Wir bestätigen Hannah Fox für Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH R01AI030612 zu gewähren.

1. Zellkultur, Virusinfektion und EdC Beschriftung ( Abbildung 1) das folgende Protokoll schließt die Arbeit mit Viren. Entnehmen Sie bitte Ihrer Institution &#39; s Bio-Sicherheit Protokolle für sichere Handhabung von Viren und anderen biologischen Arbeitsstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board von der University of Pittsburgh genehmigt.
<ol><li>Trypsinize eine konfluierende 150 cm 2 Gewebekultur Flasche MRC-5 Zellen und übertragen Sie die Zellen auf einer 600 cm 2 Gewebekultur Teller mit 100 mL DMEM plus 10 % FBS. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2 für 3-4 Tage, confluency und stationäre Phase zu erreichen. Ein konfluierende 600 cm 2 Teller enthält ~ 7 x 10 7 Zellen. Bereiten Sie 1 Platte für jede Kondition und 1 Platte für jede entsprechende Negativkontrolle. 
	Hinweis: Zellen die stationäre Phase um hemmen zelluläre DNA-Replikation, um sicherzustellen, dass nur vDNA ist beschriftet und in den nachfolgenden Schritten gereinigt erreichen müssen. 
	Hinweis: Jede Probe erfordert ein kostenloses unmarkiertem Negativkontrolle vorbereitet, mit dem gleichen Infektionsbedingungen und Zeitpunkt ohne Zusatz von EdC. 
	Hinweis: A verkleinerte Version von diesem Experiment sollte durchgeführt werden parallel zum Testen für die Kennzeichnung der zellulären DNA durch Bildgebung mit vergleichbaren Zellwachstum, Infektion, EdC, die Bedingungen, zu beschriften und Zeitpunkten (siehe Schritt2).</li>
	<li>Verdünnen, 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL kalte Tris-Buffered Kochsalzlösung (TBS). Entfernen Sie Wachstumsmedium und Lagern bei 37 ° C. Zu infizieren, MRC-5 Zellen 7 mL verdünnten Virus hinzu und rock für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach Adsorption Inokulum zu, spülen Sie mit 50 mL Raumtemperatur TBS und ersetzen Sie die ursprüngliche Wachstumsmedium. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2. Dieser Schritt sollte für jede Versuchsbedingung und negativ-Kontrolle durchgeführt werden. 
	Hinweis: Erhöhte EdC Kennzeichnung lässt sich mit HSV-1 Mutanten defekt für die Expression der viralen dUTPase (UL50-gen) bzw. Uracil Glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase hat geringe Substratspezifität und die Aktivierung von mehreren Nukleosid-Analoga 25 , 27 verringern kann.</li>
	<li>Label viraler Genome mit EdC. Folgen Sie den Anweisungen um eingehende Genome (1.3.1), Replikation Genome (1.3.2.) oder virale Replikation Gabeln (1.3.3.) zu beschriften. 
	Hinweis: Nur Schritt 1.3.1 und 1.3.2 1.3.3 sollte erfolgen, je nachdem, ob eingehende Genome, replizierte Genomen oder Replikation Gabeln in den nachfolgenden Schritten bzw. analysiert werden. 
	Hinweis: EdU oder f-Ara-EdU kann für EdC ersetzt werden. Die Toxizität von Nukleosid-Analoga sollten überwacht und minimiert werden.
