Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Wir bestätigen Hannah Fox für Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH R01AI030612 zu gewähren.

1. Zellkultur, Virusinfektion und EdC Beschriftung ( Abbildung 1) das folgende Protokoll schließt die Arbeit mit Viren. Entnehmen Sie bitte Ihrer Institution &#39; s Bio-Sicherheit Protokolle für sichere Handhabung von Viren und anderen biologischen Arbeitsstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board von der University of Pittsburgh genehmigt.
<ol><li>Trypsinize eine konfluierende 150 cm 2 Gewebekultur Flasche MRC-5 Zellen und übertragen Sie die Zellen auf einer 600 cm 2 Gewebekultur Teller mit 100 mL DMEM plus 10 % FBS. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2 für 3-4 Tage, confluency und stationäre Phase zu erreichen. Ein konfluierende 600 cm 2 Teller enthält ~ 7 x 10 7 Zellen. Bereiten Sie 1 Platte für jede Kondition und 1 Platte für jede entsprechende Negativkontrolle. 
	Hinweis: Zellen die stationäre Phase um hemmen zelluläre DNA-Replikation, um sicherzustellen, dass nur vDNA ist beschriftet und in den nachfolgenden Schritten gereinigt erreichen müssen. 
	Hinweis: Jede Probe erfordert ein kostenloses unmarkiertem Negativkontrolle vorbereitet, mit dem gleichen Infektionsbedingungen und Zeitpunkt ohne Zusatz von EdC. 
	Hinweis: A verkleinerte Version von diesem Experiment sollte durchgeführt werden parallel zum Testen für die Kennzeichnung der zellulären DNA durch Bildgebung mit vergleichbaren Zellwachstum, Infektion, EdC, die Bedingungen, zu beschriften und Zeitpunkten (siehe Schritt2).</li>
	<li>Verdünnen, 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL kalte Tris-Buffered Kochsalzlösung (TBS). Entfernen Sie Wachstumsmedium und Lagern bei 37 ° C. Zu infizieren, MRC-5 Zellen 7 mL verdünnten Virus hinzu und rock für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach Adsorption Inokulum zu, spülen Sie mit 50 mL Raumtemperatur TBS und ersetzen Sie die ursprüngliche Wachstumsmedium. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2. Dieser Schritt sollte für jede Versuchsbedingung und negativ-Kontrolle durchgeführt werden. 
	Hinweis: Erhöhte EdC Kennzeichnung lässt sich mit HSV-1 Mutanten defekt für die Expression der viralen dUTPase (UL50-gen) bzw. Uracil Glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase hat geringe Substratspezifität und die Aktivierung von mehreren Nukleosid-Analoga 25 , 27 verringern kann.</li>
	<li>Label viraler Genome mit EdC. Folgen Sie den Anweisungen um eingehende Genome (1.3.1), Replikation Genome (1.3.2.) oder virale Replikation Gabeln (1.3.3.) zu beschriften. 
	Hinweis: Nur Schritt 1.3.1 und 1.3.2 1.3.3 sollte erfolgen, je nachdem, ob eingehende Genome, replizierte Genomen oder Replikation Gabeln in den nachfolgenden Schritten bzw. analysiert werden. 
	Hinweis: EdU oder f-Ara-EdU kann für EdC ersetzt werden. Die Toxizität von Nukleosid-Analoga sollten überwacht und minimiert werden.
	<ol><li>Verwendung prelabeled Bestände, Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen und fahren mit Schritt2 oder 3 innerhalb von 4 Stunden buchen (Hpi) Infektion untersuchen Langzeittransaktionen vDNA ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Bereiten Sie Aktien mit der zuvor beschriebenen Protokoll 25 prelabeled Virus. Virus Bestände müssen durchlaufen eine G-25 Spalte entfernen Rückstände EdC.</li>
		<li>Label replizierende vDNA durch Zugabe von 5-25 µM EdC, Zellkulturmedium infizierter Zellen für 2-4 h ( Abbildung 1 b). Bevor Sie hinzufügen, verdünnen EdC in 1 mL Wachstumsmedium.</li>
		<li>, Virale Replikation Gabeln, nach Beginn der vDNA Replikation zu kennzeichnen (&#8805; 4 Hpi), Puls-Label replizieren vDNA mit 5-25 µM EdC für 5-20 min. Um zu jagen, 3 X mit Chase 25-100 µM 2´deoxycytidine-haltigem Medium spülen (DeoxyC) und inkubieren Sie in Anwesenheit von Chase Medium für eine zusätzliche 20-40 min ( Abbildung 1). 
