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Ethik Statement: Alle Tests von menschlichen Proben wurden durchgeführt, nachdem Institutional Review Board (IRB) die Genehmigung zu erhalten. 1. DNA Extraktion aus FFPE Tissue, peripherem Blut und Knochenmark-Aspirat <ol><li> Für FFPE Gewebe Knochenmark mit DNA-Extraktions-Kits FFPE <ol><li> Beginne mit FFPE Geweben von ungefärbten Folien (von 5 bis 10 Abschnitte mit einem 5 - 10 um Dicke). HINWEIS: Bei Beginn mit Gewebespänen verwenden 3 bis 6 Abschnitte mit einer 5 - 10 um Dicke und überspringt zu Schritt 1.1.6. </li><li> Legen Sie Folien in einer Dia-Korb und bereiten vier Waschwasserbecken (zwei für Xylen und zwei für 100% Alkohol). In jeden Korb ein Mindestvolumen von 600 ml Lösung. </li><li> Deparaffinisieren die Folien durch in der ersten Schale 5 min Xylol waschen zu tun. Die Objektträger in der zweiten Xylol Spülwanne für weitere 5 min. </li><li> Nach Entparaffinierung, waschen Sie die Folien mit 100% Alkohol 5 min. Die Objektträger in der zweitenAlkohol Spülwanne für weitere 5 min. </li><li> Lassen Sie die Folien vor dem Abschaben sie mit einer Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen vollständig unter einer Abzugshaube trocknen. HINWEIS: Wenn ein H &amp; E Schlitten mit Tumorregion angegeben zur Verfügung steht, die Folien ausrichten und nur die Tumorregion kratzen. </li><li> Gehen Sie mit den Anweisungen des Herstellers Handout im Bausatz enthalten. </li></ol></li><li> Für BM absaugen und peripherem Blut <ol><li> Extrahieren Sie nach den Anweisungen des Herstellers Handout mit diesen Spezifikationen. HINWEIS: Es gibt zahlreiche im Handel erhältliche Kits und Verfahren zur DNA-Extraktion aus FFPE Geweben und Zellen. Praktisch können alle verwendet werden. Verwendet ein Verfahren, das im Labor hergestellt wird. <ol><li> Verwenden 200 &amp; mgr; l peripheres Blut (PB) oder 100 ul BM + 100 &amp; mgr; l PBS. </li><li> Verwenden Sie 4 &amp; mgr; l RNase A-Stammlösung. </li><li> Eluieren mit 100 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li></ol></li></ol></li><li> DNA-Quantifizierung<ol><li> Messung von DNA-Konzentrationen unter Verwendung einen Spektralphotometers ein 260 nm / 280 nm-Verhältnis von etwa 1,8 (bei reiner DNA) zu gewährleisten. Wenn das Verhältnis wesentlich niedriger ist, kann sie die Anwesenheit von Protein, Phenol oder anderen Verunreinigungen zeigen, die mit Downstream-Anwendungen stören können. </li><li> Justieren DNA-Konzentrationen auf etwa 50 bis 100 ng / &amp; mgr; L mit dem entsprechenden Elutionspuffer. </li></ol></li></ol> 2. Wildtyp-PCR-Blocking <ol><li> Primer-Design <ol><li> Design und erhalten Primer für die Gene von Interesse nach zuvor beschriebenen allgemeinen Richtlinien des PCR - Primer - Designs 13. Fügen Sie M13-Vorwärts- und Rückwärts-Universal-Sequenzierungs-Primer in PCR-Primer. HINWEIS: Der Assay MYD88 Exon 5 von MYD88 zu amplifizieren entwickelt (G259 - N291) und 110 in der 5&#39; befindet Nukleotide intronischen Region, die die Spleißstelle und ein Teil von Intron 4 zu bedecken die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden entwickelt, um mit einem 5&#39; -M13-Sequenz (M13-forward: tgt aaa ACG ACG GCC AGT; M13-Rückwärts: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) für das Annealing von komplementären Sequenzierungsprimern (siehe Materialien Table) zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Locked Nucleic Acids Oligonukleotid-Entwurf <ol><li> Entwerfen des blockierende Oligonukleotid etwa 10 bis - 15 Basen lang und komplementär zu der WT-Vorlage, wo mutanten Anreicherung gewünscht wird. HINWEIS: Eine kürzere Oligo wird Mismatchdiskriminierung verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel zu verwenden, blockiert Nukleotiden, da diese in einem sehr „klebrig“ Oligonukleotid führen kann. Der Inhalt und die Länge und die blockierende Nucleotid sollte entsprechend der spezifischen Nukleotid optimieren werden, die blockiert werden müssen. Es ist wichtig, eine hohe Bindungsspezifität zu erreichen, ohne Sekundärstruktur zu beeinträchtigen und Selbst Komplementarität zu riskieren. </li><li> Entwerfen der blockierenden Oligo eine T m 10 haben - 15 ° C über der Verlängerung temperature während Thermozyklisierung. Stellen Sie die T m durch Hinzufügen oder Entfernen von blockierenden Basen oder durch Basen für die DNA - Blockierung bei gleichzeitiger Vermeidung lange Strecken Einsetzen von (3 bis 4 Basen) des Blockierens G oder C - Basen. <ol><li> Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Tm Prediction“ -Tool. </li><li> Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die „Oligo Sequence“ abgeblockt wird. Add „+“ vor Basen-Blocker Basen anzuzeigen. </li><li> Wählen Sie den „Berechnen“ , um die ungefähre Tm der DNA-Blocker - Hybrid zu bestimmen. </li></ol></li><li> Entwerfen Sie die Blockierung Oligo Sekundärstrukturbildung oder Selbst Dimere zu vermeiden. <ol><li> Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Optimizer“ -Tool. </li><li> Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die Box blockiert werden. Add „+“ vor Basen blockiert Basen anzuzeigen. </li><li> Wählen Sie die beiden Boxen für „Sekundärstruktur“ und „Nur selbst“. Drücken Sie die Taste, um die Analyse Oligo für potenziell störende Nebenstrukturen oder Selbst Dimere zu überprüfen. HINWEIS: Die Noten repräsentieren sehr grobe Schätzungen der T m ‚s der Sekundärstrukturen und Selbst Dimere. Niedrigere Werte sind daher optimal und können durch eine Begrenzung Blocker-Blocker Paarung erreicht werden. Die Blockierungs-Oligonucleotid für MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262-I266 zu bedecken und verfügt über ein 3&#39;-invertierten dT sowohl Verlängerung durch DNA-Polymerase und Abbau durch 3&#39;-Exonuclease zu hemmen. Diese spezifische blockierende oligo ist ein 17-mer mit 10 blockierenden Basen, die als „+ N“ bezeichnet sind. Die verbleibenden 7 Basen sind gewöhnliche DNA-Nucleotide. </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCR-Setup und Thermocycling <ol><li> Bereiten Sie einen WTB-PCR Master mix (MMX) 2,5 &amp; mgr; l PCR - Reaktionspuffer 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 &amp; mgr; M dNTPs, 0,2 &amp; mgr; M Vorwärts und Rückwärtsprimer, 1.2 uM MYD88blocker und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige zu schaffen unter Verwendung von Lösungsvolumen von 21,75 &amp; mgr; l pro Reaktion. HINWEIS: Die Arbeitskonzentrationen sind für die endgültigen Reaktionsvolumen von 25 &amp; mgr; l (nach der Zugabe von DNA-Matrize und Polymerase). Herkömmliche PCR MMX wird durch einfaches Weglassen der Zugabe von Blocker hergestellt. Alle Protokollschritte bleiben identisch für beide WTB und konventionelle PCR. Dies kann bei der Validierung und Bestimmung Anreicherung durch Zugabe von Blocker erreicht werden. <ol><li> Wenn die Menge der MMX Berechnung vorzubereiten für 3 zusätzliche Reaktionen (positive und negative Kontrollen und eine nicht-Kontrolle zu überprüfen, für die Kontamination) und zumindest 1 weitere Reaktion zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen, stellen Sie sicher. </li></ol></li><li> Vortex MMX gründlich. Die MMX kann bei -80 ° C gelagert werden bis ayOhr. </li><li> Zugabe von 0,25 &amp; mgr; l Taq DNA-Polymerase pro Reaktion auf den MMX und Invertzucker zu mischen. Sobald die Polymerase an die MMX hinzugefügt wurde, halten Sie es auf Eis. </li><li> Legen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte auf einer kalten Platte und Pipette 22 ul MMX mit Polymerase zu jeder Well Reaktion. </li><li> Fügen 3 ul genomische DNA (50 bis 100 ng / &amp; mgr; l zu jedem der Vertiefungen mit dem MMX-Polymerase enthalten. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler. <ol><li> Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die WTB-PCR-Reaktion wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 6 min; 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Primer-Annealing bei 56 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min 20 s; letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min. HINWEIS: Beste Praxis beinhaltet in einem räumlich getrennten Bereich, den Rest des Protokolls abgeschlossen Amplikonkontamination zu vermeiden in Zukunft Setups. </li></ol></li></ol></li><li> Perform - Gelelektrophorese nach vorher beschriebenen Protokollen 14, um zu bestimmen , ob WTB-PCR erfolgreich war , und einen Mangel an Verstärkung in dem nicht-Templat zu bestätigen. </li><li> Aufreinigung von PCR-Produkt von magnetischen Kügelchen <ol><li> Entfernen magnetische Kügelchen von 4 ° C und bringt auf Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie 10 &amp; mgr; l PCR-Produkt zu einer neuen PCR-Platte. </li><li> Vortex kräftig die magnetischen Kügelchen vollständig die magnetischen Partikel resuspendieren. </li><li> In 18 ul magnetische Kügelchen zu jeder Vertiefung auf die neue Platte. Pipette 10 Mal mischen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Platzieren Sie die PCR-Platte auf der Seite Röcke Magnetplatte für 2 Minuten zur Trennung Perlen aus der Lösung. </li><li> Den Überstand aspirieren mit einer Mehrkanalpipette, um den Wulst Pellet zu vermeiden. </li><li> Dispense 150 &amp; mgr; l 70% Ethanol in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur for mindestens 30 s. Saugen Sie das Ethanol mit einer Mehrkanalpipette und Tipps verwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal. </li><li> Unter Verwendung einer 20 &amp; mgr; l Mehrkanalpipette die verbleibende Ethanol aus jeder Vertiefung verworfen und Spitzen abzusaugen. </li><li> Sobald Vertiefungen trocken (~ 10 min) sind, von der Magnetplatte zu entfernen, und 40 &amp; mgr; l Nuklease freies Wasser zu jeder Vertiefung und Pipettenmischung 15-mal oder vortex sanft hinzuzufügen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Platzieren Sie die PCR-Platte auf Magnetplatte für 1 min auf getrennte Perlen aus der Lösung. </li><li> Transfer 35 ul gereinigtes Produkt eine neue PCR-Platte. Dies ist gereinigte PCR-Produkt nun bereit ist, mit bidirektionaler Sequenzierung, um fortzufahren oder können, bis sie benötigt bei -20 ° C gelagert werden. HINWEIS: Wenn Sie einen neuen Test zu entwickeln, die Quantifizierung des gereinigten PCR-Produkts erforderlich. Von 1 bis 3 ng / &amp; mgr; l DNA-Amplikon ist optimal für die bidirektionale Sequenzierung. Wenn Konzentration konstant niedrig ist, erhöht PCR-Produkt und magnetische Kügelchen proportional (1: 1.8). Wenn Konzentration konstant hoch ist, mit einem größeren Volumen Wasser eluieren. </li></ol></li></ol> 3. Sequenzierung des WTB-PCR-Produkt <ol><li> Bidirektionale Sequenzierung HINWEIS: Das folgende Protokoll eine modifizierte Form der Anweisungen des Herstellers, die optimiert wurde weniger Reagenzien zu verwenden. <ol><li> Bereiten Vorwärts- und Rückwärts - Sequenzierungsreaktion vermischt sich mit 0,25 &amp; mgr; l Ready Reaction Mix, 1,88 &amp; mgr; l Sequenzierungspuffer, 1,78 &amp; mgr; M M13-F oder M13-R - Sequenzierungsprimer und