Diese Studie wurde von der Ophthalmic Research Institute of Australia (Oria) unterstützt. Wir danken Prof. Algis Vingrys und Dr. Bang Bui, University of Melbourne, für zunächst uns helfen, die VEP Aufnahmetechnik zu entwickeln.

Ethics Hinweise: Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken und den Richtlinien der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und wurden durch die genehmigte Tierethikkommission der Macquarie University. 1. VEP Elektrodenimplantation <ol><li> Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (75 mg / kg) und Medetomidin (0,5 mg / kg). Hinweis: Nach der Einleitung der Narkose, beachten Sie die Entzugs Reflexe (Pinch-Test, der Hornhaut und der Augenlidreflex, etc.) und ihre Abwesenheit als Indikation zur Operation zu beginnen. Tiere ständig in der gesamten Operation zu überwachen und zu verwalten zusätzliche Anästhetika (10% vom Ausgangs Ketamin Dosis pro top-up), wenn die Reflexe vorhanden sind. Adulte Ratten (&gt; 12 Wochen) werden in den Experimenten verwendet. </li><li> Rasur die Haut des OP-Bereich.Legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage (37 ° C), um die Körpertemperatur während der Operation aufrecht zu erhalten. Bereiten Sie die Haut durch topische Anwendung von PVP-Jod. Bewerben Chirurgisches Tuch. Gelten topische Augensalbe zur Hornhaut Trockenheit unter Vollnarkose zu vermeiden. Pflegen Keimfreiheit, indem sie sterile Instrumente. </li><li> Einen Längshautschnitt auf der Mittellinie der Kopfhaut. Deaktivieren Sie das Bindegewebe um gute Belichtung des Schädels zu erreichen. </li><li> Vorsichtig bohren kleine Bohrlöcher manuell mit einem Mikrohandbohrmaschine auf 7 mm hinter dem Bregma und 3 mm lateral der Mittellinie. </li><li> Implantatschraube Elektroden durch den Schädel in die Rinde (Bereich 17), Durchdringen der Kortikalis zu einer Tiefe von etwa 0,5 mm. Implantat eine Referenzelektrode Schraube auf der Mittellinie 3 mm rostral des Bregma. Bewerben Zahnzement zu umhüllen und fixieren Sie die Schrauben (nicht immer erforderlich). </li><li> Naht der Haut des Kopfes, zu verwalten antibiotische Salbe auf die Haut und lassen Sie das Tier recover aus der Narkose auf einer Erwärmung pad. Hinweis: Alternativ können Elektroden können dem Tageslicht ausgesetzt werden, so dass die Haut muss nicht in jeder Aufzeichnungs wieder geöffnet werden. Unmittelbar nach Beendigung der Operation, aber vor dem Aufwachraum, verwalten ein nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAID) (wenn nicht vor der Operation verabreicht wird) oder ein Opioid-Analgetikum. Überwachen Sie die Tiere ständig bis zur vollständigen Wiederherstellung nach Betäubung und ambulant voll. </li><li> Lassen Sie mindestens 1 Woche für die Tiere von der Operation vor der VEP Aufnahme erholen. </li></ol> 2. Optic Nerve Injection <ol><li> Betäuben das Tier, bereiten die Haut und wenden drapieren wie oben beschrieben (1.1 und 1.2). </li><li> Einen 1- bis 1,5-cm-Einschnitt in der Haut oberhalb der Umlaufbahn von einer zufällig ausgewählten Auge. Öffnen Sie das Unterhautgewebe, um die Augenhöhle mit feinen Iris Schere zu erreichen. Öffnen Sie die Bindehaut und vorderen Tenon-Kapsel unter dem Operationsmikroskop. </li><li> Ziehen Sie die äußeren AugenMuskeln und intraobital Tränendrüsen auf ca. 3 mm Länge des Sehnervs freizulegen. Öffnen Sie die Dura und Arachnoidea Angelegenheit Schichten um den Sehnerv in Längsrichtung mit einer ophthalmischen Klinge. </li><li> Legen Sie die Glaspipette in den Sehnerv in einem Abstand von 2 mm hinter der ganzen Welt. Die Glas-Mikropipette wird in eine Hamilton-Spritze befestigt ist. </li><li> Injizieren 1% Lysolecithin (0,4-1,0 ul, mit 0,02% Evans Blau, das keine Auswirkungen auf die Myelinisierung) langsam in das Nerven ungefähr über einen Zeitraum von 30 sec. </li><li> Naht der Hautschnitt. Gelten antibiotische Salbe um Infektionen zu vermeiden. Partneraugen können als interne Kontrollen für die Elektrophysiologie Aufnahmen serviert. </li><li> Legen Sie die Tiere auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen. </li></ol> 3. VEP Recording <ol><li> Betäuben das Tier und bereiten die Haut wie 1.1 und 1.2. Hinweis: Niederdosis Narkosemittel kann für elektrophysiologische reco verwendet werdenrding (Ketamin 40 mg / kg und Medetomidin 0,25 mg / kg). </li><li> Legen Sie die Ratte in einem dunklen Raum und lassen Sie ihn in die Dunkelheit für 5 anzupassen - 30 min. In einigen Fällen können Ratten jeweils dunkel angepasst O / N für scotopic oder Licht zur photopischen VEP Aufnahmen 8 angepasst werden. </li><li> Aufrechterhaltung der Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C durch die homoeothermic