		Hinweis: Puls und Chase Medium sollte auf 37 ° C und 5 % CO 2 vor Gebrauch equilibriert. 
		Hinweis: Für Puls-Chase-Experimente ist es wichtig, die Zeitspanne zu berücksichtigen braucht es für Nukleoside, geben die Zelle und phosphoryliert werden, bevor sie in die Replikation von DNA integriert werden können. Dies muss empirisch ermittelt werden. 
		Hinweis: Um die Auflösung der Puls Chase Experimente zu ermitteln, berechnen Sie die virale Replikation Rate unter den experimentellen Bedingungen verwendet. Dies kann durch quantitative PCR viral Genome bestimmt werden, in einem einzigen Schritt Wachstum Zeit Kurs 26. 
		Hinweis: Für imaging-viraler Genome gehen Sie zu Schritt2 und für die Reinigung von viralen Genomen fahren Sie mit Schritt 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bildgebung des EdC gekennzeichnet DNA ( Abbildung 2A) Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie Bildgebung im Tandem mit der virale Genom-Reinigung-Methode um sicherzustellen, dass zelluläre DNA in Experimenten nicht beschriftet ist. Bildgebung kann auch verwendet werden, die Natur der beschrifteten vDNA visualisieren und Proteomics Daten validiert. Beispiele für zelluläre und virale DNA Färbung Muster sind in Abbildung 3.
<ol><li>Infektionen durchzuführen und EdC Kennzeichnung wie in Schritt 1 außer angegeben Bedingungen auf Deckgläsern in eine 12-Well-Zellkultur-Schale mit 1 mL Wachstumsmedium verkleinert.</li>
	<li>Fix Zellen mit 1 mL 3,7 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 15 min bei RT Nach der Fixierung, Zellen spülen 2 X mit 1 mL 3 % BSA in PBS. 
	Achtung: Paraformaldehyd kann ernsthafte oder dauerhafte Schäden verursachen. Sicherheitsvorkehrungen zu folgen. 
	Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Deckgläsern können bis zu 3 Tage bei 4 ° C in der zweiten Wäsche gelagert werden.</li>
	<li>Permeabilize Zellen mit 1 mL Permeabilisierung Puffer [siehe Tabelle der Materialien] für 20 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Spülen mit 1 mL 3 % BSA und dann Block mit 1 mL 3 % BSA mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Klick Reaktion cocktail [siehe Tabelle der Materialien] auf Deckgläsern kovalent Alexa Fluor 488 konjugieren Azid, EdC gekennzeichnet DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Fleck zelluläre DNA mit 1 mL einer 1:2,000 Verdünnung von Hoechst mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	Indirekte Immunfluoreszenz <li>Fleck mit primären und sekundären Antikörper nach Standard Protokolle 25. 
	Hinweis: Markierte vDNA colocalizes mit ICP8, ICP4 oder UL42 und mit der Bezeichnung zelluläre DNA mit Hoechst-Fleck colocalizes.</li>
	<li>Montieren Deckgläsern auf Folien und image-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop. 
	Hinweis: Dias können bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Reinigung des vDNA und verbundenen Proteine Hinweis: verschiedene Aspekte dieses Protokolls wurden angepasst von Leung Et Al. 22 Hinweis: alle Puffer und Reagenzien sollten auf dem Eis vor Gebrauch gekühlt werden und alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Kerne ernten. 
	Hinweis: Vor der Isolation der Kerne, kann Formaldehyd an Crosslink Proteine, DNA verwendet werden. Strengere waschen Bedingungen können dann während der DNA-Reinigung auf Streptavidin beschichteten Perlen verwendet werden. Für crOsslinking und waschen Bedingungen siehe Sirbu Et al. 21. <ol><li>ersetzen Wachstumsmedium mit 20 mL Extraktionspuffer Kerne (NEB) und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C mit gelegentlichen Schaukeln. Kerne werden im Mikroskop sichtbar werden.</li>
		<li>Kerne von der Platte mit einem Schaber Zelle zu kratzen und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C zu pellet-Kerne, den Überstand verwerfen. 
		Hinweis: Trypan Blaufärbung verwendet werden, kann um die Isolierung von Kernen von Zellen prüfen.</li>
		<li>Sanft das nukleare Pellet in 10 mL PBS, Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr zu verdrängen und pellet durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS. 
