Diese Arbeit wurde von der F &amp; E-Programm für die Gesellschaft der National Research Foundation (NRF), durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Grant No 2013M3C8A1075908) finanziert unterstützt.

1. DNA-Extraktion aus FFPE Reference Standard-Zelllinien Hinweis: Bei diesem Verfahren wurde die DNA-Extraktion aus FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) unter Verwendung der FFPE Gewebe-DNA-Isolation Kit, wie in der unten beschriebenen Protokoll durchgeführt. Automatisierte DNA-Extraktion wurde nach Angaben des Herstellers für die gesamte DNA-Isolierung erreicht. <ol><li> Verwendung eines Mikrotoms und die ursprüngliche FFPE Block manuell frische Abschnitte vor der DNA-Extraktion und Analyse vorzubereiten, nach festgelegten Verfahren. Dass die Probe-Eingang für den Gewebeabschnitt (en) analysiert nicht eine kombinierte Gesamtdicke von 10 &amp; mgr; m überschreitet und die Fläche nicht 600 mm 2 für einen einzigen Abschnitt überschreiten. </li></ol> 1.2 TPS-Protokoll Hinweis: Die in Tabelle 1 angegebenen Mengen entsprechen der erforderlich ist, um 48 Proben zu verarbeiten Minimum, und das Verfahrendargestellt ist in Übereinstimmung mit den TPS-Richtlinien. Vor dem Start des Experiments nieder die FFPE-Proben in der E-Rohr durch Zentrifugation bei 600 · g, um den Verlust von Proben während der automatisiertes Programm zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie die automatisierte DNA-Isolierung Instrument und Computer. Öffnen Sie den Run Steuerungssoftware und legen Sie eine automatische Last Fach in den TPS-Deck Ladefläche. </li><li> Verzichtet Reagenzien in die entsprechenden Rinnen wie in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Legen Sie die 4 Proben (BRAF-WT, BRAF V600E 50%, 5% und 1%) in den Probenträger-Racks. </li><li> Setzen Sie die Spitze-Boxen in den Trögen in den Spalten 2 und 3 und überprüfen Sie die Tipps für die Anwesenheit von mehr als einem Filter pro Spitze, die den Lauf abbrechen wird. </li><li> Stellen Sie sicher, die richtige Mischung des Lysepuffer und Waschpuffer durch Umdrehen sie 3-5 mal und laden Sie sie in die entsprechenden Mulden in Spalte 4 (Abbildung 1). </li><li> Nach Invertierung für einige Male oder mild vortExing, laden Sie das Elutionspuffer, magnetische Kügelchen, und FFPE-Puffer in den kleinen Mulden in Spalte 5, wobei 1-Slot leer ist, wo angegeben (Abbildung 1, Tabelle 1). </li><li> Legen Sie eine 2 ml Deep Well Platte (DWP) auf den Plattenträger (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Führen Sie die folgenden letzten Schritte vor dem Start eines Lauf: <ol><li> Uncap alle Rohre und Reagenzien Tröge. Bestätigen Sie, dass ausreichende Kapazitäten in der flüssigen Abfallflasche erhältlich. Bestätigen, dass die Abfallflasche leer ist und mit einem Biohazard Tasche ausgekleidet. Bestätigen Sie, dass die Spitze Auswurfplatte wird in der Abfalleinheit zentriert ist. </li><li> Schließen Sie die vordere Abdeckung. </li></ol></li><li> Starten Sie die Software. Öffnen Sie die NA_Prep_Main_MLSTARlet.med Datei. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Gerätestatus wird vom Leerlauf zum Laufen wechseln. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Proben für diesen Lauf. Wählen Sie die gewünschte Methode für diesen Lauf (DNA = 0). Geben Sie die Position des ersten Hoch volume Spitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Geben Sie die Position des ersten Standard-Volumenspitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Hinweis: Das Gerät wird dann durch automatisierte Schritte laufen ohne Benutzereingriff. Eine detaillierte Arbeitsablauf ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn das Experiment beendet ist, werden Reagenz Abfälle und Tipps in den Abfallanordnung injiziert. </li><li> Quantifizierung gereinigter genomischer DNA unter Verwendung eines fluorometrischen Verfahrens. Anmerkung: DNA-Proben, die eine Mindestkonzentration von 3,3 ng / &amp; mgr; l enthalten, werden ddPCR Analyse (Teil 2) unterworfen. </li></ol> 2. DNA-Mutation Profilierung: ddPCR Protocol Hinweis: Das Protokoll für DNA-Mutation Profilierung aus 3 Hauptschritten: 1) Tröpfchenerzeugung, 2) Konventionelle PCR-Amplifikation, 3) Tröpfchen Lesen und 4) DNA-Mutation Profilierung. 