This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

Hinweis: Dieses Protokoll betont die Verwendung von FRET Durchflusszytometrie zur Erfassung Seeding-Aktivität von Maus-biologischen Proben. Es ist auch mit rekombinanten Fibrillen und menschlichen biologischen Proben kompatibel. Maus Euthanasie und Gehirn der Ernte wurde in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Verfahren durchgeführt. 1. Gehirn Extraction <ol><li> Nach tiefe Betäubung mit Isofluran (2%), durchströmen eine Maus mit eiskaltem PBS, die 0,03% Heparin, und extrahieren Sie die Gehirn nach den in Gage et al Details. 18 </li><li> Zeigen extrahierten Gewebe in einem Kryo-Fläschchen, und Snap freeze indem in flüssigem Stickstoff. Alternativ einfrieren Gewebe auf Trockeneis. Wenn sie gefroren ist, übertragen Gewebe auf -80 ° C und Speicherung für eine längere Zeitspanne, falls erforderlich. Hinweis: Dieses Protokoll ist mit ganzen Hirnhomogenaten oder Mikro seziert Hirnregionen kompatibel. Siehe Hagihara et al. Für eine detaillierte Mikrodissektion Protokoll 19. </li></ol&gt; 2. Herstellung von Biological Impfmaterial <ol><li> Bereiten Homogenisierungspuffer durch Auflösen von Protease-Inhibitoren (EDTA frei) in 1x TBS (1 Tablette pro 10 ml). Vortex kräftig, und speichern Sie auf dem Eis. Protease-Inhibitoren muss EDTA kostenlos um Biosensor Zelllebensfähigkeit zu bewahren. </li><li> Wiegen gefrorenen Hirngewebe in einer Wegwerf wiegen Boot, und in ein 5 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen eiskaltem Homogenisierungspuffer so daß die endgültige Lösung 10% Gewicht / Volumen. Temporäre Speicherung auf Eis. Gewebemasse und anschließende Homogenisation Puffervolumen wird in Abhängigkeit von der Größe des Gehirns und / oder Regionen variieren. Hier wird ein erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von 0,2 g hemibrain in 2 ml einer 10% w / vol Lösung suspendiert. </li><li> Transfer von Proben in einem kalten Raum, und stellen Sie eine Ultraschallsonde, um den entsprechenden Einstellungen. Für Sondenbeschallung mit einem Omni Ruptor (hier abgebildet) stellen Sie den Haupt zu 20%, was etwa 75 W. Verwenden Sie eine Impuls-Modus entspricht, um sicherzustellen, Proben nicht ovwährend der Beschallung er-erhitzt. Stellen Sie den Impulsgeber zu 30%, entsprechend ca. 500 msec. </li><li> Reinigen Sie die Spitze der Ultraschallsonde durch Spülen mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder, Abwischen der Sonde zwischen jeder Lösung. Achten Sie darauf, spülen Sie und wischen Sie sowohl die Seiten und der Boden der Sonde mit Lab-Wischtücher. </li><li> Arbeiten mit einer Probe zu einer Zeit, tauchen Sie die Sondenspitze in die Homogenisierungspuffer, und starten Sie das Ultraschallgerät. Verwendung der oben beschriebenen Kraft und Impulsgeber Einstellungen liefern insgesamt 25 Impulse. Stellen Sie sicher, dass Gewebe ist völlig in der Schwebe. Seien Sie vorsichtig, um das Schäumen der Probe in diesem Schritt zu vermeiden. HINWEIS: Die Proben sind anfällig für schäumende, wenn a) die Gesamtlautstärke ist gering, oder b) das Homogenat erwärmt. Mit dieser spezifischen Instruments, nicht mit einem Volumen von weniger als 250 &amp; mgr; l zu beschallen. Um sicherzustellen, Proben bleiben gekühlt, können Röhrchen auf Eis bei diesem Schritt gespeichert werden. </li><li> Reinigen Sie die Sonde durch Wischen entfernt restliche Lysat, liefern dann 10 Impulse in einen Becher of sauberes Wasser. Die Seiten und der Boden der Sonde mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder ausspülen (wie in Schritt 2.4), Wisch Trocknen zwischen jedem Schritt. Um Verunreinigungen zu vermeiden, spülen Sie die Sonde in zwischen den Proben. HINWEIS: Tau-Aggregaten, haben wir gefunden, daß strengere Reinigungsverfahren zur Verhinderung von Probe zu Probe Kontamination erforderlich sind. Andere Amyloide können jedoch