YG wird durch ein Stipendium IDB unterstützt. IN ist ein Alon Kolleginnen und Faculty Fellow des Edmond J ‭. ‬ Safra Center for Bioinformatics an der Tel Aviv University ‭. ‬ Diese Arbeit wurde von ISF Zuschuss 1499/10 unterstützt.

Ein. Erstellen eines Scotch-Tape Master 5 <ol><li> Zeichnen oder ausdrucken gewünschten Mikrokanal Layout, zu skalieren, auf dem Papier. In unserem Fall ist das Design besteht aus zwei Y-förmige Kanäle, die jeweils 3 mm breit (Abbildung 2). </li><li> Decken einen Glasobjektträger mit Schichten von Klebeband. Die Anzahl der Schichten bestimmt die Höhe des Kanals (etwa 60 um pro Schicht). Wir haben 3 Tesafilm Schichten. </li><li> Legen Sie die Layout-Gestaltung auf einer ebenen Fläche. Richten Sie den Schlitten über die Design-Pattern. Schneiden Sie vorsichtig das Klebeband auf dem Objektträger mit einem Skalpell nach dem Layout. </li><li> Entfernen Sie die Scotch-Klebeband aus allen Regionen der Glasträger mit Ausnahme der in der Anlage des Mikrokanals. </li><li> Legen Sie die Folie in einem Heizofen bei 65 ° C für 2-3 min. Reinigen Sie vorsichtig mit Ethanol. </li></ol> 2. Herstellen eines PDMS Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Mischen Sie die Basis und Härter Komponenten PDMS, wie vom Hersteller empfohlen. Wir verwenden ein 10:1Verhältnis von Base zu Härtungsmittel. Gießen Sie etwa 30 ml PDMS-Gemisch in eine Petrischale bis zu einer Höhe von ~ 0,5 cm. Degas das PDMS im Vakuum, wenn nötig. Tauchen Sie den Objektträger aus Glas in der PDMS mit der strukturierten Klebeband nach oben. Platzieren Sie das Muster nach dem PDMS verhindert die Bildung von Luftblasen zwischen Folie und Schalenboden. Heilung für 48 Stunden bei 65 ° C, so dass das Gericht ist horizontal mit einer Wasserwaage. </li><li> In einer neuen 90 mm Petrischale pour 3 ml PDMS Mischung, was zu einer Schicht von etwa 0,5 mm tief. (Wenn eine Lackschleuder verfügbar ist, was an diesem Punkt verwendet werden). </li><li> Degas und wie in 2,1 heilen. </li><li> Sanft Ausschneiden der Mikrofluidikvorrichtung in die gewünschte Größe mit einem Skalpell. Diese Schicht wird die &quot;flow Schicht&quot; bezeichnet werden. </li><li> Schneiden Sie ein ähnlich großes Stück dünne Schicht PDMS aus der zweiten Petrischale. Dadurch wird die &quot;Brunnen Schicht&quot; bezeichnet werden. </li><li> Sie einen ausreichend dimensionierten Biopsie Stanzer (Wir nutzen 1,2 mm ID), um Stanzlöcher für die Einlässe und Auslässe in der Strömung Schicht. </li&gt; <li> Platzieren Sie die Vertiefungen, die auf einer dicken Glasträger auf die Gestaltung und Aufteilung Ausstanzung Vertiefungen, unter Verwendung von 2 mm ID Biopsie Puncher, in Ausrichtung mit den Mikrokanälen auf dem Layout. </li><li> Reinigen Sie beide PDMS Schichten sowie ein 24 mm x 60 mm Deckglas mit Ethanol. Luft trocknen und sauber zu halten. </li><li> Plasma behandelt sowohl die Deckglas und den Brunnen Schicht PDMS Benutzung von Standard-Plasmaätzer (für nicht-reversible Bindung) oder eine Hand-held corona treater 6 für reversible Bindung. Legen Sie das Brunnen Schicht auf der Oberseite des Deckglases, um die Haftung führen (Abbildung 3). Reiben Sie alle Luftblasen (falls erforderlich). </li></ol> 3. Cell Imaging Experiment <ol><li> Vergewissern Sie sich die gewünschten Medien bereit in geeigneten Spritzen verbunden flexible Kunststoffrohre mit einem Innendurchmesser von 0,02 &quot;(Tygon) in der Spritzenpumpe. </li><li> Wachsen S. cerevisiae-Stämme auf die gewünschte Phase in flüssigem YPD. Vortex gründlich und Platz 300 μl jedes Stammes in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Sanft legen 1 ul Concanavalin A (Sigma) 2 mg / ml in jede Vertiefung. Waschen überschüssiges Concanavalin A aus jeder Vertiefung durch zweimaliges Pipettieren Wasser. </li><li> Während die Concanavalin A trocknet, waschen Stämme zweimal mit 300 ul SC Medium ohne Glucose. Waschen Restglucose aus den Zellwänden hilft ordnungsgemäße Einhaltung des Concanavalin A. </li><li> Vortex Zellen gründlich. Pipette 0,75 ul oder weniger jeder Zellsuspension in einen eigenen Brunnen (Abbildung 3). Vorsichtig waschen verbleibenden Zellen mit Vollmedium. Die folgenden zwei Schritte müssen schnell durchgeführt werden, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Plasma behandelt den Chip und die Vertiefungen gründlich mit der Hand-held corona treater, man aufpassen, nicht die Brunnen direkt getroffen. Legen Sie das Chip auf dem Brunnen, aufmerksam auf die Ausrichtung zwischen den beiden (dieser Schritt kann unter einem Stereoskop durchgeführt werden). Drücken Sie vorsichtig die beiden Schichten von PD haltenMS. Langsam füllen Sie das Gerät komplett mit etwa 50 ul Vollmedium, so dass keine Luftblasen im Inneren des Kanals verbleiben. </li><li> Schließen Sie das Gerät, Einsetzen der Röhrchen in den entsprechenden Eingängen und starten Medienstrom. Darauf achten, dass keine Luftblasen in das Gerät eingeführt werden, da diese schwierig zu entfernen, dies kann durch Trennen eines Ein-oder Auslass erreicht werden und leichtes Klopfen auf das Gerät, wo die Blasen sind, darauf achten, daß die Deckglas brechen. </li><li> Zeigen unter dem Mikroskop und finden geeignete bildgebende Punkte in jedem gut. </li><li> Halten Sie die Zellen unter Vollmedium Flow für 1 Stunde oder länger, um Erholung zu ermöglichen, wenn nötig. </li><li> Starten des Experiments: wir verwenden konstanten Fluss von jeder der zwei Spritzenpumpen, um den Rückfluss des Mediums zu verhindern, wechselnden relativen Flussraten, wie gewünscht. Einstellen Pumpe A bis 0,8 ml / h und Pumpe B bis 0,2 ml / h ergibt sich strömenden Medium A über 80% der Breite des Kanals (4). Dies kann dynamisch cgehängt, indem Sie die beiden Durchsätze. Die neuen Bedingungen stabilisieren innerhalb von Sekunden über die volle Länge des Kanals 2. </li></ol>

