We wish to acknowledge the partners in the Helmholtz-Alberta Initiative, the Helmholtz Association and the University of Alberta, for the support resulting from participation in this collaboration. Research funding is provided by the Helmholtz Association's Initiative and Networking Fund, the participating Helmholtz Centers and by the Government of Alberta through Alberta Environment's ecoTrust program.
Dr. Tanushree Ghosh is gratefully acknowledged for her critical inputs at a number of crucial stages.

HINWEIS: Führen Sie die experimentellen Protokolle in der folgenden Reihenfolge beschrieben. Die Bakterienkultur - Protokoll in Abschnitt 1 (siehe auch Abbildung 1) diskutiert wird. Abschnitt 2 beschreibt das Protokoll zur Anreicherung des Kulturmediums mit externen Additiven. Abschnitt 3 beschreibt die Protokolle für die Multi-Mode-Mikroskopie. Gewichte aller einzelnen Komponenten kann unter Verwendung einer Analysenwaage gemessen werden. Volumen jeder Lösung kann unter Verwendung eines volumetrischen Zylinder gemessen werden. HINWEIS: - 2. Wenden Sie sich an institutionelle Sicherheit Büro für Details Proper Biosicherheit Protokolle müssen für die Abschnitte 1 folgen. 1. Bakterienkultur <ol><li> Kultur Bacteria - Agarplattenmedium Vorbereitung <ol><li> Montieren Sie Geräte und Zutaten wie Petrischalen, Kolben, Tris-Base, HCl, Agar, Millipore-Wasser, pH-Meter etc.Sterilize alle Behälter durch Autoklavieren bei 121 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 1 l 0,13 M wässrige Lösung von Tris-Puffer von 15,75 g Tris-Base mit 1 l Millipore Wasser vermischt. Um den pH-Wert der ursprünglichen Lösung (pH 10,4) in 2.800 &amp; mgr; l HCl (50% Konzentration) zu senken. Überprüfen Sie kontinuierlich mit einem pH-Meter mit pH-Wert einzustellen = 9. </li><li> Teilen Sie die 1 l Pufferlösung in zwei Teile wie folgt: <ol><li> Nehmen Sie 800 ml dieser Lösung. Teilen Sie es gleich in zwei Teile von je 400 ml. Man löst 8 g (NH 4) 2 SO 4 zu einer Lösung und 16 g Hefeextrakt zu der anderen Lösung. </li><li> Nehmen Sie die restlichen (200 ml) Lösung und teilen Sie es wieder in zwei Teile von je 100 ml. Mix 2 g (NH 4) 2 SO 4 zu eins. Hinzufügen, 4 g Hefeextrakt und 4 g Agar zum anderen. </li></ol></li><li> Autoclave die 4 Lösungen getrennt nach der jeweiligen Kolben in Al-Folie wickeln und kleben Autoklaven Bänder. HINWEIS: Wenn ein Benchtop-Autoklav-Einheit verwendet wird, sollte das Volumen auf 500 ml eingestellt werden (Temperatur und Druck automatmatisch in Abhängigkeit von Volumen angegeben). </li><li> Nachdem sie aus dem Autoklaven nehmen, stellen Sie die zwei 400 ml-Lösungen beiseite für Schritt 1.3.1 (unten). Mischen Sie die zwei 100 ml-Lösungen eine 200 ml Lösung. Die Mischung wurde in 10 bis 12 Petrischalen. </li></ol></li><li> Kultur Bacteria - Näh - Probenvorbereitung <ol><li> Entfernen Sie die Bakterien Lager aus dem Gefrierschrank (-80 ° C) und lassen Sie es zu tauen. richtig, legen Sie die bakterielle Lager und die Agar-Platte in einer Biosicherheits Haube Nach dem Auftauen. </li><li> Wählen Sie die Mikropipette aus kleinsten Dimension (0,5 bis 10 &amp; mgr; l ist eine gute Wahl) , um die Spitze mit dem Sporosarcina pasteurii Lager zu verseuchen. Streak eine Agar-Platte mit der Mikropipettenspitze. Legen Sie die Strähnen-Agar-Platte in einem nicht-Schüttelinkubator bei 31 ° C für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, um die Platte aus dem Inkubator entfernen und visuell auf die Existenz von Einzelkolonien zu untersuchen. Wenn es keine einzelne Kolonien sind, legen Sie sie dann in ter Inkubator für weitere 24 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, bis einzelne Kolonien festgestellt werden. Nicht mehr als 7 Tagen nach der Studie. HINWEIS: Wenn einzelne Kolonien nicht einmal nach einer Woche erscheinen, dann wird der Schluss gezogen, dass die Schritte nicht ordnungsgemäß und der gesamte Prozess muss wiederholt werden Schritt 1 gefolgt. </li></ol></li><li> Kultur Bakterien - Schlussprobenvorbereitung <ol><li> Mischen Sie die zwei 400 ml - Lösungen (Tris - Puffer + (NH 4) 2 SO 4 und Tris - Puffer + Hefeextrakt (1.5.1) zusammen eine 800 ml Lösung zu erhalten. Übertragen 125 ml dieser Lösung in einem Kolben. </li><li> Durchführen einer Sichtprüfung der Oberfläche der Agarplatte Regionen mit hoher Konzentration von Einzelkolonien zu identifizieren. Sanft schubsen und mit einer Mikropipette Spitze einer der Kolonien brechen. </li><li> Tauchen Sie die gleiche Mikropipettenspitze in den 125-ml-Kolben und rühren Sie es gründlich, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine robuste Multiplikation, um sicherzustellen, übertragen bekommen. Der Kolben wird in einem Schüttelinkubator bei 150 Umdrehungen pro Minute, 30 ° C für 2 - 3 Tage. Nach 2 - 3 Tage, wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. </li></ol></li><li> Kultur Bakterien - Schluss Cell Count <ol><li> Führen Sie serielle Verdünnung des nicht verdünnten Kulturlösung PBS unter Verwendung einer Verdünnung von mindestens zehn Millionen (10 -7) zu erreichen zählbaren einzelne Kolonien zu gewährleisten , erscheinen. Zeichne sieben parallele äquidistante Linien auf einer der Agar-Platten. <ol><li> Tun Sie dies durch fette Linien auf der Unterseite der Petrischale, prominent genug Zeichnung von oben sichtbar sein. Tropfen-3 kleine Tropfen von nicht-verdünnte Lösung in einem Segment. 1 ml der unverdünnten Lösung auf 9 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) mit einer Verdünnung von 1:10 zu erhalten. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine kleine Teilmenge (~ 0,1 ml) dieser neu verdünnte Lösung mit einer Pipette und Drop 3 weitere kleine Tropfen auf den nächsten Abschnitt. Übertragung der neu verdünnten Lösung in einen neuen Kolben und weiter verdünnt zehnmal (10x) durchZugabe von PBS. Dadurch verringert sich die Verdünnung auf 10 -2 oder 1: 100. <ol><li> Verwenden Sie diese 1: 100-Lösung in den nächsten Abschnitt. Wiederholen Sie diesen Vorgang er mit kleinen Volumina der frisch verdünnten Lösungen verarbeiten , indem nacheinander an neue Kolben übertragen und kontinuierlich verdünnt das Zehnfache (10x) im Tandem mit PBS mehr und mehr verdünnte Proben von 10 -3 oder 1 zu erhalten: 1000 den ganzen Weg bis zu 10 -7 oder 1.10 Millionen in das letzte Segment. </li></ol></li><li> Führen Colony-Forming Unit (CFU) Plattenzahl die Anzahl der Zellen in der Agar-Platte zu zählen, nachdem die Platte für 1 Inkubation - 2 Tage bei 31 ° C. Dies ergibt ein quantitatives Maß für die Bakterienzahl in der unverdünnten Probe. HINWEIS: Die CFU-Wert gemessen wird, basierend auf der Fähigkeit des Systems, Anlass zu Kolonien unter den spezifischen Bedingungen des Nährmediums zu geben, die Temperatur und die Zeit unter der Annahme, dass jede Kolonie getrennt ist und durch eine einzige lebensfähige mikrobielle Zelle gegründet. </li><li> Dichtungdie Petrischalen mit selbstdichtenden Film und speichern verbleibenden Elemente in einem Kühlschrank für die zukünftige Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Protokoll zur Anreicherung von Nährstoffen Precipitation zu beschleunigen <ol><li> Transfer 9 ml der hergestellten Kulturflüssigkeit (Zellen + Medium) in mehrere sterilisierten Zentrifugenröhrchen, die jeweils 10 ml Volumen. </li><li> Bereiten Sie eine 100 ml-Stammlösung der externen Anreicherung bestehend aus vier Komponenten in den folgenden Konzentrationen in frischem Medium: Harnstoff: 2 g / l, Ammoniumchlorid: 1 g / l, Natriumbicarbonat: 212 mg / l, Calciumchlorid: 280 mg / L. messen Sie sorgfältig alle Zutaten einer Analysenwaage mit und im Autoklaven (121 ° C, 15 psi, 15 min) alle, aber Harnstoff mit frischem Medium in einem Becherglas und Ort mischen. <ol><li> Nach Autoklaven, mischen, um die erforderliche Menge an Harnstoff (2 mg) mit 1 ml frischem Medium und durch eine Spritze mit 0,22 um Spritzenfilter ausgestattet, um den Prozess der Anreicherung abzuschließen. </li><li> 1ml dieser Anreicherungsmedium mit Additiven zu den 9 ml der Flüssigkeit hergestellten Kultur enthält Zentrifugenröhrchen sterilisiert (Zellen + Medium) (siehe Schritt 2.1). HINWEIS: all dieser Komponenten, Harnstoff bei erhöhten Temperaturen abbaubar, nicht in einem Autoklaven sterilisiert werden. Daher wird, nachdem die anderen Bestandteile autoklaviert wurden (121 ° C, 15 psi, 15 min) wird Harnstoff zuletzt zugegeben durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li></ol></li><li> Vortex jedes Rohr eine mechanische Vortexer gründlich mit. Legen Sie die angereicherten Flüssigkeiten (Zellen + Medium + Additive) in einem nicht-Schüttelinkubator bei 30 ° C. Überwachen Sie alle Einheiten regelmäßig für die Initiierung der Fällung. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, beginnen mikroskopische Beobachtungen einmal Einsetzen der Präzipitation mit dem bloßen Auge festgestellt wird. Dies ist in der Regel zwischen 30 bis 36 Stunden nach dem Beginn der Versuche. </li></ol> 3. Protokoll für Multi-Mode-Mikroskopie <ol><li> Übertragen ein kleines Volumen (ca. 1 ml) der Flüssigkeit zu einem Hoch magnificatIonenmikroskopie-chambered Abdeckglas System ersten Beobachtungen mit Hellfeld-Modus auszuführen. Um damit zu beginnen, starten alle Beobachtungen mit der geringsten Vergrößerung (4X). das bietet eine breite Bereich der Abdeckung und damit globale Informationen über die Verteilung von Niederschlägen. </li><li> Wählen Sie bestimmte Bereiche mit erheblichen Mengen von Ausfällungen und vergrößern (20X, 40X, 60X) durch schrittweise die Vergrößerung zu erhöhen. HINWEIS: Da es unmöglich ist, um richtig die Zellen aus dem extrazellulären polymeren Substanz (EPS) unter Hellfeld (aufgrund sehr nahe Brechungsindizes) zu lösen, schalten Sie Phasenkontrast-Modus bei Bedarf. In diesem Modus sind nur die Umrisse der Zellmembranen (eine andere Phase als die bulk Zelle ist) sichtbar ist, wodurch optische Differenzierung ermöglicht. </li><li> Schließlich färben einige Kammern mit Live / Dead-Färbung, die selektiv die Live-Komponenten als grüne Farbstoffe, während die toten Komponenten in roten Färbung. Siehe Standardprotokolle 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Schalten Sie Fluoreszenzmodus richtig zwischen den roten und grünen Bereichen unterscheiden. Red (Red Filterwürfel mit Anregungswellenlänge von 540 bis 580 nm dichroitische Spiegel von 595 nm und Sperrfilter von 600 bis 660 nm) und Green (GFP Langpassgrünfilterwürfel mit Anregungswellenlänge von 440 bis 480 nm dichroitische Spiegel 505 nm und Sperrfilter von 510 nm) Filterwürfel verwendet Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zu erleichtern. </li><li> Sobald alle Multi-Mode-Daten wurden gesammelt, wählen Sie die besten Bilder und manuell Overlay (individuelle Hellfeld, Phasenkontrast und Fluoreszenz-Bilder), um den bestmöglichen Kontrast und Klarheit zu erhalten. </li><li> Führen Sie SEM auf den getrockneten festen Proben Kristallstrukturen zu verstehen. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren. 22 Führen XPS chemischen Signaturen von funktionellen Gruppen (Carbonate) zu identifizieren. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren als auch. 23 </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+Bacillus+pasteurii+group.">An investigation of the Bacillus pasteurii group.</a> Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).</li><li>Greenfield, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+concentration+of+calcium+and+magnesium+and+precipitation+of+calcium+carbonate+by+a+marine+bacterium.">Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).</li><li>Phillips, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+applications+of+ureolytic+biomineralization:+a+review.">Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review.</a> Biofouling. 29, 715-733 (2013).</li><li>Dhami, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+carbonates+and+their+engineered+applications:+a+review.">Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review.</a> Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).</li><li>Cuthbert, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+on+the+rate+of+ureolysis+and+the+morphology+of+carbonate+precipitated+by+S.+Pasteurii+biofilms+and+limits+due+to+bacterial+encapsulation.">Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation.</a> Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).</li><li>Okwadha, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimum+conditions+for+microbial+carbonate+precipitation.">Optimum conditions for microbial carbonate precipitation.</a> Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).</li><li>Stocks-Fischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+precipitation+of+CaCO3.">Microbiological precipitation of CaCO3.</a> Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).</li><li>Lauchnor, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterially+induced+calcium+carbonate+precipitation+and+strontium+coprecipitation+in+a+porous+media+flow+system.">Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 1557-1564 (2013).</li><li>Al Qabany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+Affecting+Efficiency+of+Microbially+Induced+Calcite+Precipitation.">Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation.</a> Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).</li><li>Morita, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcite+precipitation+by+marine+bacteria.">Calcite precipitation by marine bacteria.</a> Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).</li><li>Chafetz, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+peloids:+A+product+of+bacterially+induced+carbonate+precipitation.">Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation.</a> Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).</li><li>Whiffin, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , (2004).</li><li>Paassen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+up+of+BioGrout:+a+biological+ground+reinforcement+method.">Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method.</a> Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbially+enhanced+geologic+containment+of+sequestered+supercritical+CO2.">Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2.</a> Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+well+bore+leakage+of+CO2+using+engineered+biomineralization+barriers.">Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers.</a> Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).</li><li>Jonkers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+bacteria+as+self-healing+agent+for+the+development+of+sustainable+concrete.">Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete.</a> Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).</li><li>Tobler, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Sporosarcina+pasteurii+in+sandstone+and+its+significance+for+subsurface+engineering+technologies.">Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies.</a> Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).</li><li>Mortensen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+microbial+induced+calcium+carbonate+precipitation.">Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation.</a> Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).</li><li>Phillips, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+CO2+leakage+reduction+through+biofilm-induced+calcium+carbonate+precipitation.">Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 142-149 (2013).</li><li>vander Heide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , (2011).</li><li>Wiley, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+an+alkaline+pH+and+ammonia+for+substrate+oxidation+by+Bacillus+pasteurii.">Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii.</a> Journal of Bacteriology. 84, (1962).</li><li>Tagliaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+strain+localisation+processes+in+bio-cemented+sand+using+x-ray+imaging.">Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging.</a> Granular Matter. 13, 247-250 (2011).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).</li><li>Valiei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>. LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf</a> (2004)</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kritische Schritte: Dieses Manuskript beschreibt detailliert die Protokolle für die Kultivierung einer tragfähigen Probe von S. pasteurii. Sobald die Kultur bereit gemacht worden ist, muss es in geeigneter Weise angereichert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt , entscheidend für den Erfolg des Experiments , weil ein Fehler die richtige chemische Umgebung zu schaffen , führt entweder zu sehr langen Zeitskalen von Ausfällen oder einem vollständigen Fehlen derselben. S. pasteurii...

Sporosarcina pasteurii ist ein gram-positives Bakterium der Lage , in stark alkalischen Umgebungen (pH ~ 10) 1 , um zu überleben und ist einer der bakteriellen Spezies , die ein Erreger eines Phänomen kann Mikrobiologisch Induced Calcite Precipitation (MICP) 2-4 genannt. MICP ist ein Verfahren , bei dem die Ausfällung von Calciumcarbonat durch bestimmte Mikroben unter geeigneten Umweltbedingungen induziert wird. S. pasteurii hat Bedeutung in den letzten Jahren angenommen aufgrund seiner Identifizierung als mögliche Mittel für bedeutende Mengen MICP unter bestimmten Bedingungen zu induzieren. Diese Möglichkeit ergibt sich aus der Tatsache , dass S. pasteurii hat die einzigartige Fähigkeit , reichliche Mengen des Enzyms Urease absondern. Dieses Enzym wirkt als Katalysator, um einen beschleunigten Lyse von Harnstoff (ein natürlich vorkommendes biochemische Verbindung mit der weit verbreiteten und reichliche Versorgung) in Gegenwart von Wassermolekülen zu fördern. Durch eine Kaskade von Reaktionen, diesen Prozess ultimatively führt zur Erzeugung von Carbo negativ geladen. Diese Ionen, die wiederum reagieren mit positiven Metallionen, wie Calcium, um schließlich Niederschläge von Calciumcarbonat (Calcit) bilden; daher die Bezeichnung MICP 5-9. Der Prozess des MICP ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt und 10,11 sucht. In den letzten Jahren hat sich MICP für ein breites Spektrum an technischen und umwelttechnische Anwendungen einschließlich Bottom-up - grün Bau 12, Verstärkung der Großstrukturen 13,14 und Kohlenstoffbindung und -speicherung 15,16 sucht worden. B. et 17 Cunnigham. al entwickelt, um eine hohe Druck moderate Strömung Reaktortemperatur einen Berea-Sandsteinkern enthält. Der Reaktor wurde mit den Bakterien inokuliert S. fridgidimarina und unter Bedingungen von Hochdruck - superkritischem Kohlendioxid Injektion einer massiven Ansammlung von Biomasse in der Pore volUME wurde beobachtet, die in der Permeabilität zu mehr als 95% Reduktion geführt. 18 Jonkers und Schlangen untersuchten die Wirkung von bestimmten speziellen Bakterienstämme auf die Selbstheilungsprozess in Beton. Externe Wasser transportiert in das Porennetzwerk durch die Oberflächenporen eintritt, wird erwartet, dass die ruhenden Bakterien zu aktivieren, die wiederum strukturelle Festigkeit über MICP helfen. Tobler 19 et al. die ureolytischen Aktivität von S. haben im Vergleich pasteurii mit einem einheimischen Grundwasser ureolytischen Mikrokosmos unter Bedingungen groß angelegte MCIP Begünstigung und fand heraus , dass S. pasteurii hat eine konsistente Fähigkeit Calcitausfällung zu verbessern , selbst wenn die indigenen Gemeinschaften vor Urease - Aktivität fehlte. Mortensen 20 et.al haben die Auswirkungen von externen Faktoren wie Bodentyp, Konzentration an Ammoniumchlorid, Salzgehalt, Sauerstoffkonzentration und die Lyse von Zellen auf MICP sucht. Ihre Demonstration, dass die biologische Behandlungsverfahren ist sehr robust bzw.ect zu einer großen Variation im Parameterraum belegt die Eignung dieses Verfahrens für verschiedene Sanierungs Anwendungen in großem Maßstab eine richtige Anreicherungsprozess bereitgestellt, um die Bakterien zu verstärken vorgenommen. Phillips 21 et. al ausgelegt Experimente die Änderungen der Durchlässigkeit und Festigkeit einer Sandsäule und ein Sandsteinkern zu studieren , nachdem sie mit S. injiziert wird pasteurii Kulturen. Sie fanden heraus, dass, während die Durchlässigkeit verringert 2-4 mal während die Bruchfestigkeit dreimal erhöht. S. pasteurii und seine Rolle in MICP sind Themen der aktiven Forschung und mehrere Probleme auf den Mechanismus der chemischen Fällung beziehen , sind noch nicht vollständig verstanden. Vor diesem Hintergrund ist es sehr wichtig , eine Reihe konsistenter standardisierte Protokolle zu haben , um genau Kultur ein entsprechend angereichert Lager von S. pasteurii MICP zu erreichen. Hier beschreiben wir ein strenges Protokoll, das die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet. Diese manuscript beschreibt die detaillierten Protokolle für S. Kultivierung pasteurii und in geeigneter Weise die Kulturmedium bereichern Fällung zu induzieren. Das Verfahren wird durch die verschiedenen mikroskopischen Techniken wie optische und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht. Der Schwerpunkt des Manuskripts ist auf den Prozess der MICP. Verfahren wie SEM und SIMS, gut etablierte Standardprotokolle sind, werden nicht gesondert beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Petridish</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:255px;">Petridishes being used as Agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Pyrex Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S63268</td>
			<td style="width:255px;">Corning Erlenmeyer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:108px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5133</td>
			<td style="width:255px;">being used to make Tris-Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9892</td>
			<td style="width:255px;">1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:224px;">Agar Powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td style="width:255px;">microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418</td>
			<td style="width:255px;">for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Yeast extract powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51475</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Measuring Cylinder</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">CP08559GC</td>
			<td style="width:255px;">Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:108px;">OHAUS</td>
			<td style="width:119px;">AX124E</td>
			<td style="width:255px;">being used to measure weight of reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave</td>
			<td style="width:108px;">Brinkmann</td>
			<td style="width:119px;">58619000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave Tape</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52428864</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z185140</td>
			<td style="width:255px;">being used to seal the flask before placing it in Autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Bacterial Stock</td>
			<td style="width:108px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:119px;">11859</td>
			<td style="width:255px;">-80&#176;C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:224px;">Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume</td>
			<td style="width:108px;">Biohit</td>
			<td style="width:119px;">725010</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 14005976</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Micropipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">212772B</td>
			<td style="width:255px;">Used for scratching Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Binder</td>
			<td style="width:119px;">80079098</td>
			<td style="width:255px;">Microbiology Incubator,BF Series</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Shaking Incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14004300</td>
			<td style="width:255px;">VWR Signature Benchtop Shaking Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">357590</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 53106220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Parafilm</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793</td>
			<td style="width:255px;">Being used to seal Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urea</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U1250</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8875</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiologically induced calcite precipitation mediated by sporosarcina pasteurii