2.1. Tröpfchenerzeugung Hinweis: ddPCR Supermix istempfohlen für ddPCR, da diese Mischung enthält Reagenzien für Tröpfchenerzeugung erforderlich. <ol><li> Um Verunreinigungen zu vermeiden, befolgen Sie Standard-Sicherheitsvorkehrungen, wie das Tragen von Handschuhen, mit einem sauberen PCR Haube, saubere Pipetten und low-Protein-bindenden Rohre. </li><li> Sicherzustellen, daß die Mindestkonzentration von humanen genomischen DNA-Probe beträgt 3,3 ng / ul. Anmerkung: Die Menge an gereinigter DNA-Probenkonzentration wird auf der Analyse% Mutationsfrequenz Detektions variieren. </li><li> Montieren Reaktionsmischungen in 96-Well-PCR-Platten. Auftauen und ins Gleichgewicht die Reaktionskomponenten auf RT. Bereiten PCR-Reaktionen durch die Kombination von 2X ddPCR Supermix (10 ul) und 20 Primer (vorwärts und rückwärts, 900 nM) und Sonde (250 nm) mit jedem gereinigten DNA-Probe (66ng / 2 ul) machen bis zu 20 &amp; mgr; l mit destilliertem Wasser (als pro Tröpfchenerzeugers Protokoll) </li><li> Vortexen Mischung gründlich bis zur Homogenität und kurz zentrifugieren, sicherzustellen, um den Inhalt am Boden des Rohres vor der Ausgabe zu sammeln. Last 20 &amp; #181; l auf die Kartusche für die Tröpfchenbildung. </li><li> Betrieb des Tropfengenerators, der nach Hersteller empfohlenen Protokoll <ol><li> Setzen Sie die Patrone in den Halter mit der Kerbe in der Patrone auf der oberen linken Seite des Halters positioniert. In 20 ul Reaktionsmischung, die Proben in der Mitte, und 70 &amp; mgr; l-Generator Öl in den Boden Brunnen. </li><li> Bringen Sie die Dichtung auf der Oberseite der Patrone. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung fest eingehakt an beiden Enden des Inhabers; andernfalls wird ein ausreichender Druck zur Tropfenerzeugung nicht erreicht werden. </li><li> Öffnen Sie den Tropfengenerator durch Drücken der grünen Taste auf der Oberseite des Gerätes und setzen Sie die Patrone. Wenn der Halter in der richtigen Position, sowohl die Leistung (links nach rechts) und Halter (Mitte rechts) leuchtet grün. </li><li> Drücken Sie die obere Taste auf dem Gerät erneut, um die Tür zu schließen und zu initiieren Tropfenerzeugung. Hinweis: Nach dem Drücken der button, einem Verteiler positioniert sich über die Austrittsbohrungen, Ziehöl und Proben durch die mikrofluidischen Kanälen, in denen Tröpfchen erzeugt werden. Droplets fließen in den Tröpfchen gut, wo sie akkumulieren. Die Tröpfchenkontrollleuchte (rechts) blinkt grün, nach 10 Sekunden, um anzuzeigen, dass Tropfenerzeugung ist im Gange. </li><li> Wenn Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, wechseln alle 3-Anzeige leuchtet dauerhaft grün; öffnen Sie die Tür durch Drücken der Taste, und nehmen Sie die Halterung vom Gerät ab. Entfernen Sie die Einwegdichtung aus der Halterung und entsorgen Sie sie. Hinweis: Die oberen Vertiefungen der Patrone enthalten, Tröpfchen, und die mittleren und unteren Brunnen sind fast leer, mit einer kleinen Menge an Restöl. </li></ol></li></ol> 2.2. Vorbereitung für die PCR <ol><li> Für jede Probe pipettieren Sie 40 ul der Tröpfchen Inhalt von oben auch die Patronen in einer einzigen Vertiefung einer empfohlenen 96-Well-PCR-Platte wie in Instrumentenprotokoll des Herstellers angegeben. Neinte: Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette ist ideal zum Übertragen der Tröpfchen Emulsionen. Langsam und sanft Aspiration von Tröpfchen wird empfohlen, Tropfenscher bei der Übertragung zu minimieren. </li><li> Verschließen Sie die PCR-Platte mit Folie sofort nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Verwenden durchstechbare Folie Platte Dichtungen, die mit dem PCR Abklebefolie und den Nadeln in der Tröpfchen Reader kompatibel sind. Folgen Sie den Anweisungen in der PCR-Plattenversiegelung Gebrauchsanleitung. </li><li> Stellen Sie die Plattenversiegelung Temperatur bis 180 ° C und die Zeit, um 5 Sek. </li><li> Tippen Sie auf den Pfeil, um das Fach Tür zu öffnen. Positionieren Sie den Trägerblock auf dem Tablett mit dem 96-Loch-Seite nach oben. Legen Sie die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock und sicherzustellen, dass alle Plattenvertiefungen werden mit dem Trägerblock ausgerichtet ist. </li><li> Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit 1 Blatt durchstechbare Foliendichtung. Sobald die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock befestigt ist und mit dem durchstechbaren Siegelfolie abgedeckt, berühren Sie die Dichtung Taste. Die Schublade wird geschlossenund Heißsiegeln wird zu initiieren. </li><li> Beim Heißsiegeln abgeschlossen ist, öffnet sich die Tür automatisch; entfernen Sie die Platte aus dem Wärmeblock für Temperaturwechsel und dann den Wärmeblock. </li><li> Sicherstellen, dass alle Vertiefungen in der Platte werden durch Überprüfen, dass Vertiefungen in der Folie gibt über jedem offensichtlich gut abgedichtet. Einmal versiegelt ist die Platte bereit für thermische Zyklen. </li><li> Sobald Tröpfchen entfernt werden, drücken Sie die Verriegelungen an den Patronenhalter, um sie zu öffnen. Entfernen Sie die leere Kartusche und entsorgen Sie sie. </li><li> Führen herkömmliche PCR-Amplifikation durch Befolgen der in Tabelle 2 beschriebenen Parametern. </li></ol> 2.3 Droplet Lesung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Anmerkung: Nach der PCR-Amplifikation der Zielnukleinsäure in den Tröpfchen, analysiert die Tröpfchenleser Instrument jedes Tröpfchen einzeln mit einem 2-Farbdetektionssystem 13. Wir in der Regel eingestellt, um eine FAM erkennend VIC Reporter Fluorophore. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;System spülen&quot; prime die Tröpfchen Leser und machen sie bereit für ddPCR Analyse. </li><li> Legen Sie die Platte in die Tröpfchen Leser und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Tröpfchen Leser saugt jede Probe, die vereinzelt Tropfen und Ströme sie im Gänsemarsch vorbei an einer 2-Farben-Detektor. Der Detektor liest die Tröpfchen auf positive und negative Proben aufzuzählen. </li><li> Wenn Tröpfchen Lesen abgeschlossen ist, die Tür öffnen und die Plattenhalter aus dem Gerät zu entfernen. Entfernen Sie den 96-Well-PCR-Platte aus der Halterung und entsorgen Sie sie. </li><li> Für eine ordnungsgemäße Wartung, ersetzen Sie die Tröpfchen Leser Öl und leeren Sie den Abfallbehälter nach Bedarf. In 50 ml 10% Bleichmittel auf die Abfallflasche, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. </li></ol> 2.4 DNA-Mutation Profilierung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Hinweis: PCR-positiv und PCR-negative Tröpfchen werden gezählt, um absolute quantific liefernation von Ziel BRAF V600E DNA-Mutationen in digitaler Form unter Verwendung der Datenanalyse-Software. <ol><li> Klicken Sie auf Setup, um Informationen über die Proben, Tests und Experimente geben. </li><li> Im Setup-Fenster, laden Sie eine Platte (filename.qlp), klicken Sie dann auf Analysieren Sie zu öffnen und die Daten analysieren. Ergebnisse Tabelle, Well Selector und verarbeiteten Daten / Grafische Darstellung: Die Analyse der Daten-Schnittstelle ist in drei Fenster getrennt. </li><li> In der verarbeiteten Daten-Fenster, Konzentrationsdaten für jedes Ziel werden in den Vertiefungen in der Platte Karte und werden in der Ergebnistabelle aufgeführt. Klicken Konzentration, um Daten in der Konzentration Plots visualisieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim und Junge Deug Kim sind Mitarbeiter von ABION CRO.

Hier beleuchten wir die Anwendbarkeit der ddPCR und DNA-Isolierung aus FFPE Referenzstandard Zelllinie Proben für eine bestimmte Genmutation Beurteilung. In dieser Studie wird TPS automatischen DNA-Isolierungsverfahren verwendet werden, der leicht angepasst werden kann, automatisiert, und kann bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig unterzubringen, so dass für größeren Maßstab Experimente und niedrigere Variabilität. Eine der Beschränkungen der DNA-Isolierung in der vorliegenden Arbeit ist, dass jedes FFPE Pro...

Die Akkumulation von genetischen Mutationen in regulatorischen Schlüsselgenen verändert normalen Zellprogrammierung wie Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben, die zu Krebs führen. 1 Die RAS-RAF-MAP-Kinase-Weg vermittelt zellulären Reaktionen auf Wachstumssignale. Onkogenen BRAF-Mutationen können vom Fahrer Mutationen des BRAF-Gens, der die BRAF oncoprotein verursachen können überaktiven 2 zu werden, zur Folge haben. Mutationen im BRAF-Gen auch in überaktiven nachgeschalteten Signal über MEK und ERK 3, die wiederum führt zu einer übermäßigen Zellwachstum und -proliferation unabhängig Wachstumsfaktor-vermittelten Regulation 4-6 führen. Mehrere Werkzeuge sind für die DNA-Mutation Profilierung zur Verfügung, wie quantitative Echtzeit-BRAF-V600E-Mutationen in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien durch ddPCR. ddPCR ist eine PCR-basierte Methode zur absoluten Quantifizierungbietet eine höhere Genauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) 7,8. ddPCR auch höheren Auflösungsvermögen und die Genauigkeit für die Detektion von seltenen Mutationen in DNA-Matrizen, so dass mehr informative Krebsforschung und Diagnose 9. Weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen ddPCR qPCR sind seine verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit bei der Untersuchung niedrigen Vorlage Kopienzahlen 10-12. Hierin ist ein Protokoll für die automatische Extraktion von DNA aus FFPE Referenzstandard Zellinien, gefolgt von der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Mutationen durch BRAF V600E ddPCR demonstriert. Die Verwendung von Software für die Datenanalyse und eine grafische Darstellung der Ergebnisse werden ebenfalls beschrieben. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und hängt von der Anzahl von Proben, die profiliert werden und die Anzahl der konventionellen PCR und ddPCR Maschinen erhältlich völlig. Das folgende Protokoll beschreibt Standardverfahren für die BR<html> AF V600E-positive FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) in einem vollautomatischen Instrument mit Hilfe des Tissue Preparation System (TPS) Protokoll. Anschließend werden isolierte DNA-Proben auf die Anwesenheit von Mutationen unter Verwendung BRAF V600E ddPCR System analysiert. Gezielte Mutation Analyse durchgeführt wird, nachdem alle Proben profiliert und die Daten in der Datenanalyse-Software geladen ist. Abhängig von der Anzahl der Proben / Gruppen untersucht, Datenanalyse kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern. Die experimentelle Komponente der Methodik erfordert Genauigkeit bei der Handhabung <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isolierung von Nukleinsäuren aus Hefe, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext-RNA">DNA</a> undlogischer Pipetten und Pipetten, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext Pipettieren &quot;&gt; Pipettieren in 96-Well-Platten, während der Datenanalyse wird unter Verwendung von Software.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Für unsere ddPCR Analyse, untersuchten wir die BRAF-V600E-Mutation FFPE Referenz-Standard-Zelllinien. Die Tröpfchen Leser verbindet sich mit einem Laptop-Computer mit Datenanalyse-Software. Jeder einzelne Tropfen wird auf der Basis der Fluoreszenzamplitude als entweder positiv oder negativ definiert. Die vom Hersteller bereitgestellten Software ermöglicht außerdem ein benutzerdefinierter Grenz eingegeben werden, um den Grenzbereich zwischen der positiven und negativen Tröpfchen zu definieren. Die Anzahl de...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

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Biology

13.1K Aufrufe.  Seoul National University.  Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben. 

Serie: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Forschung

Biologie

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...