We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

<ol>
	<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoding+in+Bacteriophages.">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities.">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community.">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes.">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li><li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa.">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li><li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes.">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li><li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The bacteriophages. , (2006).</li><li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences.">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li><li>Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules.">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li><li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses.">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li><li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+ecosystems:+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus.">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741 (2003).</li><li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+S-PM2,+a+&#8220;photosynthetic&#8221;+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains.">The genome of S-PM2, a &#8220;photosynthetic&#8221; T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li><li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses.">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li><li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains.">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li><li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes:+signature+features+and+ecological+interpretations.">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).</li><li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages.">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li><li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40:+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage.">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism.">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li><li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution.">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li><li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins.">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+for+Enterobacteria.">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+P(BAD)+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li><li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles.">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van&#8217;t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TagCleaner:+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets.">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288 (2011).</li><li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli.">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002 (2009).</li><li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+for+plant+metabolomics:+reporting+MSI-compliant+studies.">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li><li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+viruses+exploit+their+host&#8217;s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation.">Marine viruses exploit their host&#8217;s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li><li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules.">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li><li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid.">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li><li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism.">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype.">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מציגים גישות phenomic לאפיון הפונקציונלי של גני הפאג משוערים. טכניקות כוללות assay פיתח מסוגל חילוף חומרים אנאבוליים מארח ניטור, צלחות Assay Multi-פנוטיפ (מפות), בנוסף לשיטה המבוססת של metabolomics, מסוגל למדוד השפעות לחילוף חומרי קטבולי. אנחנו סיפקנו כלים נוספים כדי לנהל את ערכות נתונים הגדולות הנובעות מטכנולוגיות אלה, המאפשרים לעיבוד תפוקה גבוה וניתוח 24. לבסוף, באמצעות ההשוואה של חלבון מבואר קפסיד הפאג, thioredoxin הפאג, שני גני הפאג חילוף חומרים משוערים, והתגובה הניסיונית הממוצעת אנו מציעים אסטרטגיות שונות לפרש את שני מערכי נתונים וכיתות גן, בדגש על זיהוי מגמות וזיהוי חריגים פנוטיפי. כאמור, שתי גישות כמותית למדוד רק מחצית מחילוף חומרי מארח. לפרש את התפקוד היחסי של כל אחד מחלבוני רומן תחת חקירה, הנתונים משני השיטות נדרש לספק ראיות של פונקציה. אמנם זה לא פוקוס של כתב היד הנוכחית שלנו, יציאות נתונים מכל שיטת phenomic היא לשים בניתוחים combinatory המתמקדים בטכניקות אשכולות כגון יער אקראי וניתוח מרכיבים ראשי. יתר על כן, השערות כתוצאה מהניתוח המשולב חייבים להיות מאומתות לאחר מכן על ידי שיטות גנטיות מסורתיות. לבסוף, השיטות שהוצגו מושפעים במידה רבה על ידי פיזיולוגיה של חיידקים ולכן בצעו את אותם הסטנדרטים. כאשר התחייבות או שיטה, שיקולים צריכים להיעשות כדי להבטיח קבוצות עצמאיות, משובטים הם התנסו ב; זיהום נמנע; משתנה אחד נבדק; והבקרות מתאימות שרצו בו זמנית. אי חשבון לנקודות אלה יגרמו לתוצאות לא ברורות, דומות לכל assay פיסיולוגי. צלחות Assay רב-פנוטיפ(מפות) הפיתוח של מפות מספק תפוקה גבוהה וassay להתאמה בהשוואה לטכנולוגיות זמינות כרגע (איור 5 א ושולחנות 1,2). Assay משתמש אספקה, ציוד, וטכניקות בסיסיות זמינה בכל מעבדות מיקרוביולוגיה. השילוב של צינור חישובית, 24 PMAnalyzer, לעיבוד וניתוח נתונים שלאחר מכן מבטיח פרשנות נתונים מהירה. בנוסף, שני ההיבטים ניסיוניים ואנליטיות של הגישה יכולים להיות מותאמים בקלות או מכוון למטרות מותאמות אישית. לדוגמא, אם חלק גדול מהנתונים לא מצליח לעבור סינון המפורטים בסעיף 4, אפשר לנפות ידני באמצעות עקומות הגדילה לזהות בעיות. אם מתעוררת הבעיה בשל פרמטרים מסנן מחמירים, התאמות לתסריט יכולה להתבצע. לחלופין, (כלומר עיבוי אם בעיות קשורות בתהליך הניסוי, ממושך; לא תקין של העברת חיידקי celLS, וכו &#39;) ולאחר מכן משכפל נוסף ניתן לחזור בקלות. כפי שתואר בCuevas et al. 24, PMAnalyzer היא תכנית יחידה bash נכתבה כתסריט מעטפת שמבצע את הניתוח וניתוח התסריטים כצינור מלוכד, אוטומטי. כל התסריטים נגישים באופן חופשי ממאגר Git ב 25 על ידי לקיחת הערך החציוני עבור כל נקודה על פני נתוני שלושה עותקים זמן, ולאחר מכן parameterizes העקומה לוגיסטית להשיג זמן ההשהיה, שיעור צמיחה מרבי, אסימפטוטה, וטווח רומן, צמיחת רמה. ערך החציון נבחר על הממוצע במחקר שלנו כדי להפחית את ההשפעה של חריגים גדולים, לעומת זאת, התסריט ניתן להתאים בקלות לחשב את הממוצע של הנתונים לשכפל. בשל וריאציה מופחתת (SE) ראה על פני נתונים לשכפל (איור 2 א) שמרנו את השימוש בחציון בPMAnalyzer להתקנת עקומה לוגיסטית. בנוסף, נותק לצמיחה במחקר זה (GL ≥ 0.4) היה Determined ידי השוואת נתונים כיצד הופרדו על פני רמת צמיחה ושיעור צמיחה המרבית (איור 1 א &#39;, ב&#39;). בהתאם למערכת המכשירים והמודל השתמשה במונח זה עשוי להשתנות, דורשת הגדרה מחדש של זה מנותק ערך. יתרון עיקרי של assay שלנו הוא היכולת