fügen und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige Lösung zu schaffen Volumen von 9 &amp; mgr; l pro Reaktion. Diese Sequenzierung Reaktionsmischung kann bis zu einem Jahr bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Pipette 9 ul der Vorwärts-Sequenzierungsreaktionsmischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte für die Vorwärtssequenzierungsreaktion. Wiederholen Sie auf einer separaten Platte für die Rückwärtssequenzierungsreaktion. </li><li> 1 &amp; mgr; l des gereinigten WTB-PCR-Produkt to jede Vertiefung auf sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Platten. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler. <ol><li> Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die Sequenzierungsreaktion wie folgt: 96 ° C für 1 min; 30 Zyklen von 96 ° C für 10 s, 50 ° C für 5 s, 60 ° C für 4 min; zur Reinigung bei 4 ° C, bis sie bereit halten. </li></ol></li></ol></li><li> Reinige Sequenzierungsprodukte <ol><li> Eine frische Lösung von 01.25 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% igem Ethanol. </li><li> Bereiten Sie eine frische 70% Ethanollösung. </li><li> Zugabe von 30 &amp; mgr; l Natriumacetat / 100% Ethanol-Lösung zu jeder Vertiefung sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsplatten und Pipetten Mischung 5 mal. </li><li> die Platte wieder zu verschließen und für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 2.250 xg für 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Abklebefolie und invertieren über einen AbfallContainer. HINWEIS: Invert nur einmal oder das Pellet aus den Vertiefungsböden lösen kann. </li><li> Legen Sie die umgedrehte Platte auf einem sauberen Papiertuch und Zentrifuge bei 150 × g für 1 min. </li><li> In 150 &amp; mgr; l 70% Ethanol zu jeder Vertiefung. </li><li> Reseal die Platte und Spin bei 2.250 × g für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7. </li><li> Wenn die Vertiefungen nicht vollständig trocken sind, damit sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Proben vor Licht geschützt werden, während Trocknen. </li><li> In 10 &amp; mgr; l Formamid in jede Vertiefung und Pipette Mix 10-mal. Reseal die Platte. </li><li> Denaturieren auf Thermocycler bei 95 ° C für 3 min um 4 ° C für 5 min. </li><li> Nach Denaturieren Ersetzen auf Sequenzierung Plattform die Plattenversiegelung mit Septen und Sequenz gemäß den Anweisungen des Herstellers 15. </li></ol></li></ol> 4. Analyse der Sequenzierungsergebnisse <ol><li> Visualisieren Sequenzierung Spuren eine Sequenzierung dat miteine Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers 16 und zu den jeweiligen Referenzsequenzen auszurichten. Richten MYD88 zu NCBI Referenzsequenz „NM_002468“. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+a+primer+at+a+mutation:+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA.">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li><li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+Testing+Shows+Multiclonal+Mutations+in+Patients+with+CLL+Treated+with+BTK+Inhibitor+and+Lack+of+Mutations+in+Ibrutinib-Naive+Patients.">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die WTB-PCR - Assay beschrieben hier verwendet einen generischen Satz von Primern mit einem blockierenden Oligo während des Ausfahrens (Figur 1) zu blockieren Amplifikation von WT DNA konstruiert. Das WTB-PCR-Produkt wird dann für Mutationsanalyse sequenziert. Die Nützlichkeit der WTB-PCR / Sanger liegt in seiner Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und hohen Durchsatz. Mit den hier beschriebenen Richtlinien, die meisten bestehenden Sanger basierte Assays können einfach über die Zugabe eines blockiere...

Sanger-Sequenzierung ist traditionell der Goldstandard in der Erkennung von bekannten und unbekannten somatischen Mutationen. Eine der Einschränkungen der Sanger - Sequenzierung ist die Nachweisgrenze (~ 10 - 20% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT) 1. Dieses Maß an Empfindlichkeit ungeeignet ist für geringe somatische Mutationen erfassen, die in Proben von Geweben oder prämalignen Patienten mit wenigen zirkulierenden Tumorzellen vorhanden sein können, oder, wenn Knochenmark (BM) sind lückenhaft. Dies macht auch Resterkrankung nach der Therapie oder zum Nachweis von Schwellenresistenzmutationen während der Therapie schwierig durch konventionelle Sequenzierung allein 2 zu beurteilen. Durch Ersetzen der konventionelle PCR mit verschlossenen Nukleinsäure (LNA) -vermittelten Wildtyp - blockierende PCR (WTB-PCR) in Sanger - Sequenzierung, Empfindlichkeiten von bis zu 0,1% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT 2, 3, 4 erreicht werden. ImWTB-PCR, Anreicherung für mutante Allele wird über die Zugabe eines kurzen erreicht (~ 10 bis 14 NT) Blocking (LNA) Oligonukleotid, das bevorzugt an WT DNA wodurch verhindert Amplifikation von WT DNA bindet. Die Mutante angereicherte WTB-PCR-Produkt kann dann sequenziert werden. WT DNA anstelle der Auswahl für spezifische Mutationen WTB-PCR ermöglicht die Anreicherung von bekannten und unbekannten Mutationen in winzigen Zellfraktionen durch die Blockierung. Mehrere Verfahren sind zum Nachweis von Mutationen in kleinen Zellen Fraktionen derzeit verwendet. Dazu gehören allelspezifische PCR Amplifikation-Refractory Mutation System (ARMS), denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Perlen, Emulsionen, Amplifikation und Magnetics (beaming), elektrisches Feld induzierte Freisetzung und Messung (Efirm), hochauflösende Schmelzpunkt und andere. Allerdings sind die meisten dieser Methoden begrenzt durch falsch-positive und die Fähigkeit, nur eine Mutation nachzuweisen , dass der Assay entwickelt wurde 4 </sup&gt;. WTB-PCR, jedoch ermöglicht es dem Benutzer Sequenzierungsspuren sichtbar zu machen, die den Nachweis mehrerer Mutationstypen ermöglicht und in auszuschließen Fehlalarme aufgrund Artefakte oder Desaminierung Ereignisse helfen können. Next-Generation-Sequencing (NGS) eine geeignete Alternative zu herkömmlicher Sequenzierung bieten kann jedoch wesentlich höher Kosten, Komplexität und mehr Testzeit machen ihnen eine unnötige Option für viele Krankheitstypen mit wenige verschiedenen molekularen Marker oder zur Überwachung von Patienten auf Therapie für die Schwellen Resistenzmutationen. Weiterhin hohe falsch positive Raten bei der Erkennung Varianten mit mutanten Allel - Häufigkeiten von weniger als 5% können ein Problem für Amplicon-Basis darstellen NGS 5, 6. Hier zeigen wir die Steigerung der Empfindlichkeit erreicht durch WTB-PCR in Screening auf Mutationen in dem myeloischen Differenzierungsfaktor 88 - Gen , wie durch Albitar et al. 3 MYD88 mutations sind wichtige diagnostische und prognostische Faktoren in Morbus Waldenström (WM), IgM monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (IgM-MGUS), Milz- Randzone Lymphom (SMZL) und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL). MYD88 Mutationen sind in fast allen Fällen von WM und etwa 50% der Patienten mit Immunoglobulin M (IgM) -sezernierenden MGUS gefunden. Im Gegensatz dazu sind MYD88 Mutationen in nur 0-6% der Patienten mit SMZL und fehlt bei multiplem Myelom 7, 8 gefunden. Da überlappende morphologischen, immunphänotypische, zytogenetischen und klinische Charakteristika zwischen WM und SMZL oder IgM-multiplem Myelom häufig Differentialdiagnosen können, das Vorhandensein einer Mutation MYD88 komplizieren kann als nützlich identifiziert Faktor 9 dienen. MYD88 Mutationen auch mit einem größeren Krankheitsbelastung bei Patienten mit DLBCL und schlechter Gesamtüberlebenszeit nach der Therapie 7, in Verbindung gebracht worden </sup&gt; 10. Darüber hinaus, da MYD88 Mutationen sind häufiger in aktivierten B-Zell-like (ABC) DLBCL als Keimzentrum-B-Zell-like (GCB) DLBCL oder primärer mediastinalen B-Zell-Lymphom (PMBL), MYD88 Mutationsstatus als dienen kann gefunden Surrogatmarker für das ABC - Subtyp 11, 12. Das detaillierte Protokoll hier zur Verfügung gestellten dient als Vorlage, aus denen neue Tests entwickelt werden können, oder die meisten bestehenden Sequenzierung Assays können leicht genau angepasst werden, um Niederfrequenz Mutationen in verschiedenen Probentypen zu erkennen. Der Ansatz kann auch zur Überwachung und Erfassung resistente Mutationen verwendet werden, die in Tumoren oder sogar Bakterien entwickeln können, die sie entwickeln kann, während Patienten mit gezielter Therapie oder Antibiotika behandelt werden. Darüber hinaus richtet sie und Abhilfen viele der Probleme mit der Mutation Anreicherung verbunden sind, insbesondere in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe in Formalin fixiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730XL sequencer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>For magnetic bead PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sealing foils</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>For PCR and cold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4337455</td>
			<td>For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 Series</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate for 96 well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (100mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>For use in PCR Purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiqon website Oligo Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12032937001</td>
			<td>With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>180134</td>
			<td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di Formamide</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4311320</td>
			<td>For sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNA oligonucleotide</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>500100</td>
			<td>5&#39;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-F Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-R Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E950030020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Model 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reverse primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3107-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate septa, 96 well</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>For BM aspirate and peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqScape Sortware v3.0</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4474978</td>
			<td>For sequencing analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3M, pH 5.2)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtered pipette tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>~1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td>Histology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

Eine genaue Erfassung und Identifizierung von Niederfrequenzmutationen können problematisch sein, wenn Resterkrankung nach der Therapie die Beurteilung, Screening für neue Resistenzmutationen während der Therapie, oder wenn die Patienten haben wenige zirkulierende Tumorzellen. Wildtyp durch Sequenzanalyse gefolgt PCR Blockierung bietet eine hohe Empfindlichkeit, Flexibilität und Einfachheit als Methode, diese niedrigen Frequenz Mutationen zu detektieren. Durch das Hinzufügen eines benutzerdefinierten Nukleinsäure-Oligonukleotid an ein neuen oder zuvor etablierten konventionellen PCR basierten Sequenzierungsassay entworfen verriegelte, Empfindlichkeiten von etwa 1 mutanten Allels in einem Hintergrund von 1000 WT Allele (: 1000 1) erreicht werden. Sequenzierungsartefakten im Zusammenhang mit Ereignissen Desaminierung üblicherweise in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Geweben teilweise durch die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase während Extraktionsschritte behoben werden kann. Das optimierte Protokoll hier ist spezifisch zum Nachweis MYD88 Mutation, sondern kann als Vorlage dient jeden entwerfenWTB-PCR-Assays. Die Vorteile des WTB-PCR-Test gegenüber anderen häufig verwendeten Tests zum Nachweis von niedrigen Frequenz Mutationen einschließlich Allel-spezifische PCR und quantitative Echtzeit-PCR weniger Vorkommen von Fehlalarmen sind, eine größere Flexibilität und eine einfache Implementierung und die Fähigkeit zu erkennen, sowohl bekannte als und unbekannte Mutationen.

Eine konzeptionelle Übersicht über WTB-PCR während der Extension ist in Abbildung 1 dargestellt. Da eine einzelne Nukleotid Fehlpaarung in dem Blocker-DNA - Hybrid seine Schmelztemperatur stark abnimmt (&amp; Delta; T m = 20 - 30 ° C), die Amplifikation des WT Allel blockiert wird , während mutieren Template - DNA frei ist Verlängerung abzuschließen 17. Auf diese Weise wird mutierte DNA amplifiziert exponentiell während WT DNA l...

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Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Aufrufe.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Serie: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

Optimierung zur Sequenzierung und Analyse degradierter FFPE-RNA-Proben

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen