bei der Prüfung, Metabolomik als Werkzeug, ist es wichtig zu definieren, die Verarbeitung Regime folgte an der Core Facility. Ein Artefakt der meisten experimentellen Verfahren ist der Tag-zu-Tag Varianz mit den Instrumenten der Verwendung verbunden. Bis heute alle GC-MS-Analyse implementiert die Verwendung von internen Standards, die in jede Analysenserie enthalten sind; aber Zugabe von projektspezifischen internen Proben &lt;/ Em&gt; lief jeden Tag des Experimentierens entfernt zusätzliche Varianz. Diese Überlegungen müssen frühzeitig angegangen werden, um eine Normalisierung Probleme und Verzerrungen zu vermeiden. Eine andere Lösung ist es, alle Proben bei einer Kernanlage auf der gleichen Maschine und als eine einzige Partie, eine Option zu jeder Kernanlage zur Verfügung zu verarbeiten. Die verschiedenen Werkzeuge vorgestellt und sowohl in dieser Handschrift neu erforscht, neuartige Mittel zum Screening und Charakterisierung funktionell unbekannt Phagen-Gene. Die Einfachheit und Anpassungsfähigkeit der experimentellen Techniken mit dem stromlinienförmigen Einsatz von Rechenrohrleitungen gewährleistet, diese Methoden sind für ein breites Spektrum von Forschungsvorhaben und Felder. Unser Ziel ist, dass die hier vorgestellten Ansätze Phenomic wird weitere Untersuchungen neuartiger Phagenproteine ​​zusätzlich zu Systemen, die gleichermaßen funktionell undefined sind zu unterstützen.

Viren, die Bakterien (aka Bakteriophage oder Phage) befallen sind schätzungsweise bei mehr als 10 31 virusähnlichen Partikeln (VLPs) global in einer Umgebung vorhanden sind und 1,2 überwiegen alle anderen Organismen. Die erste metagenomic Studie zur Untersuchung der viralen Gemeinden mit Meeresumgebungen konzentrierte sich auf die Quantifizierung der Vielfalt innerhalb der Virusfraktion 3 zu sehen. Zusätzlich Breitbart und Kollegen festgestellt, dass mehr als 65% der viralen Sequenzen gemeinsam Gemeinschaft keine Homologie zu irgendwelchen Sequenzen in öffentlichen Datenbanken. Nachfolgende metagenomic Studien fanden ähnliche Beweise: Metagenomen aus marinen Sedimenten in San Diego, Kalifornien enthalten 75% unbekannt viralen Sequenzen 4; Metagenomen von hypersaliner Seen des Salton Sea enthalten 98% unbekannt viralen Sequenzen 5; und Korallen-assoziierten Metagenomen enthalten 95 bis 98% unbekannt viralen Sequenzen 6. Diese Anhäufung von unkommentierte Informationen führte zuPhagen genetischen Materials, &quot;der dunklen Materie des biologischen Universums&quot; 7. Genoms von Phagen beruht auf der Identifizierung Sequenzähnlichkeit durch Vergleich mit bestehenden Nukleinsäure und Protein-Datenbanken. Weil Phagen-kodierte genetische Information ist in erster Linie bekannt ist, sind Homologie-basierte Methoden unwirksam. Innerhalb ihres Genoms, Phagen kodieren typischerweise drei großen Gen-Typen: Transkription und Replikation Genen, Stoffwechsel-Genen und Strukturgene. Die Transkription und Replikation Gene (Klasse I / II-Gene 8) schließen Polymerasen, Primasen, endo / exo-Nukleasen und Kinasen. Diese Gene sind hoch wegen ihrer Bedeutung in Phageninfektion konserviert, Transkription und Replikation von Phagen genetischen Materials. Phagen-Polymerasen werden leicht unter Verwendung von herkömmlichen Methoden, Sequenzhomologie identifiziert durch ihre globale Erhaltung 9 und ist gezeigt worden, als wirksame phylogenetischen Markierungen 10 dienen.Demgegenüber Phagen metabolischen und Strukturgenen (Klasse II / III-Gene 8) zunehmend divergent und oft als hypothetische Gene gekennzeichnet. Phage metabolischen Gene beeinflussen die Stoffwechselkapazität der Host und sind für die virale Replikation nicht unbedingt erforderlich. Diese Gene, die häufig als Hilfs metabolischen Gene 11 (AMGs) bezeichnet wird, scheinen Wirtsstoffwechsel modulieren und ermöglichen einen optimalen Verlauf der Infektion und den Erfolg der Virion-Reifung. AMGs haben mit der Nutzung und Aufnahme von Nährstoffen oder die Begrenzung der Energieproduktion Wege in Verbindung gebracht. Einige Beispiele sind Photo Gene in den Genomen verschiedener cyanophage 12-16 gefunden, Gene verbunden ist und durch Phosphatstoffwechsel 17,18 und Ausnutzung des Pentosephosphatwegs Phagen dNTP Biosynthese 18,19 geregelt. Im Vergleich dazu sind Strukturgene unter den mittleren bis späten Gene während der Infektion hergestellt und unterscheiden sich in den verschiedenen