להשוות פנוטיפים באמצעות פרמטר יחיד המאפיין את התפתחותם של חיידקים כללי, שבו אנו מגדירים כצמיחה רמה (GL). GL הוא ממוצע הרמוני, ולכן מפחית את ההשפעות של חריגים גדולים בנתונים. השימוש בממוצע הרמוני עם ערכים מצויד לוגיסטיים עברו לספק סיכום של הצמיחה הגיע בדרך של ניסוי וטעייה. שיטות אחרות ניסו לבדל את הצמיחה כללה: זמן שלקח להגיע פרמטרים ספציפיים עקומה (מחצית μ מקסימום, μ מקסימום, ויכולת נשיאה), המקדם של נחישות (R 2), ושילובים של R 2 מוכפל בפרמטרים עקומה ספציפיים. שימוש בממוצע הרמוני עם עברערכים לוגיסטי-כשירים לGL סיפקו את מגוון הגדול ביותר בהערכת צמיחה, וכך היא הפכה לשיטה של ​​בחירה. שיקול אחד שיש לשים לב כי יש דפוסי עקומת צמיחה דינמיים הפוטנציאל של איבוד בעת שימוש בפרמטר אחד או מודל מצויד. לדוגמא, הפרמטרים העקומה הבודדים של העקומה לוגיסטית וGL אינם מסוגלים גידול biphasic. בסביבת פחמן בודדת, השפעה זו על צמיחה מרמזת תיווכו של החלבון הנגיפי משני ההמרה של המצע או שינוי בניצול מצע. השפעות נוספות שעלולים להיות לאיבוד כאשר לא שוקלים פרמטרים צמיחה מרובים כוללות: זמן השהיה ממושך, מציע נטל מוגבר של מכונות או של מוצרים נגיפיים; במהירות מואצת שלב מעריכי, המצביע על חלבונים נגיפיים בשילוב לארח מסלולי הפקת אנרגיה; רמות גבוהות יותר של היווצרות או ביומסה, רומזים תמיכה נגיפית בספיגת חומרים מזינים מארח ואנאבוליזם (מידע לא מוצג). לפיכך, זומם עקומות גדילה המתהווה ( <stRong&gt; איור 2 א, ב) מספק מידע לגבי מגמות לאורך זמן ואילו GL לוקח בחשבון את המשתנים העיקריים של המודל לוגיסטי, מתן מספר הכמותי יחיד לייצג הצלחה כוללת של שיבוט. כאשר בוחנים את התגובות השונות שנתרמו על ידי גנים מבניים וחילוף חומרים במפות, הוא ציין כי שיעורי המצע השונים בשאלה לספק הראיות הגדולות ביותר לתפקוד חלבון. לדוגמא, חלבוני חילוף חומרים הקשורים לעתים קרובות עם רכישה של חומרים מזינים הגבלה, שהם נוקבים לארח 16,32 חילוף חומרים מרכזיים. ניסויים ראשוניים עולים כי MAP יש שיבוטים מחסה גני הפאג חילוף חומרים משוערים שלב פיגור מוגבר כאשר גדלו על מקורות מרכזיים פחמן חילוף חומרים (איור 2 א). לעומת זאת, שיבוטים נושאים גנים מבניים משוערים, הדורשים פרופורציות גדולות של בריכות אנרגיית המארח וdNTP, לגרום לתגובה חיובית כוזבת על צמיחה לסנאטמצעי פחמן חילוף חומרים RAL וחומצות אמינו. זה כנראה עקב ההצטברות של חלבונים מסיסים וכתוצאה מכך filamentation מארח ו / או גופי הכללה, כפי שנצפה באמצעות מיקרוסקופ (איור 2 א ומידע לא מוצג). בעוד נדרש ניתוח נוסף כדי לאמת את התוצאות הראשוניות אלה, המפות מסוגלות אחזור תגובות פנוטיפי המתואמים להשערת פונקציות של כיתות גן הפאג ספציפיות. בנוסף להבהרה של חלבונים נגיפיים בלתי ידועים, המפות הן משאב רומן לחקור את המגוון הפונקציונלי וחילוף חומרים של חיידק בודד או קהילה של חיידקים. רכיבי MAP מיועדים לשינוי קל כדי לתמוך בצמיחה של מגוון רחב של חיידקים; כולל ימי, auxotrophic, וחיידקים אנאירוביים. כדי להקל על מאמצים אלה התקשורת הבסיסית ומראש צמיחה המוגדרת דורשות מינים כימיים נוספים או הותאמו לפני סוג חיידקים שונה יכול להיות נתמכת במפות.הערה אחת בשימוש זה של המפות היא לשמור על תקשורת מוגדרת, האוסר על השימוש במרכיבים כגון tryptone, תמצית שמרים וpeptone. Metabolomics תחום metabolomics תלוי במאגרי מידע המטבוליט, הכוללים מטבוליטים מבודדים המזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. יש מתקן הליבה נבחר כאן אחד ממאגרי המידע הגדולים ביותר metabolomics. מעניין, יותר ממחצית מטבוליטים וכתוצאה מexperimentations היתה בלתי מזוהות (~ 65%), בעוד שאחרים מעולם לא לפני שנרשמו במארח שלנו, Escherichia coli (דוגמאות כוללות: אינדול 3 חומצה אצטית 33, חומצה סליצילית 34, וחומצת dihydroabietic 35). עובדה זו ניתן לייחס לשתי הטיה חזקה של בסיס הנתונים למטבוליטים צמח, או החלבונים הספציפיים תחת חקירה. ללא קשר, התוצאה הוא מספר מצומצם של מטבוליטים ידועים זמינים לייצוג נתונים