zusätzliche Pflege, die wurde ausgiebig in der Literatur beschrieben 20,21 erforderlich. </li><li> Speicher Homogenate auf Eis, bis alle Proben verarbeitet worden sind. </li><li> Spin Homogenate bei 21.300 · g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand in einem sauberen Rohr, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. Aliquots des Überstands und Speichern Lysate bei -80ºC zur weiteren Verwendung. Vermeiden Einfrieren / Auftauen der Homogenate jedoch, wie dies reduziert Impfeffizienz. </li></ol> 3. Replattierung Biosensor-Zellen HINWEIS:Verwenden Sie vier Zelllinien für diesen Test: HEK 293T (Zelllinie # 1), RD-P301S-CFP (Zelllinie # 2), RD-P301S-YFP (Zelllinie # 3) und RD-P301S-CFP / YFP ( Zelllinie # 4). Beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die Beiträge der einzelnen Zelllinie auf den Test. <ol><li> In einer sterilen Umgebung ansaugen Kulturmedium. Spülen Sie Zellen mit warmem PBS und absaugen. Trypsinize Zellen (3 ml Trypsin-EDTA (0,05%)) für 3 min, gequenscht mit warmem Kulturmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% Pen / Strep, 1% Glutamax), und Zellen, die unverzüglich in einen konischen Rohr. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Saugen Sie Medium, und resuspendieren Zellpellet in warmem Kulturmedium. </li><li> Verwendung eines Hämocytometer, bestimmen die Zelldichte für jede Zelllinie. Zelldichte in Abhängigkeit von Konfluenz zum Zeitpunkt der Ernte und Resuspensionsvolumen variieren. Die Zellen aus einer 10-cm-Schale mit 90% Konfluenz in 10 ml Medium geerntet, zur Zelldichte etwa 1 Millionen Zellen / ml liegen. </li><li> Machenein Master-Mix aus Zellen + Medium derart, dass jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen werden jeweils 35.000 Zellen in 130 ul Medium enthalten (beispielsweise um einen Master-Mix für 100 Vertiefungen bilden, Resuspendieren 3,5 Millionen Zellen in 13 ml Medium). Ändern Sie die Zellzahl auf einzelne Versuchspläne und Zeitpläne passen. Für Zellbehandlung ~ 18 Stunden nach dem Plattieren hinzufügen 35.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette langsam pipettieren 130 ul des Master-Mix Zellsuspension in jede Vertiefung einer flachen Boden, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte. Während Plattierung, legen Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Brunnens, den Boden der Platte berührt. Hinweis: Obwohl Plattieren Format kann geändert werden, so dass n = 4 Vertiefungen für jede der Zelllinien 1-3 pro Platte empfohlen. Der Rest der Platte (n = 84) für die Zelllinie # 4 (Biosensor-Zellen) vorbehalten. </li><li> Lassen Sie die Zellen, indem man die Platte ungestört für 10 Minuten bei RT zu begleichen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 und &amp;# 8805; 80% relative Luftfeuchtigkeit. </li></ol> 4. Behandlung von Zellen HINWEIS: Die folgenden Tages, als Tau-Biosensor-Zellen sind 60-65% konfluent, bereiten Samenübertragung Komplexe wie folgt: <ol><li> In einem Rohr, zu verbinden Transfektionsreagenz wie Lipofectamin mit serumreduzierten wie Opti-MEM, um einen Master-Mix zu machen. Pro Loch, fügen 1,25 ul Transfektionsreagenz und 8,75 &amp; mgr; verringert Serum Medien. Flick Rohr sanft zu mischen, kurz spin down, und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> In einem anderen Rohr, Drill Material (Aliquot des Lysats aus Schritt 2.9) mit reduziertem Serum Medien. HINWEIS: Volumen des Impfmaterials wird entsprechend der einzelnen Tests variieren. Bei der Auswahl der Samenvolumen, berücksichtigen: Fülle von Samen in einer Probe und potentielle Toxizität. Crude Homogenate können Zellen toxisch sein. Als solche, die niedrigste Lautstärke möglich, um die gewünschte Wirkung zu überwachen. Zuvor getesteten Mengen an Lysat / well Bereich from 1-5 &amp; mgr; l, das entspricht 5-20 &amp; mgr; g Gesamtprotein. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen pro Vertiefung (Samen + reduzierten Serum Medien) ist 10 &amp; mgr; l. </li><li> Kombinieren Sie Inhalte aus den beiden in 4.1 und 4.2, Flick beschrieben zum Mischen leicht Rohre, kurz Spin-Down (1000 · g, 5 sec), und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 20 min und bis zu 2 Std. </li><li> Vorsichtig pipettiert 20 ul Transduktionskomplex auf der Seite der einzelnen Biosensor Vertiefungen. Verwenden Sie drei technische Replikate, wenn möglich. Zurückzukehren behandelten Zellen in den Inkubator für 24-48 Std. Inkubiere unter denselben Bedingungen wie in Schritt 3.6 beschrieben. HINWEIS: Die entsprechenden Negativkontrolle Voraussetzung für diese Einstellung ist Biosensor-Zellen mit leeren Liposomen (dh Liposomreagenz + reduzierten Serummedien) behandelt, weil die Anwendung von Phospholipiden führt eine leichte Verschiebung in der Fluoreszenz-Profil in Bezug auf Zellen, um unbelichtete Liposomreagenz Biosensor. </li></ol> 5. Ernte Cells für FRET Durchflusszytometrie <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Vor Ernten der Zellen-Regel 24-48 Stunden nach der Behandlung ist es möglich, eine Vorab-Auslesen der Aussaat Aktivität zu erhalten unter Verwendung des GFP-Filter auf einem Standard-invertierten Fluoreszenzmikroskop. Zellen ohne Keimmaterial (dh leere Liposomen) behandelt werden diffuse Fluoreszenz zeigen, wohingegen Zellen, die mit Samenmaterial behandelt werden intensive punktförmige und netzartige intrazelluläre Einschlüsse (1A - B) zeigen. <ol><li> Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette absaugen alle Zellmedium (150 ul),. Trypsinieren (50 ul) Zellen für 5 min und Abschreckflüssigkeit mit 150 ul Kulturmedium gekühlt. Fügen Sie nicht einen PBS spülen, bevor in diesem Schritt Trypsinierung, denn es kann Zell Heben und anschließende Zellverlust führen. Keine verunreinigenden toten Zellen und Trümmer auszuschließen während Durchflusszytometrie über Gating-Strategien. </li><li> Unmittelbar nach dem Abschrecken, Transferzellen in eine 96-Well-Rundbodenplatte und Zentrifuge bei 1.000 × g für 5 min bei RT. </li><li> Absaugen und entsorgen Medium, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören. </li><li> Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 50 ul 2% Paraformaldehyd, und Inkubation für 10 min. Alternativ können Sie Zellen leben, obgleich Fixierung bietet saubere und konsistente Ergebnisse. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und entsorgen Paraformaldehyd, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören. </li><li> Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 200 ul gekühlt Durchflusszytometrie-Puffer (HBSS, 1% FBS 1 mM EDTA) und führen Sie die Platte so schnell wie möglich zu Zelle Verklumpung zu vermeiden. </li></ol> 6. FRET Durchflusszytometrie HINWEIS: Verwenden Sie ein Durchflusszytometer wie die MACSQuant VYB, die mit FRET-kompatiblen Laserlinien und Filtersätze (Tabelle 2) ausgestattet ist. Für jeden Schritt in diesem Abschnitt, klicken Sie auf die auch von Interesse unter Verwendung der Software 96-Loch-Vorlage, und klicken Sie auf&quot;Play&quot;, um Probenaufnahme und Durchfluss beginnen. Machen Grundstücke oder Statistiktabellen, indem Sie auf die &quot;neue Analysefenster&quot; -Symbol. Ändern Achsparameter auf einzelne bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter. Um Zellpopulationen oder Fluoreszenzsignale zu verschieben, erhöhen oder verringern die Spannungen mit den entsprechenden Filter zugeordnet ist. Mit diesem Instrument laufen &lt;1.000 Veranstaltungen / sec, um eine genaue Einzelzellenüberwachung zu gewährleisten. <ol><li> Machen Sie ein Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Umgebung (FSC-A) bivariate Grundstück und mit Zelllinie # 1 laufen, passen Sie die SSC und FSC-Spannungen bis die Zellpopulation in der linken unteren Quadranten. Klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug, und definieren die Zellpopulation (Tor P1). Für alle Gating-Parameter siehe Abbildung 2. </li><li> Machen Sie eine FSC-H (Höhe) vs FSC-A bivariate Grundstück und gelten Tor P1 zu dieser Handlung, indem Sie auf &quot;live&quot; über der Handlung, und die Auswahl P1. Mit Zelllinie # 1läuft, klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug und definieren Einzelzellen (Tor P2). </li><li> Machen 3 Histogramm Plot, eine für jeden der Filter von Interesse: CFP, YFP und FRET. Bewerben Tor P2, alle diese Grundstücke, indem Sie auf &quot;live&quot; über die Grundstücke und die Auswahl P2. Mit Zelllinie # 1 läuft, stellen Spannungen, so dass die mittlere Zellpopulation in der GFP, YFP, und FRET-Histogramme sind alle zwischen 0 und 1. Zum Messen GFP und FRET, erregt Zellen mit der 405 nm-Laser und Capture-Fluoreszenz mit ein 450/50 nm und 525/50 nm-Filter auf. Um zu messen, YFP, erregt Zellen mit einem 488 nm Laser-und Capture-Fluoreszenz mit einer 525/50-nm-Filter. Laser- und Filtereinstellungen sind ferner in Tabelle 2 beschrieben. </li><li> Führen Ausgleich für CFP Spillover in die FRET und YFP-Kanälen. HINWEIS: Kompensation ist der Prozess der Fluoreszenzstreuung Korrektur. Fluoreszenzstreuung tritt auf, wenn die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom innerhalb eines Filter desi detektiertengned zum Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen. Mit der richtigen Kompensation kann die GFP Spillover-Fluoreszenz der FRET und YFP Kanäle entfernt werden. HINWEIS: Kompensation erfordert die Anwesenheit von beiden Fluoreszenz-positiven und -negativen Zellen. Somit an GFP-positiven Zellen zu kompensieren (Zell-Linie # 2), negative Zellen (Zelllinie # 1) auf der Probe vor dem Durchlauf hinzugefügt. <ol><li> Spike in 30 ul Zelllinie # 1-Suspension aus einer Hand gut in 200 ul Zelllinie # 2 Suspension unmittelbar vor der Kompensation. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Geräteeinstellungen&quot; und dann Registerkarte &quot;Entschädigung&quot;, und überprüfen Sie &quot;Matrix&quot;, um die Kompensationstabelle zu öffnen. </li><li> Machen Sie eine FRET-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Mit Zelllinien 1 + 2 läuft, klicken Sie auf das Symbol &quot;Quadranten&quot; und zeichnen Quadranten, so dass die Fluoreszenz-negative und -positive Populationen werden durch die unteren zwei Quadranten getrennt (Tore LL3 einnd LR3, respectively). </li><li> Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von FRET für die LL3 und LR3 Gates zeigt. Stellen Sie den Parameter FRET in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des FRET-Signals entspricht zwischen LL3 und LR3. Nach diesem Schritt der MFI des FRET-Signals ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die FRET-Kanal. </li><li> Einen YFP-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Zeichnen Quadranten (LL4 und LR4) ähnlich wie in Schritt 6.4.3 durchgeführt. </li><li> Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die MFI von YFP für LL4 und LR4 zeigt. Passen Sie die Parameter-YFP in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des YFP-Signal entspricht zwischen LL4 und LR4. Nach diesem Schritt wird die MFI einer YFP-Signal ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die YFP-Kanal. </li></ol></li><li> Follaufgrund Gate Setup-und Entschädigung, markieren Brunnen von Interesse und führen Sie den Rest der Platte. </li><li> Nachdem alle Proben, indem Sie auf &quot;Datei&quot; und dann &quot;Kopieren&quot; ausgeführt wurde, Exportdatendateien. Wählen Sie die Registerkarte &quot;Dateien&quot;, markieren Sie den Versuch Ordner, und klicken Sie auf &quot;Kopieren&quot;. </li></ol> 7. Datenanalyse HINWEIS: Achsenparameter ändern zu einzelnen bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter. <ol><li> FCS