	<ol><li>Verwendung prelabeled Bestände, Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen und fahren mit Schritt2 oder 3 innerhalb von 4 Stunden buchen (Hpi) Infektion untersuchen Langzeittransaktionen vDNA ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Bereiten Sie Aktien mit der zuvor beschriebenen Protokoll 25 prelabeled Virus. Virus Bestände müssen durchlaufen eine G-25 Spalte entfernen Rückstände EdC.</li>
		<li>Label replizierende vDNA durch Zugabe von 5-25 µM EdC, Zellkulturmedium infizierter Zellen für 2-4 h ( Abbildung 1 b). Bevor Sie hinzufügen, verdünnen EdC in 1 mL Wachstumsmedium.</li>
		<li>, Virale Replikation Gabeln, nach Beginn der vDNA Replikation zu kennzeichnen (&#8805; 4 Hpi), Puls-Label replizieren vDNA mit 5-25 µM EdC für 5-20 min. Um zu jagen, 3 X mit Chase 25-100 µM 2´deoxycytidine-haltigem Medium spülen (DeoxyC) und inkubieren Sie in Anwesenheit von Chase Medium für eine zusätzliche 20-40 min ( Abbildung 1). 
		Hinweis: Puls und Chase Medium sollte auf 37 ° C und 5 % CO 2 vor Gebrauch equilibriert. 
		Hinweis: Für Puls-Chase-Experimente ist es wichtig, die Zeitspanne zu berücksichtigen braucht es für Nukleoside, geben die Zelle und phosphoryliert werden, bevor sie in die Replikation von DNA integriert werden können. Dies muss empirisch ermittelt werden. 
		Hinweis: Um die Auflösung der Puls Chase Experimente zu ermitteln, berechnen Sie die virale Replikation Rate unter den experimentellen Bedingungen verwendet. Dies kann durch quantitative PCR viral Genome bestimmt werden, in einem einzigen Schritt Wachstum Zeit Kurs 26. 
		Hinweis: Für imaging-viraler Genome gehen Sie zu Schritt2 und für die Reinigung von viralen Genomen fahren Sie mit Schritt 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bildgebung des EdC gekennzeichnet DNA ( Abbildung 2A) Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie Bildgebung im Tandem mit der virale Genom-Reinigung-Methode um sicherzustellen, dass zelluläre DNA in Experimenten nicht beschriftet ist. Bildgebung kann auch verwendet werden, die Natur der beschrifteten vDNA visualisieren und Proteomics Daten validiert. Beispiele für zelluläre und virale DNA Färbung Muster sind in Abbildung 3.
<ol><li>Infektionen durchzuführen und EdC Kennzeichnung wie in Schritt 1 außer angegeben Bedingungen auf Deckgläsern in eine 12-Well-Zellkultur-Schale mit 1 mL Wachstumsmedium verkleinert.</li>
	<li>Fix Zellen mit 1 mL 3,7 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 15 min bei RT Nach der Fixierung, Zellen spülen 2 X mit 1 mL 3 % BSA in PBS. 
	Achtung: Paraformaldehyd kann ernsthafte oder dauerhafte Schäden verursachen. Sicherheitsvorkehrungen zu folgen. 
	Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Deckgläsern können bis zu 3 Tage bei 4 ° C in der zweiten Wäsche gelagert werden.</li>
	<li>Permeabilize Zellen mit 1 mL Permeabilisierung Puffer [siehe Tabelle der Materialien] für 20 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Spülen mit 1 mL 3 % BSA und dann Block mit 1 mL 3 % BSA mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Klick Reaktion cocktail [siehe Tabelle der Materialien] auf Deckgläsern kovalent Alexa Fluor 488 konjugieren Azid, EdC gekennzeichnet DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Fleck zelluläre DNA mit 1 mL einer 1:2,000 Verdünnung von Hoechst mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	Indirekte Immunfluoreszenz <li>Fleck mit primären und sekundären Antikörper nach Standard Protokolle 25. 
	Hinweis: Markierte vDNA colocalizes mit ICP8, ICP4 oder UL42 und mit der Bezeichnung zelluläre DNA mit Hoechst-Fleck colocalizes.</li>
	<li>Montieren Deckgläsern auf Folien und image-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop. 
	Hinweis: Dias können bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Reinigung des vDNA und verbundenen Proteine Hinweis: verschiedene Aspekte dieses Protokolls wurden angepasst von Leung Et Al. 22 Hinweis: alle Puffer und Reagenzien sollten auf dem Eis vor Gebrauch gekühlt werden und alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Kerne ernten. 