וניתוח. בפוture, שיטות metabolomics מרובות באמצעות מאגרי מידע שונים יאפשר לכיסוי המטבוליט יותר. נכון להיום, ידוע והן מטבוליטים ידועים המשמשים בעת השוואה והנגדה החלבונים הנגיפיים הרומן שלנו. שימוש בגישה זו, אנו משערים כי שיבוטים מחסה חלבונים פונקציונלי דומים יחלקו דמיון מוגבר בפרופיל metabolomic המלא שלהם. ניתוח metabolomics ראשוני עולה כי בעוד גנים מבניים וחילוף חומרים לא להפריד אחד מהשני בצורה ברורה, גנים אלה מציגים השפעות דומות על המארח כאשר ביטוי יתר אין לתאם (איור 6). לדוגמא, אשכולות גני capsid על מבואר עם הדוק גני הטבולים המשוערים מודגשים במחקר זה, EDT2440 וEDT2441. חקירות באמצעות תכנית מנבא טופולוגיה הטרנסממברני ופפטיד האות זמינה לציבור הראו ראיות לכך ששניהם גני הטבולים המשוערים נמל תחום הטרנסממברני יחיד. מעניין 5 מתוך ה9 שיבוטים דואר בקבוצה הראשונה האשכול (משמאל החלק מdendrogram ביותר) היו לחזות תחומים הטרנסממברני באמצעות אותה תכנית טופולוגיה. יש צורך בבדיקות נוספות, עם זאת, סביר להניח כי מטבוליטים בביטוי היתר של שיבוטים אלה הקשורים לתגובת לחץ סלולרית כתוצאה מקרום או נטל מבני. עדות זו תומכת שבזמן שנתוני metabolomics בעל כמות מוגברת של רעש, השיטה היא מסוגלת הדגשת אותות שמבדילים השפעות כלליות של הגנים, הן בתוך ועל פני כיתת גן. כדי לקבוע אם השיטה היא מסוגלת להוציא את מידע ספציפי של תפקוד גן, מטבוליטים קובצו למסלולים מטבוליים ספציפיים. בן ההשערה, אם שיבוט משפיע מטבוליטים ספציפיים למסלול אחד, ולאחר מכן גן ביטוי יתר הוא פעיל באותו מסלול. לפני הקמת צינור אבטחת איכות metabolomics, נתונים ראשוניים עולים כי מעלמטבוליטים underrepresented ד היו בדרך כלל &quot;לא ידועים&quot;, המספקים מידע מועט על המסלולים הם קשורים עם (מידע לא מוצג). נתונים metabolomics מעובד, לעומת זאת, מגלים כי הרוב המכריע של פרופילי המטבוליט דומים ורק מספר מצומצם של שכיחות המטבוליט ידועה וידועה להשתנות על פני שיבוטים, לדוגמא פוטרסין ואורציל (איור 6). כדי לספק רזולוציה גדולה יותר של מאמצי תפקוד חלבון נעשים כדי להשוות ניסוי גני הפאג הרומן נגד גני הפאג ידועים, אשר ניתן להשתמש בי למלא &quot;החורים&quot; של המטבוליט אפיון פונקציונלי מבוססים. שימוש בטכניקה זו, הפונקציה שהוקצתה של גנים נגיפיים ידועים מספקת התייחסות לפונקציה של גנים לא ידועים. עם זאת, הגורם של ניתוח metabolomic הגבלה הוא בגודל ואת הרלוונטיות של מסד הנתונים. כדי לתקן את המגבלות האלה, מסדי נתונים metabolomic אפשר להתייחס אליה למחקר זה צריכים להיות מפותחים; כזהכבסיס נתונים של מטבוליטים ושכיחותם ספציפיים לאוסף ASKA של א &#39; השיבוטים coli בי ORF אחת מבוטא ביתר 36. ראיות לצורך של מסדי נתונים מסוג זה הניתנות בשנת 2013, כאשר חוקרים במעבדה הלאומית ברקלי Lawerence מלוקט מסד נתונים המקיף הראשונים של מטבוליטים ספציפיים לספריות מוטציה שלמות של חיידקי מודל 37. מחקר זה סיפק תובנה חדשה לגנים הנדרשים לניצול של מטבוליטים מסוימים, חושף את הקשר ברור בין הפנוטיפ וגנוטיפ. כאשר שוקלים metabolomics ככלי, חשוב להגדיר את משטר העיבוד ואחרי במתקן הגרעין. חפץ של רוב הליכי ניסוי הוא שונות היום-יום הקשורים למכשירים של שימוש. עד כה כל ניתוח GC-MS מיישם את השימוש בסטנדרטים פנימיים שכלולים בכל ריצה אנליטיים; עם זאת, תוספת של דגימות פנימיות ספציפיות פרויקט &lt;/ Em&gt; רץ בכל יום של ניסויים מסיר שונות נוסף. שיקולים אלה יש לטפל מוקדם כדי להימנע מבעיות נורמליזציה והטיות. פתרון נוסף הוא לעבד את כל הדגימות במתקן גרעין באותו מחשב וכיצווה אחת, אפשרות זמינה בכל מתקן גרעין. הכלים השונים הציג שני ובחנו מחדש בכתב היד הזה מספק רומן פירוש מסך ולאפיין גני הפאג תפקודי לא ידועים. הפשטות וההתאמה של השיטות הניסיוניות עם השימוש לייעל צינורות חישובית מבטיחים שיטות אלו חלות על מגוון רחב של מאמצי מחקר ושדות. המטרה שלנו היא שגישות phenomic מוצגות כאן תסייע חקירות נוספות של חלבוני הפאג רומן בנוסף למערכות שנמצאות באותה מידה תפקודית מוגדרים.

וירוסים שמדביקים חיידקים (aka bacteriophage או הפאג) מוערכים להתקיים על יותר מ 10 31 וירוס כמו חלקיקים (VLPs) בעולם והמספר בכל אורגניזמים אחרים בסביבה 1,2. מחקר metagenomic הראשון חוקר את קהילות ויראלי כרוכות בסביבות ימיות התמקד בכימות המגוון ראה בתוך שבריר הנגיפי 3. בנוסף, ברייטברט ועמיתיו מצאו כי מעל 65% מרצפי הקהילה הנגיפיים משותפים לא הומולוגיה לכל רצפים זמינים במאגרי מידע ציבוריים. מחקרי metagenomic לאחר מצאו עדויות דומות: metagenomes ממשקעים ימיים בסן דייגו, קליפורניה מכילה רצפי ויראלי ידועים 75% 4; metagenomes מימות המלוחות של ים סלטון מכיל רצפי ויראלי ידועים 98% 5; וmetagenomes הקשורים אלמוגים מכילים 95 - רצפי ויראלי ידועים 98% 6. הצטברות זו של מידע unannotated הביאהחומר גנטי הפאג להיות &quot;החומר האפל של היקום הביולוגי&quot; 7. אפיון גנטי של הפאג מסתמך על זיהוי דמיון רצף באמצעות השוואה מול מסדי נתונים חומצת גרעין וחלבונים קיימים. מכיוון שהמידע גנטי מקודד הפאג הוא בעיקר ידוע, שיטות המבוססת על הומולוגיה אינן יעילות. בתוך הגנום שלהם, בדרך כלל פאגים לקודד שלושה סוגים עיקריים גן: גני שעתוק ושכפול, גני חילוף חומרים, והגנים מבניים. גני השעתוק ושכפול (בכיתה I / II גנים 8) כוללים polymerases, primases, אנדו / Exo-nucleases, וקינאז. גנים אלה השמורים ביותר בשל חשיבותם בזיהום הפאג, תמלול ומשכפלים את החומר גנטי הפאג. polymerases הפאג קלות מזוהה באמצעות שיטות הומולוגיה רצף מסורתיות בשל השימור העולמי שלהם 9 והוכח לשמש כסמני פילוגנטי יעילים כמו 10.לעומת זאת, חילוף חומרים הפאג וגנים מבניים (כיתה השנייה / שלישי גנים 8) הם מסתעף יותר ויותר, ולעתים קרובות מבואר כגנים היפותטי. גני טבולי הפאג להשפיע על יכולת חילוף חומרים של המארח ולא נדרשים בהכרח לשכפול נגיפי. גנים אלו, המכונים לעתים קרובות גני עזר כמו חילוף חומרים 11 (AMGs), מופיעים לווסת את חילוף החומרים של מארח ולאפשר התקדמות אופטימלית של זיהום והצלחה של התבגרות virion. AMGs נקשר עם הניצול והספיגה של חומרים מזינים הגבלה או במסלולי הפקת אנרגיה. כמה דוגמאות כוללות photosystem גנים שנמצאו בגנום של cyanophage השונים 12-16, גנים הקשורים לחילוף חומרים ומוסדרים על ידי פוספט 17,18, וניצול של מסלול פנטוז פוספט לביוסינתזה dNTP הפאג 18,19. לשם השוואה, גנים מבניים הם בין אמצע לסוף גנים הופקו במהלך הזיהום ולהשתנות על פני הפאג-הו שוניםמערכות st. הייצור של חלבונים מבניים תלוי בזמינות של dNTP הנגיפית, ובריכות אנרגיה לשעתוק, התרגום, והרכבתם 8. חלבוני קפסיד וזנב סיבים מבניים נחשבים כסוטים ביותר של כל הגנים מקודדי החלבונים הנגיפיים ונדרשים לייצור virion מוצלח. הסטייה שלהם מיוחסת בדרך כלל לתפקיד הפעיל שהם משחקים בעיצוב אבולוציה משותף-מארח וירוס 20. חלבונים מסתעפים, ללא קשר למעמד הגן, הם בקלות להתעלם בעת השימוש בטכניקות הומולוגיה ויישור רצף