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	<li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons.">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li><li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li><li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells.">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li><li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters.">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips &#38; Tips. , (2010).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li><li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks.">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Papier stellen wir ein einfaches Tischgerät Verfahren zum Erstellen eines mikrofluidischen Vorrichtung, die folgenden mehrere Hefestämme ermöglicht gleichzeitig unter dynamischen Bedingungen. Nach mehreren Stämmen in einem Kanal bietet ein zuverlässiges Werkzeug für den Vergleich Dynamik der einzelnen Zell-Antworten in mehrere Stämme. Ein Vorteil des Ansatzes ist, die Fähigkeit, die Vorrichtung mit einfachen Mitteln herzustellen, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum. Tatsächlich haben wir auch d...

Die Zellen werden ständig reagieren zu einer sich dynamisch verändernden Umwelt, indem sie ihren Stoffwechsel, Transkriptions-Profil und zellulärer Funktionen. Um diese Phänomene zu studieren, sind Methoden, die solche Veränderungen quantifizieren können benötigt. Eine Art von Anzeige für solche Reaktionen ist die Änderung in der Lokalisierung von stressbedingten Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf ernährungsphysiologischen Stress. Mikrofluidikvorrichtungen 1 verwendet wurden, um dynamisch manipulieren Umgebungsbedingungen zu Zellen 2-4. Sie stellen mehrere Vorteile für lebender Zellen: die Umgebung der Zellen genau gesteuert werden kann und dynamisch verändert; Zellen können Live-abgebildete jederzeit, einschließlich während der Manipulation von äußeren Bedingungen und minimalen Volumina Reagenz benötigt. Eine sehr einfache Konstruktion für eine Mikrofluidik-Vorrichtung, so dass Wechsel zwischen zwei Bedingungen ist eine Y-förmige Vorrichtung 2. Wir verwenden routinemäßig Y-förmigen mikrofluidischen Systemen, mit denenAnwendung der dynamischen Änderungen in den Zellen in dem Kanal. Wir verwenden dieses Gerät zur Lokalisierung Veränderungen der fluoreszenzmarkierten stressbedingte Transkriptionsfaktoren in Hefezellen zu folgen. Wir folgen diese Veränderungen unter wechselnden Ernährungsbedingungen. Zum Beispiel können wir ein Impuls (oder eine Reihe von Impulsen) Glucose-haltigem Medium in einem Zeitraum von nicht-Glucose-Medium, bei einer sehr feinen Zeitauflösung. Oft in solchen Experimenten ist ein interessiert Vergleichen der Antworten von verschiedenen Zell-Stämme (z. B. verschiedene Mutanten oder Wildtyp verschiedene Isolate). Der Y-förmige Kanal wird an einem Stamm in jedem Kanal begrenzt - falls mehr als ein Stamm verwendet wird, gibt es keinen einfachen Weg, um zwischen den Stämmen zu unterscheiden. Um dies zu überwinden, kann unterschiedliche Kanäle verwendet werden. Wenn wir die gleiche Dynamik Bedingungen mehrere Stämme gelten wollen, würden wir gerne die Y-Channel-Konzept mit mehreren Kanälen zu verbinden. Es gibt zwei Herausforderungen bei der Umsetzung dieser Lösung: Es kann schwierig sein, t geltener gleichen Bedingungen zur gleichen Zeit, um alle Kanäle, und es ist eine geometrische Einschränkung auf die Anzahl der Y-Kanäle, die in einem Gerät montiert werden kann. Wir waren daher auf der Suche nach einem Weg für die Anzeige mehrere Stämme in einem Kanal unter dynamischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein zweischichtiger Mikrofluidikvorrichtung zum Abbilden mehrerer Stämme in einem Kanal unter den gleichen dynamischen Verhältnissen bestimmt. Die untere Schicht besteht aus dünnen PDMS mit einer Lochreihe. Diese Schicht wird auf das Deckglas Schaffung Vertiefungen, in welche man die verschiedenen Stämmen platzieren, anhaftendem sie mit Concanavalin A auf dem Glas wird angebracht. Die zweite Schicht ist eine Y-förmige Mikrofluidikvorrichtung erstellt unter Verwendung der Tesafilm Methode 5. Nach dem Platzieren der Stämme in den Wells die zweite Schicht schnell ausgerichtet und an dem ersten und schafft einen Kanal mit mehreren Vertiefungen, die die verschiedenen Stämme enthalten. Dieser letzte Gerät ermöglicht nach mehreren Stämmen in einem Kanal, wo alleStämme sind mit den gleichen Bedingungen an der exakt gleichen Zeit unterworfen. Das gesamte Design-und Produktionsprozess kann auf dem Tisch gemacht werden, mit einfachen Mitteln, ohne weiche Lithographie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumexsikkator </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biopsie punchers </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> Harris Uni-Core 15.076 (2 mm), 15.074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Spritzenpumpen </td><td> Chemyx </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Corona treater </td><td> Electro-technische Produkte </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygon-Schlauch </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavalin-A </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Tesafilm </td><td> 3M Scotch </td><td> Transparent Tape 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

a microfluidic device for studying multiple distinct strains

Die Untersuchung von Zell-Antworten auf Veränderungen der Umwelt darstellt vielen experimentellen Prüfungen: Zellen müssen unter wechselnden Bedingungen bebildert werden, oft in einer vergleichenden Weise. Multiwell Platten werden routinemäßig verwendet, um viele verschiedene Stämme oder Zelllinien zu vergleichen, aber eine beschränkte Kontrolle über die Umwelt Dynamik. Mikrofluidikvorrichtungen, auf der anderen Seite erlauben exquisite dynamische Kontrolle über den äußeren Bedingungen, aber es wird ein Bild anspruchsvoll und unterscheiden mehr als einige Stämme in ihnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von leicht und schnell eine Mikrofluidik-Vorrichtung in der Lage ist Aufbringen dynamisch ändernden Bedingungen an mehreren verschiedenen Hefestämmen in einem Kanal. Das Gerät ist so konstruiert und hergestellt mit einfachen Mitteln, ohne die Notwendigkeit für weiche Lithographie. Es besteht aus einem Y-förmigen Strömungskanal an einer zweiten Schicht zusammengesetzt beherbergen Mikrowells. Die Stämme werden in separate Vertiefungen platziert und abgebildet unter den exakt gleichen dynamischen Bedingungen. Wir demonstrate die Verwendung der Vorrichtung zur Messung Proteinlokalisierung Antworten auf Impulse des Nährstoffs Veränderungen in verschiedenen Hefestämmen.

Um die Trennung zwischen verschiedenen Stämmen zeigen wir abgebildet zwei unterscheidbare Hefestämme in abwechselnden Vertiefungen. Imaging die volle Brunnen zeigt keine Zelle Leckage zwischen Brunnen (5a, b). Beide Stämme haben den Transkriptionsfaktor MSN2 mit YFP markiert. Um die gleichzeitige Wirkung von sich dynamisch ändernden Bedingungen zu testen, wechselten wir die Strömungsgeschwindigkeiten in den zwei Eingangskanäle, wodurch ein Schritt der nicht-Glucose-Medium, das in Lokalisation MSN2...

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A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Wir stellen eine einfache Methode zur mikrofluidischen Vorrichtungen, die nach vergleichbaren dynamischen Bedingungen, um mehrere verschiedene Stämme zu produzieren, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum oder weiche Lithographie.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K Aufrufe.  Tel Aviv University. Wir stellen eine einfache Methode zur mikrofluidischen Vorrichtungen, die nach vergleichbaren dynamischen Bedingungen, um mehrere verschiedene Stämme zu produzieren, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum oder weiche Lithographie.

Serie: A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.