Die besondere Bakterium untersuchten hier (S. pasteurii) ist einzigartig in seiner Fähigkeit, unter den richtigen Bedingungen, die Hydrolyse von Harnstoff (Ureolyse) zu induzieren in natürlich Umgebungen durch Sekretion eines Enzyms Urease auftritt. Dieser Prozess der Ureolyse, durch eine Kette von chemischen Reaktionen, führt zur Bildung von Calciumcarbonat ausfällt. Dies wird als Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung (MICP) bekannt. Die richtigen Kulturprotokolle für MICP werden hier detailliert beschrieben. Schließlich wurden Experimente Visualisierung unter verschiedenen Modi Mikroskopie verschiedene Aspekte des Fällungsverfahren zu verstehen. Techniken wie optische Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurden die Endprodukt chemisch zu charakterisieren, verwendet. die Fähigkeit dieser Präzipitate weiter auf Poren in einem natürlichen porösen Medium verstopfen wurde, in dem Schwamm durch ein Experiment zeigte, qualitativeStäbe wurden mit einem Porennetzwerk mit einer Reihe von Längenskalen zu imitieren verwendet. Ein Schwamm bar eingetaucht in das Kulturmedium die Bakterienzellen enthält, härtet aufgrund der Verstopfung seiner Poren aus dem kontinuierlichen Verfahren der chemischen Fällung führt. Diese gehärteten Schwamm bar eine überlegene Festigkeit, wenn sie mit einem Steuer sponge bar verglichen, die unter der Wirkung eines aufgebrachten externen Last zusammengedrückt wird und komprimiert, während die ausgehärtete bar in der Lage, das gleiche Gewicht mit wenig Verformung zu unterstützen.

S. pasteurii ein alkali 24 sein kann relativ harten Bedingungen überleben. Wenn das oben erwähnte Kulturprotokoll folgt, und S. pasteurii ist innerhalb einer Kammer gezüchtet, die Bakterien führt zur Ausfällung von Calciumcarbonat über die Zeit (2A), Fig . 2 (b) zeigt eine Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahme der bakteriellen Zellpopulation innerhalb des Kulturmediums. Einzelne Zellen können klar...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii at JoVE.com

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

microbiologically-induced-calcite-precipitation-mediated-sporosarcina

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

21.6K Aufrufe.  University of Alberta. Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Serie: Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Forschung

Biotechnik

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Untersuchung der dreidimensionalen Strömungstrennung, die durch ein Modell Vocal Fold Polyp induziert wird

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...