Tuchsystem mit einer rektalen Temperaturfühler. </li><li> Erweitern die Schüler mit 1,0% Tropicamid Augentropfen. Öffnen Sie die Haut über den Schädel, um auf die vorge platziert in situ Schraube Elektroden. </li><li> Schließen Sie die Schraube über der kontralateralen visuellen Kortex des stimulierten Auge und dem Referenzschraube an den Verstärker. Legen Sie eine Nadelelektrode in den Schwanz als die Erde. Messen Sie und pflegen die Elektrodenimpedanz unter 5 kOhm. </li><li> Legen Sie eine Mini-Ganzfeld-Stimulator direkt auf der Haut um die Augenlider, um überlegene Augen Isolierung 7 bereitzustellen. Die Beleuchtung der Stimulator muss vorher kalibriert werdenmit einem Photometer. </li><li> Liefern Fotostimulation durch Lichtblitze 100 mal mit einer Frequenz von 1 Hz, bei niedrigen und hohen Bandpassfiltereinstellungen von 1 bis 100 Hz. Das Signal Abtastrate bei 5 kHz. Gilt: Signale sollte mindestens bei ca. 250 abgetastet werden - 300 Hz, um sicherzustellen, dass mehr als zwei Proben werden während eines jeden Zyklus gesammelt. </li><li> Naht der Haut zurück und die Tiere zu halten auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen. Aufzeichnungs kann wiederholt auf einzelne Tiere aufgezeichnet werden, um funktionelle Veränderungen über einen Zeitraum zu überwachen. </li><li> Am Endpunkt, eine Überdosis zu verabreichen Injektion von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg, ip), um das Tier einschläfern. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Herzstillstand, Atemstillstand und eine Abnahme der Körpertemperatur. </li></ol> 4. Gewebepräparation und Histologie <ol><li> Entfernen Sie die Sehnerven von eingeschläfert Tiere unter dem Mikroskop und befestigen Sie das Gewebe in 1% Paraformaldehyd O / N. </li> &lt;li&gt; gründlich waschen das Gewebe mit Kochsalzlösung. Behandeln Sie das Gewebe in einem automatischen Gewebeprozessor und betten in Paraffin. Geschnittenen Abschnitte (5-10 &amp; mgr; m) unter Verwendung eines Rotationsmikrotom. Hinweis: Für die Immunhistochemie Studie beheben Gewebe in 1% Paraformaldehyd, wasche mit Kochsalzlösung und Inkubation mit 30% Saccharose O / N. Betten Sie Gewebe in OCT Einbettmedium und machen Gefrierschnitten unter Verwendung eines Kryostaten. </li><li> Abschnitte in 0,1% fast blue Lösung wie Luxol (in 95% Ethanol) O / N Inkubieren bei 56 ° C. Differenzieren Sie die Abschnitte in 0,05% Lithiumcarbonat für 30 Sekunden und dann 70% Ethanol für weitere 30 sec. Schließlich in 0,1% Cresylviolett Lösung Gegenfärbung 30 Sekunden vor der Montage der Teile. Nutzen Sie die schnelle Blau-Färbung, um Myelin in den Sehnerv 5 zu identifizieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Optic+neuritis.">Clinical practice. Optic neuritis.</a> N Engl J Med. 354 (12), 1273-1280 (2006).</li><li>Lassmann, H., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Multiple sclerosis as a neuronal disease. , 153-164 (2005).</li><li>Fahle, M., Bach, M., Heckenlively, J., Arden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. , 207-234 (2006).</li><li>Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+visual+evoked+response+in+optic+neuritis.">Delayed visual evoked response in optic neuritis.</a> Lancet. 1, 982-985 (1972).</li><li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+delay+of+visual+evoked+potential+is+a+real+measurement+of+demyelination+in+a+rat+model+of+optic+neuritis.">Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).</li><li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+loss+in+a+rat+model+of+optic+neuritis+is+closely+correlated+with+visual+evoked+potential+amplitudes+using+electroencephalogram+based+scaling.">Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).</li><li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reproducibility+of+VEP+recording+in+rats:+electrodes,+stimulus+source+and+peak+analysis.">Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis.</a> Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).</li><li>Heiduschka, P., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+visual+function+in+pigmented+and+albino+rats+by+electroretinography+and+visual+evoked+potentials.">Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).</li><li>You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+visual+evoked+potentials+using+underlying+electroencephalogram+levels+improves+amplitude+reproducibility+in+rats.">Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).</li><li>Levkovitch-Verbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+optic+nerve+diseases.">Animal models of optic nerve diseases.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).