		Hinweis: Kerne können eingefroren werden und das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Dazu sanft Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 500 µL Einfrieren zu puffern und inkubieren Sie das Rohr im Eisbad Ethanol/trocken. Speichern Sie gefrorene Kerne bei-80 ° C. Vor Gebrauch Kerne bei Raumtemperatur auftauen, schnelle Übertragung von Eis, fügen Sie 10 mL PBS, Rock sanft zu mischen, durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C, pellet und PBS vollständig zu entfernen. Einfrieren von Kernen ertragsreduzierten führen kann.</li>
	</ol></li> <li>Kovalent conjugate Biotin-Azid, EdC beschriftet vDNA.
	<ol><li>Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 10 mL Klick Reaktion [siehe Tabelle der Materialien] durch Mischen sanft auf und ab pipettieren 5 Mal mit einer 10 mL pipettieren. 
		Hinweis: Es ist wichtig, dass die Reagenzien in der Klick-Reaktion-Mix enthalten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden.</li>
		<li>Für 1h bei 4 ° c drehen Während der Drehung vorzubereiten und chill Puffer B1, B2 und B3 [siehe Tabelle Material].</li>
		<li>Pellet Kerne durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen klicken Sie auf Reaktion Mischung und waschen das Pellet durch sanft resuspending in 10 mL PBS und Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c</li>
		<li>Aufschwemmen sanft die nukleare Pellet in 1 mL PBS und den Transfer zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch mit einem großkalibrigen Pipettenspitze. Pellet-Kernen durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und gefrorene Kerne können bei-80 ° c Einfrieren Auftauen hilft bei nachfolgenden Lyse gelagert werden, so ist es empfehlenswert, dass Kerne flash eingefroren werden, auch wenn am selben Tag auf Schritt 3.3 ausgehend.</li>
	</ol></li> <li>Lyse Kerne und DNA-fragment.
	<ol><li>Kerne auf Eis auftauen und Aufschwemmen in 500 µL Puffer B1 durch Pipettieren rauf und runter. Inkubation auf Eis für 45 min.</li>
		<li>Sonicate Proben 6 Mal für 30 s bei 40 % Amplitude mittels 3 mm Microtip Sonde. Legen Sie Proben auf Eis für 30 s zwischen den Pulsen. Nach Beschallung, Proben erscheinen sollte, klar, nicht bewölkt. 
		Hinweis: Für individuelle Ultraschallgeräte sollte Beschallung Bedingungen optimiert werden. Eine ausführliche Anleitung zur Optimierung der Beschallung Bedingungen beziehen sich auf Leung Et al. 22.</li> <li>pellet-Zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Die Pellets sollten deutlich verkleinern. Den Überstand durch 100 µM Zelle Sieb filtern und behalten die Durchströmung.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL Puffer B2, die gefilterte überstand. 900 µL dieses Beispiels wird im Schritt 3.4.2 verwendet werden.</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jede Bedingung für die DNA-Isolierung (50 µL oder 1/20 Volumen) und fügen Sie 50 µL 2 x SDS-Bicarb Lösung [siehe Tabelle der Materialien]. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jeder Bedingung für Eingabe Protein (50 µL oder Volume 1/20) und 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer hinzufügen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° c Verwendung in Schritt 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylierte DNA zu Streptavidin beschichteten Perlen.
	<ol><li>Bereiten Streptavidin T1 magnetische Beads von 300 µL der Wulst Gülle auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen. Bereiten Sie eine Tube Perlen pro Probe. Wash Perlen 3 X mit 1 mL Puffer B2 durch Vortexen, Aufschwemmen, anwenden ein Magneten um die Perlen zu trennen und Absaugen der Waschpuffer. 
		Hinweis: Optimiert verbindliche Bedingungen führen zu maximaler Ertrag und minimaler Hintergrund verbindlich. Es wurde experimentell festgestellt, dass Streptavidin T1 magnetische Beads eine deutlich höhere Bindungskapazität als Agarose Korne, sowie andere Streptavidin-Perlen und haben weniger Hintergrund verbindlich als Streptavidin C1 Perlen ( Abbildung 4A ).</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL Probe aus Schritt 3.3.4. die gewaschenen Perlen und drehen über Nacht bei 4 ° c 
		Hinweis: Verwenden Sie nicht Wirbel Perlen einmal Probe hinzugefügt wird. 