	Hinweis: Vor der Isolation der Kerne, kann Formaldehyd an Crosslink Proteine, DNA verwendet werden. Strengere waschen Bedingungen können dann während der DNA-Reinigung auf Streptavidin beschichteten Perlen verwendet werden. Für crOsslinking und waschen Bedingungen siehe Sirbu Et al. 21. <ol><li>ersetzen Wachstumsmedium mit 20 mL Extraktionspuffer Kerne (NEB) und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C mit gelegentlichen Schaukeln. Kerne werden im Mikroskop sichtbar werden.</li>
		<li>Kerne von der Platte mit einem Schaber Zelle zu kratzen und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C zu pellet-Kerne, den Überstand verwerfen. 
		Hinweis: Trypan Blaufärbung verwendet werden, kann um die Isolierung von Kernen von Zellen prüfen.</li>
		<li>Sanft das nukleare Pellet in 10 mL PBS, Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr zu verdrängen und pellet durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS. 
		Hinweis: Kerne können eingefroren werden und das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Dazu sanft Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 500 µL Einfrieren zu puffern und inkubieren Sie das Rohr im Eisbad Ethanol/trocken. Speichern Sie gefrorene Kerne bei-80 ° C. Vor Gebrauch Kerne bei Raumtemperatur auftauen, schnelle Übertragung von Eis, fügen Sie 10 mL PBS, Rock sanft zu mischen, durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C, pellet und PBS vollständig zu entfernen. Einfrieren von Kernen ertragsreduzierten führen kann.</li>
	</ol></li> <li>Kovalent conjugate Biotin-Azid, EdC beschriftet vDNA.
	<ol><li>Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 10 mL Klick Reaktion [siehe Tabelle der Materialien] durch Mischen sanft auf und ab pipettieren 5 Mal mit einer 10 mL pipettieren. 
		Hinweis: Es ist wichtig, dass die Reagenzien in der Klick-Reaktion-Mix enthalten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden.</li>
		<li>Für 1h bei 4 ° c drehen Während der Drehung vorzubereiten und chill Puffer B1, B2 und B3 [siehe Tabelle Material].</li>
		<li>Pellet Kerne durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen klicken Sie auf Reaktion Mischung und waschen das Pellet durch sanft resuspending in 10 mL PBS und Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c</li>
		<li>Aufschwemmen sanft die nukleare Pellet in 1 mL PBS und den Transfer zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch mit einem großkalibrigen Pipettenspitze. Pellet-Kernen durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und gefrorene Kerne können bei-80 ° c Einfrieren Auftauen hilft bei nachfolgenden Lyse gelagert werden, so ist es empfehlenswert, dass Kerne flash eingefroren werden, auch wenn am selben Tag auf Schritt 3.3 ausgehend.</li>
	</ol></li> <li>Lyse Kerne und DNA-fragment.
	<ol><li>Kerne auf Eis auftauen und Aufschwemmen in 500 µL Puffer B1 durch Pipettieren rauf und runter. Inkubation auf Eis für 45 min.</li>
		<li>Sonicate Proben 6 Mal für 30 s bei 40 % Amplitude mittels 3 mm Microtip Sonde. Legen Sie Proben auf Eis für 30 s zwischen den Pulsen. Nach Beschallung, Proben erscheinen sollte, klar, nicht bewölkt. 
		Hinweis: Für individuelle Ultraschallgeräte sollte Beschallung Bedingungen optimiert werden. Eine ausführliche Anleitung zur Optimierung der Beschallung Bedingungen beziehen sich auf Leung Et al. 22.</li> <li>pellet-Zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Die Pellets sollten deutlich verkleinern. Den Überstand durch 100 µM Zelle Sieb filtern und behalten die Durchströmung.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL Puffer B2, die gefilterte überstand. 900 µL dieses Beispiels wird im Schritt 3.4.2 verwendet werden.</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jede Bedingung für die DNA-Isolierung (50 µL oder 1/20 Volumen) und fügen Sie 50 µL 2 x SDS-Bicarb Lösung [siehe Tabelle der Materialien]. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jeder Bedingung für Eingabe Protein (50 µL oder Volume 1/20) und 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer hinzufügen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° c Verwendung in Schritt 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylierte DNA zu Streptavidin beschichteten Perlen.
	<ol><li>Bereiten Streptavidin T1 magnetische Beads von 300 µL der Wulst Gülle auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen. Bereiten Sie eine Tube Perlen pro Probe. Wash Perlen 3 X mit 1 mL Puffer B2 durch Vortexen, Aufschwemmen, anwenden ein Magneten um die Perlen zu trennen und Absaugen der Waschpuffer. 
		Hinweis: Optimiert verbindliche Bedingungen führen zu maximaler Ertrag und minimaler Hintergrund verbindlich. Es wurde experimentell festgestellt, dass Streptavidin T1 magnetische Beads eine deutlich höhere Bindungskapazität als Agarose Korne, sowie andere Streptavidin-Perlen und haben weniger Hintergrund verbindlich als Streptavidin C1 Perlen ( Abbildung 4A ).</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL Probe aus Schritt 3.3.4. die gewaschenen Perlen und drehen über Nacht bei 4 ° c 
		Hinweis: Verwenden Sie nicht Wirbel Perlen einmal Probe hinzugefügt wird. 
		Hinweis: Wenn erhebliche Mengen von DNA oder Protein in die unbeschriftete Negativkontrolle isoliert sind, dieser Schritt reduziert werden von Übernachtungen bis 4 h, Hintergrund Bindung zu reduzieren.</li>
	</ol></li> <li>Waschen Perlen und vDNA und damit verbundenen Proteine eluieren. 
	Hinweis: Es wird empfohlen, Filter-Tips für die verbleibenden Schritte zu verwenden.
	<ol><li>Ort-Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, entfernen überstand, Aufschwemmen sanft in 1 mL Puffer B2, drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5.1 dreimal.</li>
		<li>Die Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, überstand zu entfernen, sanft in 1 mL Puffer B3, Aufschwemmen und drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Transfer 100 µL Perle Mischung (1/10 th Volumen), eine neue Röhre für gebundene DNA-Isolierung. Gelten diese Röhre für den Magneten, überstand zu entfernen, Perlen in 100 µL 1 x SDS-Bicarb Lösung Aufschwemmen und fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Gelten die Röhrchen mit den restlichen 900 µL Perle Mischung aus Schritt 3.5.3. an den Magnet entfernen überstand und Aufschwemmen Perlen in 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer auf Protein- und DNA-Protein-komplexe eluieren.</li>
		<li>Kochen Proben bei 95 ° C für 15 min, Wirbel, schnell in der Microfuge spin, und Magnet. Eluat zu übertragen, um eine neue Röhre, Flash-Einfrieren und bei-80 ° c 
		Hinweis: Verwendung Kappe Schlösser um sicherzustellen, dass die Rohre nicht pop öffnen während des Kochens. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und Proben können für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Analysieren Proteinproben Coomassie blaue Färbung, westliche Beflecken oder Massenspektrometrie von Standardverfahren 25. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. 
		Hinweis: Um festzustellen, ob Proteinausbeute für Massenspektrometrie ausreicht, 7,5 µL jeder Probe dient zur Analyse von Coomassie blaue Färbung und 7,5 µL für das westliche Beflecken eines repräsentativen viralen Genoms verbundenen Protein (ICP4, ICP8 oder UL42). Das gleiche Volumen von Lysaten von Schritt 3.3.6. Neben Steuern für Eingabe Protein-Ebene ausgeführt werden. Die restlichen Probe (35 µL) wird dann analysiert, durch Masse Spektrometrie wie zuvor beschrieben 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA-Isolierung <ol><li>inkubieren Sie die Proben aus Schritte 3.3.5. und 3.5.4. bei 65 ° C für 4-16 h. entfernen probieren von magnetischen Beads, wenn nötig.</li>
		<li>Proben mit 150 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (PCI) zu extrahieren und die wässrige Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.</li>
		<li>Extrahieren den verbleibenden PCI mit 100 µL Tris-EDTA (TE) und einen neuen Schlauch der wässrigen Phase hinzu.</li>
		<li>Extrahieren Proben mit 200 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol (24:1).</li>
		<li>Reinigen die wässrige Phase mit dem PCR-Reinigung-Kit nach Angaben des Herstellers &#39; s Protokoll. 
		Hinweis: Die pH-Indikator im Puffer PB schaltet lila, wenn die Probe hinzugefügt. Fügen Sie 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5,0 bis den pH-Wert der Probe zu verringern.</li>
		<li>Bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. 
		Hinweis: Dieses Protokoll liefert in der Regel 100-400 ng Wulst-gebundene DNA. Keine DNA sollte erkannt werden, in das Eluat die negativ-Kontrolle in der EdC war nicht in Schritt 1.3 hinzugefügt.</li>
		<li>DNA kann gespeichert werden, in einer niedrigen DNA-Bindung Rohr bei 4 oder -20 ° C und eignet sich für Real-Time PCR oder Hochdurchsatz-Sequenzierung Analyse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics.">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li><li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription.">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242 (2013).</li><li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments:+association+of+cellular+DNA+replication,+repair,+recombination,+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8.">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li><li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27:+association+with+translation+initiation+factors.">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li><li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology.">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li><li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0.">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li><li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells.">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li><li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease,+UL12,+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex.">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li><li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+ICP4,+TATA-binding+protein,+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early,+early,+and+late+promoters+in+virus-infected+cells.">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li><li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities.">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li><li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection.">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li><li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection.">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li><li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription.">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li><li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection.">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li><li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons.">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).</li><li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts.">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10.">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li><li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+periphery+of+nuclear+domain+10+(ND10)+as+site+of+DNA+virus+deposition.">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li><li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment.">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die wenn nicht sorgfältig befolgt deutlich reduzierten Proteinausbeute oder Kontamination mit zellulären DNA führen können. Es ist wichtig, dass stationäre Zellen für alle Experimente verwendet werden, um sicherzustellen, dass zelluläre DNA nicht beschriftet und gereinigt ist. Dies kann durch das Fehlen der zellulären DNA-Polymerasen in der Protein-Probe bestätigt werden, weil HSV-1 nicht zelluläre DNA-Polymerase für die Genom-Synthese nutzen. Während EdC Kennzeichnu...

Viren haben eine begrenzte Kapazität zur Durchführung von wesentlichen Funktionen und hängt daher Host Faktoren, kritische Aspekte einer Infektion wie virale Genexpression, Replikation, Reparatur, Rekombination und Transport zu erleichtern. Die Aktivitäten dieser Host Faktoren werden oft durch Viral kodierten Proteine ergänzt. Darüber hinaus müssen Viren Erkennung und Störungen durch zelluläre Reaktionen auf virale Infektion vermeiden. Virus-Wirt Interaktionen bestimmen daher das Ergebnis einer Infektion. Von größter Bedeutung ist das Verständnis wie Viren verändern die zelluläre Umgebung anpassen der zelluläre Maschinerie um virale Prozesse zu vereinfachen. Von besonderes Interesse ist die Ermittlung viraler Genome während des ansteckenden Zyklus welche Faktoren und Prozesse einwirken.
Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) ist eine doppelte DNA-Virus gestrandet, die einen wesentlichen Teil der menschlichen Bevölkerung infiziert. Innerhalb der ersten Stunde der Infektion tritt das virale Genom den Zellkern, wo erfolgt eine geordnete Kaskade der viralen Genexpression in Abstimmung mit der viralen DNA (vDNA) Replikation1. Im Zellkern Genome epigenetische Regulierung unterliegen, Reparatur und Rekombination zu unterziehen und in Capsids, verpackt sind, so dass die ersten Nachkommen Virionen innerhalb von weniger als sechs Stunden produziert werden. Die umfassende Auswertung des Virusgenoms verbundenen Proteine im Laufe der Infektion bilden die Grundlage um die molekularen Details der Prozesse zu untersuchen, die auf virale Genom, und bieten einen Einblick in die viralen und zellulären Faktoren engagieren sich in verschiedenen Stadien der Infektion.
Bisherige Methoden zur Untersuchung von Host Faktoren bei der Virusinfektion sind Affinitätsreinigung von viralen Proteinen für die Analyse der damit verbundenen zellulären Proteinen2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. diese Tests wurden für die Identifizierung von zellulären Faktoren maßgeblich Host antivirale Reaktionen sowie virale Chromatin Modifikation, Genexpression, und DNA zu reparieren. Allerdings ist es schwierig, festzustellen, ob Interaktionen richten sich nach der Vereinigung mit vDNA und Proteomics nur Einblick in die Interaktionen, die in Abhängigkeit von den spezifischen viralen Faktor auftreten. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde verwendet, um ermitteln, wo bestimmte virale und zelluläre Proteine binden an viralen Genomen10,11,12,13,14 , 15 und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) kombiniert mit Immunocytochemistry ermöglichte die Visualisierung von zellulären Faktoren, die mit vDNA16,17,18, colocalize 19 , 20. diese Assays für die räumliche und zeitliche Analyse zu ermöglichen. Einschränkungen enthalten jedoch die Notwendigkeit hochspezifische Antikörper, begrenzte Empfindlichkeit und die Notwendigkeit einer vorherigen Einblick in Virus-Wirt-Interaktionen. Daher entwickelten wir eine Methode basiert auf iPOND (Isolierung von Proteinen auf die entstehenden DNA)21 und AniPOND (beschleunigte native iPOND)22 selektiv beschriften und reinigen vDNA aus infizierten Zellen für die unvoreingenommene Identifizierung des viralen Genoms damit verbundenen Proteine durch Massenspektrometrie. iPOND hat für die Untersuchung der zellulären Replikation Gabel Dynamik beigetragen.
Für die selektive Reinigung von viraler Genome von infizierten Zellen repliziert vDNA Ethynyl geändert Nukleoside, 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxycytidine (EdC) (Abbildung 1), gefolgt von kovalenten trägt Konjugation, Biotin-Azid über Klicken Sie Chemie, Einzelschritt Reinigung des viralen Genomen und damit verbundenen Proteine auf Streptavidin beschichteten Perlen (Abb. 2 b) zu erleichtern. Wichtig ist, sind Infektionen in stationären Zellen durchgeführt die nicht in der zellulären DNA-Replikation tätig sind, ermöglichen spezifische Kennzeichnung des vDNA. Des weiteren HSV-1 Infektion verursacht Zellzyklus Festnahme und hemmt zelluläre DNA-Replikation23,24. Virus können prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden viraler Genome (Abbildung 1A) oder beschriftet während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b) zugeordnet werden 25. Darüber hinaus Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. Darüber hinaus kann Ethynyl geändert vDNA kovalent an ein Fluorophor für räumliche Untersuchung von Proteindynamik (Abb. 2A und Abbildung 3) konjugiert werden. Bildgebung ermöglicht die direkte Visualisierung des vDNA ist ein kostenloses Ansatz für die Validierung des vDNA-Protein-Interaktionen und lässt sich anpassen, virale Genome während Infektion zu verfolgen. Wir erwarten, dass diese Ansätze weiter geändert werden, könnten um jeden Aspekt der herpesviral Infektion, einschließlich Latenz und Reaktivierung, zu studieren und andere DNA-Viren zu studieren. Darüber hinaus könnte Etikettierung mit 5-Ethynyl Uridin (EU) für die Analyse der viralen RNA-Genome ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1930">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">MRC-5 cells</td>
			<td style="width:197px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-171</td>
			<td style="width:1215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">26140-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12800-082</td>
			<td>substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&#160; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">600 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">166508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">HSV-1 stock</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Sephadex G-25&#160; column (PD-10 Desalting Column)</td>
			<td style="width:197px;">GE Healthcare</td>
			<td align="right" style="width:101px;">17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">5&#180;-Ethynyl-2&#180;-deoxycytidine (EdC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T511307</td>
			<td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2&#180;-deoxycytidine (deoxyC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D3897</td>
			<td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:197px;">Bellco glass</td>
			<td style="width:101px;">7731-22000</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">PBS, pH 7.2 (10x)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">C489</td>
			<td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">(+) Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4034</td>
			<td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biotin azide</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">B10184</td>
			<td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &#176;C for up to 1 year&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Click Reaction Mix</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:101px;">11697498001</td>
			<td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &#176;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">freezing buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &#956;L 50x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td>
			<td style="width:197px;">Sonics</td>
			<td style="width:101px;">VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:197px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:101px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:101px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Mini-Tube Rotator</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">260750F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2X Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&#160; &#176;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cap locks for 1.5 mL tube</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">NC9679153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Standard western blotting reagents</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">12-well tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:101px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Coverslips</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-545-100</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:197px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:101px;">15710</td>
			<td>dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">BP1605</td>
			<td>prepare 3% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787</td>
			<td>prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:197px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:101px;">C10337</td>
			<td>prepare according to manufactorer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">H1399</td>
			<td>prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-ICP8 primary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab20194</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab19311</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">a11005</td>
			<td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Immu-mount</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2x SDS-bicarb solution</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:101px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">3 M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fluorescence microscope equipped with imaging software</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Heat blocks</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>65 &#176;C and 95 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist um zu isolieren, Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) DNA aus infizierten Zellen für die Identifizierung von verbundenen viralen und zelluläre Proteinen durch Massenspektrometrie. Obwohl die Proteine, die Interaktion mit viraler Genome Hauptrollen in den Ausgang der Infektion spielen, war eine umfassende Analyse des Virusgenoms verbundenen Proteine nicht früher möglich. Hier zeigen wir eine Methode, die die direkte Reinigung von HSV-1 Genomen von infizierten Zellen ermöglicht. Virale DNA Replikation wird selektiv mit NUK gekennzeichnet, die eine Alkinen funktionelle Gruppe enthalten. Beschrifteten DNA wird ausdrücklich und unwiderruflich beschriftet über die kovalente Befestigung der Biotin-Azid über ein Kupfer (I)-Azid-Alkinen Cycloaddition oder Klick Reaktion katalysiert. Biotin-markierten DNA wird auf Streptavidin beschichteten Perlen gereinigt und damit verbundenen Proteine sind eluiert und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode ermöglicht die selektive Ausrichtung und Isolierung von HSV-1-Replikation Gabeln oder ganzer Genome von komplexen biologischen Umgebungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassung dieses Ansatzes zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der herpesviral Infektion, sowie die Prüfung der Genome von anderen DNA-Viren.

Die Verwendung von Klick-Chemie zur Reinigung von DNA aus Zellen wurde zuerst durch die iPOND Methode21erreicht. IPOND soll zellulären Replikation Gabeln für die Identifizierung von assoziierten Proteinen zu reinigen. Wir haben diese Technik, um speziell vDNA-Protein-Interaktionen während der Infektion studieren angepasst. Manipulation des Ansatzes für die virale Genome mit EdC (Abbildung 1), kombiniert mit synchronisierten Infekti...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Serie: Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Zusammenfassung

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