מסורתיות. מאמץ לתקן את המגבלות ראו בהשוואות רצף קפדניות הביא כלים ביואינפורמטיקה מסוגלים באמצעות מאפייני רצף כדי לקבוע עמותה, כגון רשתות עצביות מלאכותיות 21. רשתות עצביות מלאכותיות (Anns) לאפשר החיזוי של גנים מבניים וחילוף חומרים, לעומת זאת, דורש אימות ניסיוני במורד הזרם לאפיין ישירותתפקוד גן. המטרה של כתב היד הזה היא לספק פרוטוקולי phenomic מסוגלים ניטור שני חילוף החומרים קטבולי ואנבוליים של חיידק מארח בביטוי של גן הפאג רומן, חזה תפקודי באמצעות Anns. תחום Phenomics, הביולוגיה קשורה עם פנוטיפים סלולריים, מבוסס היטב בביולוגיה מערכות כדי לסייע בחקירה של חלבונים עם פונקציה לא ידועה או pleiotropic. כלים Phenomic משמשים לקשר מידע פנוטיפי למידע genotypic. אנו משערים לגנים הפאג משוערים שתפקידם (ים) ניתן לקבוע דרך השפעות פיסיולוגיות מארח התבוננות בביטוי גני הפאג. כדי לחקור את ההשערה הזאת, שתי שיטות כמותיות נבחרו. צלחות Assay רב-פנוטיפ (מפות) שמשו כדי לפקח על ניצול מצע מארח והיווצרות ביומסה הבאה תוך metabolomics נמדד גיוון המטבוליט מארח ושפע יחסי בצמיחה בסביבה וספציפיתתנאים נפשיים. חלבונים מבניים וחילוף חומרים משוערים היו ביטוי יתר בEscherichia coli ותוצאות נציג משני הניסויים בהשוואה. טכניקות חזותיות רבות וצינורות עיבוד תפוקה גבוהה מוצגות כדי להקל על שכפול ניסיוני. לבסוף, שחזור והדיוק של השיטות שהוצגו הם דנו בהקשר של השפעות פיסיולוגיות צפויות לחלבון מבואר קפסיד וחלבון מטבולי הפאג, thioredoxin, בתוספת שתי AMGs משוער.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

חקירות נוכחי לאינטראקציות הפאג-מארח תלויות באקסטרפולציה ידע מהגנום (meta). מעניין לציין, 60-95% מכל רצפי הפאג לשתף אין הומולוגיה לחלבונים מבואר הנוכחיים. כתוצאה מכך, חלק גדול מהגנים הפאג הוא מבואר כהיפותטי. מציאות זו משפיעה במידה רבה את הביאור של שני גני חילוף חומרים מבניים ועזר. כאן אנו מציגים שיטות phenomic נועדו ללכוד את התגובה הפיזיולוגית (ים) של מארח נבחר במהלך הביטוי של אחד הגנים הפאג ידועים אלה. צלחות Assay רב-פנוטיפ (מפות) משמשות כדי לפקח על המגוון של ניצול מצע מארח והיווצרות ביומסה לאחר מכן, בזמן שmetabolomics מספק ניתוח דו-מוצר על ידי ניטור שפע המטבוליט וגיוון. שני כלים המשמשים בו זמנית כדי לספק פרופיל פנוטיפי הקשורים לביטוי של מסגרת אחת הפאג משוער קריאה פתוחה (ORF). תוצאות עבור נציג שני השיטות הן בהשוואה, highlighting הבדלי פרופיל פנוטיפי של מארח ביצוע או גני הפאג מבניים או חילוף חומרים משוערים. בנוסף, הטכניקות להדמיה וצינורות חישובית תפוקה גבוהה שאפשרו ניתוח ניסיוני מוצגות.

Watch this Scientific Journal Video about Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins at JoVE.com

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Video: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.