Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan unter Grantnummer 101-2221-E-002-064-MY3 unterstützt.

1. Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung <ol><li> Verwenden Sie einen grafischen Layout-Software (zB AutoCAD), um den Umriss eines T-Mikrokanal zu ziehen. Für das T-Mikrokanal, sind die beiden Zuführungskanäle 90 um breit und 2500 &amp; mgr; m lang, und der Einmündung Kanal 180 um breit und 3,000 &amp; mgr; m lang. Das Ende jedes Kanals auf einen einzelnen Kreis mit einem Durchmesser von 1.100 &amp; mgr; m. </li><li> Mark &quot;klar&quot; und &quot;dunkel&quot; für die Belichtung und verdeckten Gebiete auf. Für eine negative Photolack (zB SU-8), die Form des T-Mikrokanal ist &quot;klar&quot; und die Umgebung ist &quot;dunkel&quot;. </li><li> Verwenden einen Laser-Mustergenerator mit einer Wellenlänge von 442 nm und einer minimalen Strukturgröße von 2 um, um das Muster der T-Mikrokanal auf einer Chrom-auf-Glas-Fotomaske zu übertragen. </li><li> Verwenden der Photomaske, die ein Substrat (beispielsweise einseitig polierten Siliziumwafer) und einen Permanent Epoxy Photoresist (zB., SU-8), um eine Form durch eine Standard-Lithographieprozesses zu machen. Die Fotolackschicht ist 55,2 &amp; mgr; m dick. Im allgemeinen sollte das Photoresistdicke dünner ist als die Tiefe der Korrelation der Objektivlinse 17-19 sein. </li><li> Verwenden der Form und ein transparentes Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS), den T-Mikrokanal 20 herzustellen. </li><li> Zur fluidischen Verbindung mit einem Rohr aus rostfreiem Stahl von 2 mm Außendurchmesser, um Durchgangslöcher zu stanzen, um den kreisförmigen Muster auf den PDMS ausgerichtet sind. </li><li> Behandlung der Oberflächen der PDMS und einem Glasträger mit Sauerstoffplasma bei 60 W für 30 sec. Bringen Sie die PDMS auf den Objektträger. Bei den oxidierten Oberflächen der beiden Materialien schaffen eine starke Bindung. Platzieren der verbundenen PDMS Struktur auf einer heißen Platte für 5 Minuten bei 120 ° C. </li><li> Legen Teflon Rohre in die gestanzten Löcher für fluidische Verbindung. </li></ol> 2. Versuchsaufbau <ol><li> Konstruieren Sie die Mikroschlierensystem von einer Hoffman Modulationskontrastmikroskop durch Entfernen der Schlitzplatte in der vorderen Brennebene des Kondensators und Ersetzen der Modulator mit einer Messerkante in der hinteren Brennebene des 5X Objektiv 3. Die Tiefe der Korrelation, die von der numerischen Apertur der Objektiv 17-19 abhängt, dass es ausreicht, um die gesamte Tiefe der mikrofluidischen Vorrichtung zu bedecken. Die Oberfläche des Messerkante durch anodische Aluminiumoxid geschwärzt, um sein Reflexionsvermögen zu verringern. </li><li> Montieren Sie den High-Speed-Kamera an den Trinokulartubus des Mikroskops über einen C-Mount-Adapter. Haben Sie die Kamera vor der Strahlengang des Mikroskops durch einen Strahlteiler. Schließen Sie die Kamera an einen Desktop-Computer über ein Ethernet-Kabel. Einen Gamma-Korrektur auf 1 für die Kamera, so dass ihre Graustufenanzeige ist proportional zum Eingangsleuchtdichte. </li><li> Schalten Sie die Lichtquelle. Um übermäßige Hitze zu vermeiden, verwenden LED (Licht emittierende Diode) Beleuchtung. </li><li> Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware (zB &lt;/ Em&gt; Funktion imread in MATLAB), um die Grauwerte eines erfassten Bildes zu erhalten. Entfernen Sie die Messerschneide, passen Sie die Beleuchtung, die Blende und die Belichtungszeit, so dass die durchschnittliche Graustufen Auslesen des Bildes ist etwa 10% geringer ist als der Maximalwert. Dies bezeichnet die Hintergrundintensität für einen 0% Cutoff und wir verwenden einen Wert von 230 für ein 8-Bit-Bild. </li><li> Setzen Sie die Schneide auf das einfallende Licht vollständig zu blockieren. Erfassen den mittleren