Phagen-host Systeme. Die Herstellung von Strukturproteinen sind abhängig von der Verfügbarkeit der viralen dNTP, und Energie-Pools für die Transkription, Translation und Anordnung 8. Das Kapsid und Schwanzfaserstrukturproteine ​​werden als die divergier aller viralen Protein-codierenden Genen erachtet und werden für eine erfolgreiche -Virionproduktion erforderlich. Ihre Divergenz wird in der Regel auf die aktive Rolle, die sie bei der Gestaltung der Virus-Wirt-Koevolution 20 spielen zurückzuführen. Divergier Proteinen, unabhängig von der Gen-Klasse, werden ohne weiteres bei Verwendung der herkömmlichen Homologie und Sequenzausrichtungstechniken übersehen. Ein Versuch, für die Beschränkungen mit strengen Sequenzvergleiche gesehen zu korrigieren hat in der Bioinformatik in der Lage, unter Verwendung von Sequenz Eigenschaften Verein, wie künstliche neuronale Netze 21 bestimmen geführt. Künstliche Neuronale Netze (KNN) ermöglichen die Vorhersage der strukturellen und metabolischen Gene erfordern jedoch stromabwärts experimentelle Validierung direkt zu charakterisierenGenfunktion. Das Ziel dieses Manuskript einem phenomic Protokollen zur Überwachung sowohl katabolischen und anabolischen Metabolismus eines Wirtsbakteriums während der Expression eines neuen Phagen-Gen bereitzustellen, funktionell durch ANNs vorhergesagt. Das Feld der Phenomics, die Biologie mit zellulären Phänotypen verbunden sind, ist in der Systembiologie gegründet, um bei der Untersuchung von Proteinen mit unbekannten oder pleiotrope Funktion unterstützen. Phenomic-Tools verwendet werden, um phänotypische Informationen genotypische Informationen zu verknüpfen. Wir stellen die Hypothese für putative Phagen Genen, deren Funktion (en) kann durch Beobachtung Host physiologischen Wirkungen während Phagen Genexpression bestimmt werden. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden zwei quantitative Methoden gewählt. Multi-Phänotyp-Assayplatten (MAPs) wurden verwendet, um Wirtssubstratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während metabolomics gemessen Host Metabolit Vielfalt und relative Häufigkeit während des Wachstums in bestimmten environmentale Zustände. Mutmaßlichen strukturellen und metabolischen Proteine ​​wurden in Escherichia coli überexprimiert und repräsentative Ergebnisse aus beiden Experimenten verglichen. Zahlreiche visuelle Techniken und Hochdurchsatz-Verarbeitungspipelines werden präsentiert, um experimentelle Replikation zu erleichtern. Schließlich sind die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der vorgestellten Methoden im Rahmen der erwarteten physiologischen Effekte für eine kommentierte Kapsidprotein und Phagen metabolischen Protein Thioredoxin, plus zwei putative AMGs diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Aktuelle Untersuchungen in den Phagen-Wirt-Interaktionen sind abhängig von Extrapolation Wissen aus (meta) Genome. Interessant ist, dass 60 bis 95% aller Phagensequenzen teilen keine Homologie zu aktuellen kommentierten Proteinen. Als Ergebnis sind ein großer Teil der Phagen-Gene als hypothetisch annotiert. Diese Realität stark wirkt sich auf die Annotation von beiden strukturellen und Hilfsstoffwechselgene. Hier präsentieren wir Phenomic Methoden entwickelt, um die physiologische Reaktion (n) einer ausgewählten Wirts während der Expression eines dieser unbekannten Phagen-Gene zu erfassen. Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten) werden verwendet, um die Vielfalt der Host Substratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während Metabolomik bietet bi-Produktanalyse durch die Überwachung Metabolit Fülle und Vielfalt. Beide Werkzeuge werden gleichzeitig verwendet, um eine phänotypische Profil mit Expression eines einzelnen putative Phagen offenen Leserahmen (ORF) verbunden sind. Repräsentative Ergebnisse für beide Methoden verglichen werden, highlighting die phänotypischen Unterschiede Profil eines Hosts, die entweder mutmaßlichen strukturellen oder metabolischen Phagen-Gene. Darüber hinaus sind die Visualisierungstechniken mit hohem Durchsatz Rechen Pipelines, experimentelle Analyse vereinfacht dargestellt.

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Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Aufrufe.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Serie: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.