offene Dateien in der Durchflusszytometrie-Analyseprogramm. </li><li> Basierend auf Streueigenschaften, verwenden eine polygonale Gate, um die Zellpopulation (SSC gegen FSC) und Singulett-Bevölkerung (FSC-H vs FSC-A) von Zellen mit leeren Liposomen behandelt ähnlich wie in Abschnitt 6 beschrieben definieren. </li><li> Wenn CFP Vergütung wurde während der Installation durchgeführt wird, nicht weiter anpassen GFP. </li><li> Erstellen Sie eine FRET vs YFP bivariate Grundstück. Verwendung von Zelllinie # 3Definieren Sie eine falsche FRET-Gate durch Ziehen einer polygonalen Tor, das entlang der Steigung der FRET-positive Zellpopulation führt. Dieses Tor schließt YFP single-positive Zellen, die ein Signal innerhalb des FRET Filter zu emittieren, und ist ähnlich dem zuvor durch Verbieten et al gezogen. 22 </li><li> Definieren Sie eine FRET-Gate durch Auftragen leere Liposomen behandelt CFP / YFP-Zellen auf einem FRET vs GFP bivariate Grundstück. Einführung einer polygonalen Gate entlang der Neigung der Bevölkerung, die sich nach oben erstreckt und weg von der Bevölkerung nach links. Dieses Tor sollten die meisten Zellen (~ 99%), schließen, so daß Hintergrund FRET ≥1% der Zellen. Alle Ereignisse, die in diesem Tor verschieben werden als FRET-positiv. Hinweis: Jeder einzelnen oben beschriebenen Gate mit allen Proben vor dem Bau nachfolgenden Gates angelegt. Nach der Analyse werden vier einzelne Gates definiert (Zellpopulation; Singulett; falsche FRET; FRET). </li><li> Nehmen Sie Analyseparameter von Interesse, darunter: Prozent FRET Positivität und MFIFRET-positiven Zellen. Manuell berechnen die integrierte FRET Dichte durch Messung der Produkt von Prozent Positivität und MFI. HINWEIS: Wenn integriert FRET Dichte als Endziel, Set Hintergrund FRET und MFI größer oder gleich 1 ist, um die Berechnung eines Produkts, das weniger als die beiden einzelnen Faktoren zu vermeiden (wie in Schritt 7.5 definiert sind) verwendet wird. </li></ol>

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This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

Die hier beschriebene FRET Durchflusszytometrie-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle und quantitative Beurteilung tau Aussaat Aktivität. Es erfordert nur moderate Zellkulturerfahrung und Grundkenntnisse in FRET und Durchflusszytometrie. Andere Seeding-Assays, wie Thioflavin T - die verstärkte Fluoreszenz zeigt, wenn es um Beta-Faltblatt-Struktur gebunden - sind aufwendig und erfordern ein reines, rekombinantes Protein-Substrat. Zusätzlich kann in vitro Aussaat Assays für tau ...

Die intrazelluläre Akkumulation von tau Amyloide definiert Tauopathien, wie Alzheimer-Krankheit. In frühen Krankheitsstadien, wird Pathologie allgemein auf diskreten Bereichen des Gehirns lokalisiert ist, aber mit Fortschreiten der Krankheit, Pathologie sind immer an unterschiedliche neuronale Netzwerke 1-5 ausbreitet. Mehr deutet darauf hin transzellulären Ausbreitung toxischer Proteinaggregaten zugrunde liegt diese Pathologie (in 6-10 prüft). In diesem Modell werden proteopathic Samen (zB tau) von Spenderzellen freigesetzt und geben Nachbarzellen, die Umwandlung nativen Tau-Protein in die fehlgefalteten Form über templated Konformationsänderung 11-15. Der hier beschriebene Assay wurde entwickelt, um solche Aussaat Aktivität empfindlich detektieren. Es ist mit einem rekombinanten Protein und biologischen Proben kompatibel und ermöglicht die Quantifizierung von Minute Ebenen proteopathic Aussaat Aktivität 16. HEK 293T-Zellen, die stabil exprimieren tau repeat domain (RD), das die krankheitsassoziierte Mutation P301S entweder GFP oder YFP fusioniert (nachstehend tau-RD-CFP / YFP-Zellen bezeichnet) dienen als stabile Biosensor seeding Aktivität. In Abwesenheit von proteopathic Samen, die Zellen aufrechtzuerhalten tau als lösliches Monomer und keinen nennenswerten Hintergrund FRET. Spontane Aufnahme oder die Liposomen-vermittelte Transduktion tau Samen in Zellen resultiert jedoch in RD-CFP und YFP RD-Aggregation, die eine FRET-Signals, die innerhalb einzelner Zellen über Durchflusszytometrie gemessen wird erzeugt. Zahlreiche Komponenten dieses Tests wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und verringern die Variabilität. Ein monoklonaler Zelllinie mit einem 1: RD-CFP / YFP Expressionsverhältnis 1 wurde ausgewählt, da sie eine optimale Signal: Lärm. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit, sind Phospholipide verwendet werden, um Samen einzuführen direkt in Zellen (wenn auch in biologischen Mechanismen der Aufnahme zu studieren, kann diese weggelassen werden). Schließlich Durchflusszytometrie Monitoren FRET auf Bevölkerungsebene und einer einzelnen Zelle<html> Ebene, im Gegensatz zu anderen Proteinaggregation Assays. Das endgültige Ergebnis zu messen, integrierte FRET Dichte ist hoch quantitative und gehen sowohl die Zahl der Zellen mit Aggregation und dem Grad der Aggregation innerhalb jeder Zelle aufgetreten. Alle diese optimierten Parameter zu verbessern Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dieses System wurde vor kurzem in einer umfassenden Studie an transgenen Mäusen P301S Tauopathie 17, die die zeitliche Entstehung und Progression von Tau-Seeding-Aktivität im Vergleich zu anderen gängigen tau pathologischen Markern (zB MC1, AT8, PG5 und Thioflavinen) bewertet beschäftigt. Seeding-Aktivität ist bei weitem der frühesten und robusten Marker der tau-Pathologie bewertet vorhergehenden histologischen Nachweis von mindestens 6 Wochen. Seeding Aktivität scheint bei 1,5 Monaten steigt progressiv mit dem Alter zu, was auf eine kausale Rolle der proteopathic Samen bei der Entstehung und / oder Progression der Neurodegeneration 16. e_content &quot;&gt; Genaue Quantifizierung von Minuten Levels von Saatgut aus biologischen Proben können Studien, die Anfang der Krankheitsfortschritt überwachen zu erleichtern. Durch die Verkürzung Studiendauer und ermöglicht Verwendung von jüngeren Tieren, könnte dies die Effizienz und Genauigkeit der präklinischen Tierversuchen zu erhöhen. Zum Beispiel in das P301S Maus zuvor beschrieben, konnten Leitstrukturen so früh wie 4-6 Wochen geliefert werden (unmittelbar vor oder am Beginn der Aussaat Aktivität) und zur Wirksamkeit von 2-4 Wochen beobachtet. Die Bestimmung ist genau keine Verringerungen der Aussaat zu quantifizieren Aktivität. FRET Durchflusszytometrie wurde in vitro Screening-Anwendungen. Zum Beispiel können anti-tau-Reagenzien (zB Antikörper, von kleinen Molekülen etc.) schnell auf ihre Fähigkeit Impfen Induktion direkt in Kultur unter Verwendung von entweder rekombinanter tau zu Block prüfenden Aggregate oder Gehirn stamm Lysaten als Keimquelle (Abbildung 5). Mit diesem Setup einmal Keimmaterial hergestellt wird, eine Ex-Experiment dauert nur drei Tage, um abzuschließen, einschließlich der Datenanalyse. Die schnelle Quantifizierung von proteopathic Aussaat Aktivität kann somit zu erleichtern viele Studien der Neurodegeneration.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET Durchflusszytometrie ermöglicht empfindliche, quantitative und schnelle Erkennung von Aussaat Aktivität von rekombinantem oder biologischen Proben. Assay Einrichtung leicht ist: Monoklonaler abgeleitete stabile Zelllinien, die tau-RD-CFP / YFP mit Impfmaterial transduziert, 24-48 h inkubiert und zogen Zytometrieanalyse (1A) fließt. In Abwesenheit von Samen, Biosensorzellen aufrechtzuerhalten tau in einer löslichen, monomeren Form (Abbildung 1B). In Gegenwart der Samen jedoch Bi...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Serie: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Fliegen-Insekt Erkennung und Klassifizierung mit preiswerten Sensoren

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.