Graustufen-Anzeige des Bildes. Dies bezeichnet die Hintergrundintensität für eine 100% Cutoff und der Wert ist etwa 15 für ein 8-Bit-Bild. </li><li> Einstellen der Position der Messerkante, so dass der durchschnittliche Grau Auslesen des aufgenommenen Bildes liegt in der Mitte der Werte für 0% und 100% Cutoff. Jetzt ist der Grad der Cutoff auf 50% festgelegt ist. </li><li> Vorbereitung zwei transparenten Medien mit bekannten Brechungsindizes 21, die miteinander als Bestandteile vollständig mischbar sind. Um die Abhängigkeit der Brechungs ind evaluierenex auf die Konzentration des Gemisches, überprüfen Sie die Literatur 21 oder verwenden Sie die Gladstone-Dale Gleichung 22. Wenn die Kurve nicht linear über den gesamten Bereich, holen andere Fluidkomponenten. Dann wählt eine bestimmte Zusammensetzung unter dem der Brechungsindex der Lösung variiert linear mit der Konzentration. B. verdünnte wässrige Ethanol mit einem Massenanteil von 0,05 und Wasser als Arbeitsflüssigkeiten. </li><li> Setzen Sie den T-Mikrokanal auf dem Probentisch. Ordnen Sie die T-Mikrokanal so mit der Zusammenflusskanal parallel zur Messerkante (Abbildung 1). </li><li> Vorbereitung zwei identische Spritzen: Spritze A mit dem Arbeitsfluid, das als Referenzflüssigkeit (Wasser) dient gefüllt, und die Spritze B ist mit dem anderen Arbeitsfluid (verdünnte wässrige Ethanol) gefüllt. Die Größe der Spritze hängt von der gewünschten Durchflussrate Q und der Spezifikation des Spritzenpumpe: Q = &amp; pgr; d 2 V / 4, wobei d der Innendurchmesser des SYRinge und V die Geschwindigkeit des Kolbens. Strömungspulsationsausgleichsvorrichtung können in der Regel, indem Sie eine kleine Spritze mit 23 V zu erhöhen, verhindert werden. </li><li> Sammle den Auslaß von Fluid aus dem T-Mikrokanal in einem Becherglas. Sicherstellen, dass das Teflon Auslassrohr an die Wand des Becherglases fixiert, und sein Ende ist unterhalb des Flüssigkeitsniveaus in dem Becher, um Vibrationen, die durch Tröpfchen breakoff verursacht würde, zu vermeiden. </li></ol> 3. Kalibrierung <ol><li> Erfassen die Bilder der zwei Flüssigkeiten gemischt und der Referenzbilder. <ol><li> Bei einer gegebenen Reynoldszahl Re, Die Durchflussrate der Spritzenpumpen wird Q. Q von Q = μ (W + D) Re / 4ρ, wobei μ und ρ sind die Viskosität und die Dichte des Arbeitsfluids und W berechnet und D die Breite und Tiefe des Kanals der Mündung T-Mikrokanal verbunden. </li><li> Legen Sie eine Pumpe mit Spritze A und die andere Pumpe mit syringe B. Schließen Sie die beiden Eingänge des T-Mikrokanal über Teflonschlauch Spritze A und Spritze B. Starten Sie die Spritzenpumpen, die Arbeitsfluide in die T-Mikrokanal in gleichen Volumenströme zu liefern. </li><li> Warten Sie, bis stetigen Strom herstellt. Die stetigen Zustand wird durch die Entstehung einer stationären Schlierenmuster definiert. </li><li> Verwenden Sie die Kamera gesteuert Software zu zwanzig Bilder von fluidischen Mischen bei einer Bildrate von 30 Bildern pro Sekunde aufzeichnen. </li><li> Stoppen Sie die Pumpe, die mit Spritze B. geladen Nur Pumpe den Referenzflüssigkeit (Wasser) durch einen Einlass in den Zusammenfluß-Kanal des T-Mikrokanal mit konstanter Geschwindigkeit. </li><li> Warten Sie, bis stetigen Zustand erreicht ist und keine Schlierenmuster beobachtet. </li><li> Verwenden Sie die Kamera gesteuert Software, um das Referenzbild, zu nehmen, wenn kein optischer Inhomogenität in der T-Mikrokanal vorhanden ist. Nehmen zwanzig Rahmen mit einer Bildrate von 30 fps. </li><li> Wiederholen 3.1.1 bis 3.1.7 bei verschiedenen Reynolds-Zahl: Re = 1, 5, 10, 20 und 50, so daß keine komplexe Strömungsstruktur entsteht im Bereich der Einmündung des T-Mikrokanal 24. </li></ol></li><li> Verwenden einer Bildverarbeitungssoftware, das erworbene Bild I (i, j) von der Bezugsbild I 0 (i, j) 25, wobei i und j Pixelindizes teilen. </li><li> Verwenden ein CFD (Computational Fluid Dynamics) Paket zur Simulation Mischen der bezeichneten Flüssigkeiten im T-Mikrokanal. <ol><li> Konstrukt das dreidimensionale Modell für die Geometrie des T-Mikrokanal. Diskretisieren den Strömungsbereich in strukturierten Gittern. Um die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden feineres Netz in der Mündung und dem Zentralbereich des T-Mikrokanal. </li><li> Zuordnen, die physikalischen Eigenschaften von Flüssigkeiten und legt die Randbedingungen zur Fließdomäne. Während der Lösungsprozess, bestimmen die konzentrationsabhängigen Diffusionskoeffizienten von dem in der letzten erhaltenen KonzentrationsIteration 26, um die lokale Konzentration zu aktualisieren. </li><li> Untersuchen Sie die Empfindlichkeiten der berechneten Ergebnisse durch Ausführen der Netzstudie 27. </li></ol></li><li> Für jeden Knoten (x i, y i) auf der xy-Ebene, verwenden die CFD Nachbearbeitungswerkzeug auf die Mittelwerte der Konzentration Feld über die Kanaltiefe der Trapezregel annehmen: w (x i, y j) = {Σ k [w (x i, y j, z k) + w (x i, y j, z k + 1)] ∙ (z k + 1 - z k) / 2} / D 28, wobei D die Kanaltiefe. Verwenden Sie das zentrale Differenzierungsschema, um die deriva berechnentive der Konzentration in Bezug auf die Richtung quer zur Strömung (∂ w / ∂ y) i, j = [w (x i, y j + 1) - w (x i, y j -1)] / (y j +1 - y j -1). </li><li> Für positive und negative Steigungen, extrahieren das Verhältnis der Grauwerte I / I 0 (in 3.2 erhalten) und die Steigung der Massenanteil ∂ w / ∂ y (in 3.4 erhalten) an bestimmten Stellen, wie beispielsweise y = 0 (Mittellinie, in Strömungs Richtung) oder verschiedene gegebene x (Richtung quer zur Strömung). </li><li> Zeichnen Sie die Ergebnisse und bestimmen die Beziehung zwischen I / I 0 und ∂ w / ∂ y, I / I 0 </sub&gt; = C 1 ∂ w / ∂ y + C 2 (C 1 und C 2 Konstanten sind), mit linearen Regression. </li></ol> 4. Quantifizierung <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 für das Mischen in der Ziel Mikrofluidikvorrichtung. Die Tiefe des Ziel Mikrofluidikvorrichtung sollte gleich oder nahe dem von der T-Mikrokanal ist. Wenn unsicher Phänomen zu erwarten ist, erwerben Sie einen Videoclip (Bildfolge) im Schritt 3.1.4 statt. Die Framerate sollte hoch genug sein, um die Dynamik der Übergangsstrom eindeutig zu lösen, während die Belichtungszeit mit dem in 2.4, 2.5, 3.1.4 und 3.1.7 als Wert benutzt. </li><li> Verwenden der Beziehung in Schritt 3.6 erhalten werden, um das Verhältnis der Grauwerte der Steigung der Massenanteil in der Zielmikrofluidvorrichtung zu konvertieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Merzkirch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Visualization. , (1974).</li><li>Settles, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Schlieren and Shadowgraph Techniques. , (2001).</li><li>Sun, C. -. l., Hsiao, T. -. h. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+microfluidic+mixing+using+microscale+schlieren+technique.">Quantitative analysis of microfluidic mixing using microscale schlieren technique.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 15 (2), 253-265 (2013).</li><li>Sun, C. -. l., Sun, C. -. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Für fluidische Mischen in einer mikrofluidischen Vorrichtung, die Mikroschlierentechnik in der Lage, das Ausmaß der Konzentrationsgradient durch Quantifizieren Änderung der Lichtintensität zu messen. Weil das Prinzip dieser Methode beruht auf der Erfassung der Wechsel der Lichtausbreitung, die Arbeitsfluide und die Mikrofluidik-Vorrichtung haben den einfallenden Lichts zu sein. Zusätzlich kann das Protokoll eine lineare Beziehung zwischen dem Brechungsindex der Lösung und ihre Zusammensetzung so dass vorläufige B...