</li><li>Henry, K. R., Rhoades, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+albinism+and+drugs+to+the+visual+evoked+potential+of+the+mouse).">Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse).</a> J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).</li><li>Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+halothane,+isoflurane,+sevoflurane+and+desflurane+on+the+electroencephalogram+of+the+rat.">Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat.</a> Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).</li><li>Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+F-VEP+during+isoflurane-induced+EEG+suppression.">Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).</li><li>Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+temperature-dependent+and+independent+actions+of+chlordimeform+on+visual+evoked+potentials+and+axonal+transport+in+optic+system+of+rat.">Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat.</a> Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).</li><li>Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+changes+in+visual+evoked+potentials+of+rats.">Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lysolecithin+on+non-myelinated+axons+in+vitro.">The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro.</a> Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).</li><li>Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+neuronal+apoptosis+in+a+rat+model+of+multiple+sclerosis.">Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis.</a> J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).</li><li>Lachapelle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+remyelination+in+the+nonhuman+primate+optic+nerve.">Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve.</a> Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks10. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors&#8217; experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision1. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve2. Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions3. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway4. 
The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve5; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)6. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination5. 
Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals7. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>AC 116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>sc-204073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>sc-202371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoeothermic blanket system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>NC9203819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance meter&#160;</td>
			<td>Grass</td>
			<td>F-EZM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw electrodes&#160;</td>
			<td>Micro Fasteners</td>
			<td>M1.0&#215;3mm Csk Slot M/T 304 S/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subdermal needle electrodes&#160;</td>
			<td>Grass</td>
			<td>F-E3M-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Repair&#160;</td>
			<td>DeguDent GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-emitting diode&#160;</td>
			<td>Nichia</td>
			<td>NSPG300A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioamplifier</td>
			<td>CWE, Inc.</td>
			<td>BMA-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED system</td>
			<td>Cambridge Electronic Design, Ltd.</td>
			<td>Power1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysolecithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#8217;s blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visual evoked potential recording in a rat model of experimental optic nerve demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Reproduzierbare inner sessional VEP Spuren sind in Abbildung 1 dargestellt und eine signifikante Verzögerung in N1 Latenzzeit kann nach dem Sehnerv Injektion zu sehen. Teil Sehnerv Läsionen der Demyelinisierung auf histologischen Schnitten mit Luxol schnelle Blau-Färbung 5 beobachtet werden. Abbildung 2 zeigt einen repräsentativen Querschnitt mit einer kleinen Brenn demyelinisierten Läsion in der Mitte des Sehnerven. Beachten Sie, dass Querschnitt repräsentieren nicht G...

Watch this Scientific Journal Video about Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination at JoVE.com

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

visual-evoked-potential-recording-rat-model-experimental-optic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Aufrufe.  Macquarie University. Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection. 