		Hinweis: Wenn erhebliche Mengen von DNA oder Protein in die unbeschriftete Negativkontrolle isoliert sind, dieser Schritt reduziert werden von Übernachtungen bis 4 h, Hintergrund Bindung zu reduzieren.</li>
	</ol></li> <li>Waschen Perlen und vDNA und damit verbundenen Proteine eluieren. 
	Hinweis: Es wird empfohlen, Filter-Tips für die verbleibenden Schritte zu verwenden.
	<ol><li>Ort-Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, entfernen überstand, Aufschwemmen sanft in 1 mL Puffer B2, drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5.1 dreimal.</li>
		<li>Die Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, überstand zu entfernen, sanft in 1 mL Puffer B3, Aufschwemmen und drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Transfer 100 µL Perle Mischung (1/10 th Volumen), eine neue Röhre für gebundene DNA-Isolierung. Gelten diese Röhre für den Magneten, überstand zu entfernen, Perlen in 100 µL 1 x SDS-Bicarb Lösung Aufschwemmen und fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Gelten die Röhrchen mit den restlichen 900 µL Perle Mischung aus Schritt 3.5.3. an den Magnet entfernen überstand und Aufschwemmen Perlen in 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer auf Protein- und DNA-Protein-komplexe eluieren.</li>
		<li>Kochen Proben bei 95 ° C für 15 min, Wirbel, schnell in der Microfuge spin, und Magnet. Eluat zu übertragen, um eine neue Röhre, Flash-Einfrieren und bei-80 ° c 
		Hinweis: Verwendung Kappe Schlösser um sicherzustellen, dass die Rohre nicht pop öffnen während des Kochens. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und Proben können für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Analysieren Proteinproben Coomassie blaue Färbung, westliche Beflecken oder Massenspektrometrie von Standardverfahren 25. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. 
		Hinweis: Um festzustellen, ob Proteinausbeute für Massenspektrometrie ausreicht, 7,5 µL jeder Probe dient zur Analyse von Coomassie blaue Färbung und 7,5 µL für das westliche Beflecken eines repräsentativen viralen Genoms verbundenen Protein (ICP4, ICP8 oder UL42). Das gleiche Volumen von Lysaten von Schritt 3.3.6. Neben Steuern für Eingabe Protein-Ebene ausgeführt werden. Die restlichen Probe (35 µL) wird dann analysiert, durch Masse Spektrometrie wie zuvor beschrieben 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA-Isolierung <ol><li>inkubieren Sie die Proben aus Schritte 3.3.5. und 3.5.4. bei 65 ° C für 4-16 h. entfernen probieren von magnetischen Beads, wenn nötig.</li>
		<li>Proben mit 150 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (PCI) zu extrahieren und die wässrige Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.</li>
		<li>Extrahieren den verbleibenden PCI mit 100 µL Tris-EDTA (TE) und einen neuen Schlauch der wässrigen Phase hinzu.</li>
		<li>Extrahieren Proben mit 200 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol (24:1).</li>
		<li>Reinigen die wässrige Phase mit dem PCR-Reinigung-Kit nach Angaben des Herstellers &#39; s Protokoll. 
		Hinweis: Die pH-Indikator im Puffer PB schaltet lila, wenn die Probe hinzugefügt. Fügen Sie 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5,0 bis den pH-Wert der Probe zu verringern.</li>
		<li>Bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. 
		Hinweis: Dieses Protokoll liefert in der Regel 100-400 ng Wulst-gebundene DNA. Keine DNA sollte erkannt werden, in das Eluat die negativ-Kontrolle in der EdC war nicht in Schritt 1.3 hinzugefügt.</li>
		<li>DNA kann gespeichert werden, in einer niedrigen DNA-Bindung Rohr bei 4 oder -20 ° C und eignet sich für Real-Time PCR oder Hochdurchsatz-Sequenzierung Analyse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die wenn nicht sorgfältig befolgt deutlich reduzierten Proteinausbeute oder Kontamination mit zellulären DNA führen können. Es ist wichtig, dass stationäre Zellen für alle Experimente verwendet werden, um sicherzustellen, dass zelluläre DNA nicht beschriftet und gereinigt ist. Dies kann durch das Fehlen der zellulären DNA-Polymerasen in der Protein-Probe bestätigt werden, weil HSV-1 nicht zelluläre DNA-Polymerase für die Genom-Synthese nutzen. Während EdC Kennzeichnu...

Viren haben eine begrenzte Kapazität zur Durchführung von wesentlichen Funktionen und hängt daher Host Faktoren, kritische Aspekte einer Infektion wie virale Genexpression, Replikation, Reparatur, Rekombination und Transport zu erleichtern. Die Aktivitäten dieser Host Faktoren werden oft durch Viral kodierten Proteine ergänzt. Darüber hinaus müssen Viren Erkennung und Störungen durch zelluläre Reaktionen auf virale Infektion vermeiden. Virus-Wirt Interaktionen bestimmen daher das Ergebnis einer Infektion. Von größter Bedeutung ist das Verständnis wie Viren verändern die zelluläre Umgebung anpassen der zelluläre Maschinerie um virale Prozesse zu vereinfachen. Von besonderes Interesse ist die Ermittlung viraler Genome während des ansteckenden Zyklus welche Faktoren und Prozesse einwirken.
Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) ist eine doppelte DNA-Virus gestrandet, die einen wesentlichen Teil der menschlichen Bevölkerung infiziert. Innerhalb der ersten Stunde der Infektion tritt das virale Genom den Zellkern, wo erfolgt eine geordnete Kaskade der viralen Genexpression in Abstimmung mit der viralen DNA (vDNA) Replikation1. Im Zellkern Genome epigenetische Regulierung unterliegen, Reparatur und Rekombination zu unterziehen und in Capsids, verpackt sind, so dass die ersten Nachkommen Virionen innerhalb von weniger als sechs Stunden produziert werden. Die umfassende Auswertung des Virusgenoms verbundenen Proteine im Laufe der Infektion bilden die Grundlage um die molekularen Details der Prozesse zu untersuchen, die auf virale Genom, und bieten einen Einblick in die viralen und zellulären Faktoren engagieren sich in verschiedenen Stadien der Infektion.
Bisherige Methoden zur Untersuchung von Host Faktoren bei der Virusinfektion sind Affinitätsreinigung von viralen Proteinen für die Analyse der damit verbundenen zellulären Proteinen2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. diese Tests wurden für die Identifizierung von zellulären Faktoren maßgeblich Host antivirale Reaktionen sowie virale Chromatin Modifikation, Genexpression, und DNA zu reparieren. Allerdings ist es schwierig, festzustellen, ob Interaktionen richten sich nach der Vereinigung mit vDNA und Proteomics nur Einblick in die Interaktionen, die in Abhängigkeit von den spezifischen viralen Faktor auftreten. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde verwendet, um ermitteln, wo bestimmte virale und zelluläre Proteine binden an viralen Genomen10,11,12,13,14 , 15 und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) kombiniert mit Immunocytochemistry ermöglichte die Visualisierung von zellulären Faktoren, die mit vDNA16,17,18, colocalize 19 , 20. diese Assays für die räumliche und zeitliche Analyse zu ermöglichen. Einschränkungen enthalten jedoch die Notwendigkeit hochspezifische Antikörper, begrenzte Empfindlichkeit und die Notwendigkeit einer vorherigen Einblick in Virus-Wirt-Interaktionen. Daher entwickelten wir eine Methode basiert auf iPOND (Isolierung von Proteinen auf die entstehenden DNA)21 und AniPOND (beschleunigte native iPOND)22 selektiv beschriften und reinigen vDNA aus infizierten Zellen für die unvoreingenommene Identifizierung des viralen Genoms damit verbundenen Proteine durch Massenspektrometrie. iPOND hat für die Untersuchung der zellulären Replikation Gabel Dynamik beigetragen.