Fluidmisch ist ein wichtiges Problem, das bei vielen industriellen Prozessen und biologischen Systemen zu finden ist. Mit dem Aufkommen der Mikrofluidik, Mischen in Mikro hat viel Aufmerksamkeit durch seine Herausforderung in Diffusions Herrschaft unter den Massentransportmechanismen gebracht. Seit Gestaltung einer effektiven Mikromischer erforderlich quantitative Validierung wurden verschiedene Messmethoden entwickelt, 5-7. Dennoch ist die dreidimensionale Struktur, die üblicherweise in effiziente Mikromischer 5 gefunden wird, fordert eine genauere Darstellung der Konzentration Feld, das die gemeinsamen Messtechniken nicht zu liefern. Durch die Begrenzung des Betrachtungswinkels 8 oder Reaktionskinetik 6 können die vorgenannten Verfahren irreführenden Ergebnissen, die nicht richtig weiß für die Homogenität der Mischung Konto herzustellen. Für optisch transparente Flüssigkeiten Mischen in optisch transparenten Mikrostrukturen, Mikroschlierentechnik 3,9-14 </sup&gt; bietet eine attraktive Alternative zu analysieren Misch Inhomogenität. In der Vergangenheit hat die Mikroschlierentechnik wurden meist verwendet, um kompressible Strömung 9-13, 15 oder Phasengradient 16 sichtbar zu machen. Microscale Schlierentechnik profitiert von einer einfachen optischen Aufbau und eine hohe Empfindlichkeit und ermöglicht nicht nur die nicht-invasive Untersuchung der spezifischen Strömungs Funktion, die optische Störung verursacht, sondern ist für die Verwendung bei der Beurteilung der Misch gut geeignet. In diesem Papier, konstruieren wir die Mikroschlierensystem durch Einführen eines Messers Schneide in der hinteren Brennebene des Objektivs eines Mikroskops, beschreiben ein Kalibrierungsverfahren zur quantitativen Analyse zu realisieren, und berichten über einen Validierungsmessung in einem mikrofluidischen Oszillator 4. Messungen zu implementieren, werden die Arbeitsfluide geeignet ausgewählt, so dass der Brechungsindex der gemischten Fluide variiert linear mit der Zusammensetzung und der Dicke des Targets mikrofluidische Vorrichtung mit der auf iste in der Kalibrierung verwendet. Neben Spezieskonzentration können Mikroschlierentechnik ausgedehnt werden, um die Steigung der anderen skalare Größe, die linear auf den Brechungsindex, wie die Temperatur oder Salzgehalt korreliert ist, zu messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permanent Epoxy Negative Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single side polished silicon wafer</td>
			<td>Light Technology</td>
			<td>S4W1PP5SABUP1</td>
			<td>p-type, diameter: 100&#177;0.5 mm, thickness: 525 &#177;25 mm, orientation: (1 0 0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>kds210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10L2138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoffman modulation contrast microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N PLAN</td>
			<td>NA = 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife-edge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. high speed</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>NX7-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter HC 0.63x</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>541537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera operating software</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>MotionPro X Studio 2.02.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard-184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing, i.e. O.D. x I.D. 1/16 in. x 0.031 in.</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>58700-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro glass slide</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>S2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate</td>
			<td>Yeong-Shin</td>
			<td>HP-303DN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water, i.e. HPLC grade</td>
			<td>Alps Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl alcohol, i.e. reagent grade</td>
			<td>Nihon Shiyaku Reagent</td>
			<td>EA448652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image processing software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB R2009a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computational fluid dynamics package</td>
			<td>ESI group</td>
			<td>CFD-ACE+ 2008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mixing inhomogeneity in a microfluidic device by microscale schlieren technique

In diesem Papier präsentieren wir die Verwendung von Mikroschlierentechnik zu messen Mischen Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung. Die Mikroschlierensystem wird aus einer Hoffman Modulationskontrast-Mikroskop, die einen einfachen Zugang zu der hinteren Brennebene der Objektivlinse ermöglicht, durch Entfernen der Schlitzplatte und Ersetzen der Modulator mit einer Schneide ausgebildet ist. Das Arbeitsprinzip der Mikroschlierentechnik beruht auf dem Nachweis Lichtablenkung durch eine Variation des Brechungsindex hervorgerufen 1-3. Der abgelenkte Licht entweder entweicht oder durch die Messerschneide behindert, um eine helle oder eine dunkle Band zu produzieren sind. Wenn der Brechungsindex der Mischung variiert linear mit der Zusammensetzung, ist die lokale Änderung der Lichtintensität in der Bildebene proportional zum Konzentrationsgradienten senkrecht zu der optischen Achse. Der Mikroschlierenbild ergibt eine zweidimensionale Projektion des gestörten Licht durch dreidimensionale Inhomogenitäten erzeugt. Eine quantitative Analyse zu bewerkstelligen, beschreiben wir ein Kalibrierungsverfahren, das zwei Fluide in einem T-Mikrokanal mischt. Wir führen eine numerische Simulation, um den Konzentrationsgradienten in der T-Mikrokanal, der eng mit dem entsprechenden Bildmikroschlieren korreliert zu erhalten. Im Vergleich dazu wird eine Beziehung zwischen den Graustufen-Auslesungen der Mikroschlierenbild und den Konzentrationsgradienten in einer mikrofluidischen Vorrichtung dargestellt aufgebaut. Unter Verwendung dieser Beziehung ist es uns möglich, die Misch Inhomogenität von assoziierten Bildmikroschlieren mit Messungen in einem mikrofluidischen Oszillator 4 analysiert und zeigen die Fähigkeit des Mikroschlierentechnik. Für optisch transparente Flüssigkeiten ist im Mikroschlierentechnik ein attraktives Diagnosewerkzeug, zum momentanen Vollfeld-Information, die die dreidimensionalen Merkmale des Mischprozesses beibehält.

Die Graustufenverhältnis I / I 0 unter verschiedenen Reynolds-Zahl für die positiven und negativen Steigungen Massenanteil wird mit einem symmetrischen Band in der Mitte des T-Mikrokanal auftretenden dargestellt (Abbildung 2). Bei niedrigen Reynolds-Zahl ist der Schwanz des Schlieren Band erweitert und verschwommen aufgrund der Streuung durch die Misch Schnittstelle. Wie die Reynolds-Zahl erhöht, verkürzt die Diffusionslänge auf einen engeren Band führt. An verschieden...

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Aufrufe.  National Taiwan University. Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image. 

Serie: Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and ventilator-induced lung injury (VILI). However, studies in microfluidic channels with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung currently face several challenges, especially due to difficulties in establishing appropriate cell culture conditions, including media flow rates, within a given culture environment. The presented protocol describes an image-based approach to evaluate the structure of NCI-H441 human lung epithelial cells cultured in an oxygen-impermeable microfluidic channel with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung. Using phalloidin-based filamentous-actin staining, the cytoskeletal structures of the cells are revealed by confocal laser scanning microscopy, allowing for the visualization of individual as well as layered cells. Subsequent quantification determines whether the cell culture conditions being employed are producing uniform monolayers suitable for further experimentation. The protocol describes cell culture and layer evaluation methods in microfluidic channels and traditional fixed-well environments. This includes channel construction, cell culture and requisite conditions, fixation, permeabilization and staining, confocal microscopic imaging, image processing, and data analysis.

The presented protocol describes the development and use of a phalloidin-based filamentous-actin staining technique with confocal laser scanning microscopy (CLSM) to visualize adherent cell layer structure in microfluidic dynamic-culture channels and traditional fixed-well static-culture chambers. This approach aids in evaluating cell layer confluency, monolayer formation, and layer-thickness uniformity.

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...