Für die selektive Reinigung von viraler Genome von infizierten Zellen repliziert vDNA Ethynyl geändert Nukleoside, 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxycytidine (EdC) (Abbildung 1), gefolgt von kovalenten trägt Konjugation, Biotin-Azid über Klicken Sie Chemie, Einzelschritt Reinigung des viralen Genomen und damit verbundenen Proteine auf Streptavidin beschichteten Perlen (Abb. 2 b) zu erleichtern. Wichtig ist, sind Infektionen in stationären Zellen durchgeführt die nicht in der zellulären DNA-Replikation tätig sind, ermöglichen spezifische Kennzeichnung des vDNA. Des weiteren HSV-1 Infektion verursacht Zellzyklus Festnahme und hemmt zelluläre DNA-Replikation23,24. Virus können prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden viraler Genome (Abbildung 1A) oder beschriftet während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b) zugeordnet werden 25. Darüber hinaus Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. Darüber hinaus kann Ethynyl geändert vDNA kovalent an ein Fluorophor für räumliche Untersuchung von Proteindynamik (Abb. 2A und Abbildung 3) konjugiert werden. Bildgebung ermöglicht die direkte Visualisierung des vDNA ist ein kostenloses Ansatz für die Validierung des vDNA-Protein-Interaktionen und lässt sich anpassen, virale Genome während Infektion zu verfolgen. Wir erwarten, dass diese Ansätze weiter geändert werden, könnten um jeden Aspekt der herpesviral Infektion, einschließlich Latenz und Reaktivierung, zu studieren und andere DNA-Viren zu studieren. Darüber hinaus könnte Etikettierung mit 5-Ethynyl Uridin (EU) für die Analyse der viralen RNA-Genome ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&amp;nbsp; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stocks with titers greater than 1x10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL work best</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp; column (PD-10 Desalting Column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-Ethynyl-2&amp;acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dilute to 1x in sterile water before use)</td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &amp;deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>(+) Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C for up to 1 year&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td></tr><tr><td>Freezing buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &amp;mu;L 50x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli sample buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&amp;nbsp; &amp;deg;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td></tr><tr><td>Cap locks for 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard western blotting reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Prepare 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Prepare according to manufactorer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-ICP8 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb solution</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope equipped with imaging software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C and 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist um zu isolieren, Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) DNA aus infizierten Zellen für die Identifizierung von verbundenen viralen und zelluläre Proteinen durch Massenspektrometrie. Obwohl die Proteine, die Interaktion mit viraler Genome Hauptrollen in den Ausgang der Infektion spielen, war eine umfassende Analyse des Virusgenoms verbundenen Proteine nicht früher möglich. Hier zeigen wir eine Methode, die die direkte Reinigung von HSV-1 Genomen von infizierten Zellen ermöglicht. Virale DNA Replikation wird selektiv mit NUK gekennzeichnet, die eine Alkinen funktionelle Gruppe enthalten. Beschrifteten DNA wird ausdrücklich und unwiderruflich beschriftet über die kovalente Befestigung der Biotin-Azid über ein Kupfer (I)-Azid-Alkinen Cycloaddition oder Klick Reaktion katalysiert. Biotin-markierten DNA wird auf Streptavidin beschichteten Perlen gereinigt und damit verbundenen Proteine sind eluiert und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode ermöglicht die selektive Ausrichtung und Isolierung von HSV-1-Replikation Gabeln oder ganzer Genome von komplexen biologischen Umgebungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassung dieses Ansatzes zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der herpesviral Infektion, sowie die Prüfung der Genome von anderen DNA-Viren.

Die Verwendung von Klick-Chemie zur Reinigung von DNA aus Zellen wurde zuerst durch die iPOND Methode21erreicht. IPOND soll zellulären Replikation Gabeln für die Identifizierung von assoziierten Proteinen zu reinigen. Wir haben diese Technik, um speziell vDNA-Protein-Interaktionen während der Infektion studieren angepasst. Manipulation des Ansatzes für die virale Genome mit EdC (Abbildung 1), kombiniert mit synchronisierten Infekti...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Serie: Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologie

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, causing delays in treatment and further spread of the virus. Developing new sensors that can inform on the infectability of clinical or environmental samples will meet this unmet challenge. However, very few methods can obtain sensing molecules that can recognize an intact infectious virus and differentiate it from the same virus that has been rendered non-infectious by disinfection methods. Here, we describe a protocol to select aptamers that can distinguish infectious viruses vs non-infectious viruses using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). We take advantage of two features of SELEX. First, SELEX can be tailor-made to remove competing targets, such as non-infectious viruses or other similar viruses, using counter selection. Additionally, the whole virus can be used as the target for SELEX, instead of, for example, a viral surface protein. Whole virus SELEX allows for the selection of aptamers that bind specifically to the native state of the virus, without the need to disrupt of the virus. This method thus allows recognition agents to be obtained based on functional differences in the surface of pathogens, which do not need to be known in advance.

We provide a protocol that can be generally applied to select aptamers that bind to infectious viruses only and not to viruses that have been rendered non-infectious by a disinfection method or to any other similar viruses. This opens the possibility of determining infectivity status in portable and rapid tests.

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse von SARS-CoV-2 mittels Dual-Reporter- und Multiplex-Technologie

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung antiviraler Strategien durch neuartige Immuneinfang- und Massenspektrometrietechniken

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit 'Single Virus Genomics'

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie