Unser Protokoll beschreibt ein einfaches In-vitro-System, um die Wirkung isolierter Moleküle auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat zu untersuchen. Diese Technik ist vorteilhaft in Fällen, in denen die Biomoleküle, die ich teste, teuer oder in kleinen Mengen erhältlich sind, sowie wenn eine langsame Calciumcarbonatfällung erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht es, mehrere Niederschlagsexperimente unter den gleichen Bedingungen gleichzeitig zu untersuchen.
Bereiten Sie zunächst das Kontrollexperiment vor. Verwenden Sie dreifach destilliertes Wasser und Ethanol, um Glasstücke und Glaswaren zu reinigen. Verwenden Sie einen Diamantstift, um Teile eines Glasmikroskopschlittens zu schneiden, so dass sie in einen Brunnen einer 96-Well-Platte passen.
Legen Sie die Glasstellen in einen Becher mit dreifach destilliertem Wasser, so dass das Wasser die Glasrutschen bedeckt. Beschallen Sie in einem Bad Beschallungsgerät für 10 Minuten. Dekant das Wasser.
Fügen Sie Ethanol hinzu, um die Glasglyse zu bedecken, und beschallen Sie wieder in einem Bad Beschallungsgerät für 10 Minuten. Dann trocknen Sie die Dias und das Glas mit einem Strom von Stickstoffgas, und legen Sie sie in einem Luftplasmareiniger für 10 Minuten bei 130 Watt. In einer Dunstabzugshaube die Brunnen an den Ecken einer 96-Well-Platte mit Ammoniumcarbonatpulver füllen und die Platte mit Aluminiumfolie versiegeln.
Bedecken Sie die Folie mit Paraffinfolie. Reinigen Sie alle Restammoniumcarbonate mit Stickstoffgas. Legen Sie die zuvor geschnittenen und gereinigten Glasteile in fünf verschiedene Brunnen, die der Mitte am nächsten liegen.
Füllen Sie jeden Brunnen mit einem Glasstück mit 100 Mikroliter Calciumchloridlösung, die mit dreifach destilliertem Wasser bei einem zunehmenden Gradienten von 10, 20, 30, 40 und 50 Millimolaren hergestellt wird. Als nächstes punktieren Sie die Abdeckung der einzelnen Brunnen, die Ammoniumcarbonat enthalten, dreimal mit einer Nadel. Den Deckel zurücklegen, die Ränder mit Paraffinfolie versiegeln und 20 Stunden lang bei 18 Grad Celsius in einem Brutkasten aufbewahren.
Während der Inkubation wird Ammoniumcarbonat in Ammoniak und Kohlendioxid zerlegt, die zu Calciumchloridlösungen diffundieren, was zur Bildung von Calciumcarbonatkristallen führt. Nach der Inkubation öffnen Sie den Deckel vorsichtig in einer Dunstabzugshaube und entfernen Sie mit einer Schlaufe die kristallisierenden Kristalle an der Wasser-Luft-Schnittstelle. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Glasteile in einen Becher mit doppelt destilliertem Wasser für einen kurzen Tauchgang zu übertragen.
Entfernen Sie dann die Proben aus dem Becher, und verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Glasstücke auf dem Boden der Petrischale zu befestigen. Trockenes übermäßiges Wasser, das die Ränder der Rutsche berührt, mit Gewebetüchern. Bedecken Sie die Petrischale und legen Sie sie 24 Stunden lang in einen Trockenhaus.
Beobachten Sie die auf den Glasstücken gebildeten Kristalle mit einem aufrechten optischen Mikroskop bei 10- bis 40-facher Vergrößerung. Die beobachteten rhombohedralen Kristalle sind höchstwahrscheinlich Calcit. Wenn die Lösung zusätzlich zu den rhombohedralen Kristallen kugelförmige Kristalle enthält, die höchstwahrscheinlich vateritisch sind, wiederholen Sie das Kristallisationsprotokoll, um sicherzustellen, dass der Reinigungsschritt korrekt durchgeführt wird.
Stellen Sie außerdem sicher, dass es in anderen Bereichen der Platte als den dafür vorgesehenen Brunnen kein Ammoniumcarbonat gibt. Die optimale Konzentration für Calciumchlorid wird nach der Probe ermittelt, die reich an glatten facettierten Calcitkristallen ohne Vateritkristalle ist. Reinigen Sie zunächst Glasschlitten und Glaswaren wie bisher.
In einer Dunstabzugshaube Ammoniumcarbonatpulver in die Ecken einer 96-Well-Platte legen. Legen Sie in jedem Brunnen, in dem der Niederschlag auftritt, ein Glasstück, das geschnitten und gereinigt wurde. Bereiten Sie die Steuerbrunnen vor.
In zwei Steuerbrunnen, Pipette 90 Mikroliter von 25 Millimolar Tris Puffer bei pH 8, ergänzt mit 100 Millimolar Natriumchlorid. Dann 10 Mikroliter 0,5 Mol Calciumchlorid-Stammlösung hinzufügen. Passen Sie dann die Konzentration des additiven Proteins TapA auf 10 mikromolare TapA, 100 Millimolar Natriumchlorid und 25 Millimolar Tris Puffer bei pH 8 an.
Bereiten Sie den Zusatzstoff, der Brunnen enthält, durch Zugabe von 90 Mikrolitern der Additivlösung vor. Fügen Sie dem zuvor ermittelten Additiv mit Brunnen 10 Mikroliter 0,5 Molcalciumchlorid in den Zusatzstoff ein, der Brunnen enthält, um die optimale Konzentration bei 50 Millimolar Calciumchlorid zu erreichen. Bereiten Sie die Platte mit Löchern auf der Abdeckung über Brunnen mit Ammoniumcarbonat vor und brüten Sie wie bisher bei 18 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Glasstücke wie zuvor in einer Petrischale zubereiten und 24 Stunden in einen Trockenschrank geben. Um den Massenanteil der Additive in den Calciumcarbonatausscheidungen zu quantifizieren, überprüfen Sie zunächst den Aussterbekoeffizienten des verwendeten Additivs. Verwenden Sie dann eine Mikrowaage, um die Glasstücke zu wiegen, wo sich die Kristalle gebildet haben.
Danach die Kristalle aus dem Glas in ein Eppe-Rohr mit 1,2 Millilitern 0,1 Molessigsäurelösung kratzen. Wirbel kurz, und legen Sie dann die Röhre in einen Beschallungsgerät, um die Probe zu beschallen, bis die Kristalle verschwinden. Bewahren Sie die Probe 24 Stunden bei Raumtemperatur auf.
Wiegen Sie die Glasrutsche nach dem Abkratzen der Kristalle. Messen Sie die UV-Absorption A der 1,2 Milliliter schallten Lösung bei 280 Nanometern für den Proteinzusatzstoff. Verwenden Sie die Beer-Lambert-Gleichung, um ihre Konzentration c zu berechnen.
L ist der optische Pfad innerhalb der Küvette. Um die Masse der Additive im Kristall zu berechnen, verwenden Sie die Gleichung, c mal v gleich m, wenn die Konzentration in Milligramm pro Milliliter liegt. Wenn die Konzentration in Molproliter liegt, dann berechnen Sie die Maulwürfe, die c mal v gleich n anwenden.
Verwenden Sie dann das Molekulargewicht, um die Masse der Additive zu berechnen. Berechnen Sie den Gewichtsprozentsatz der Additive in den Kristallen. M ist die Masse der Additive, und Delta m s, ist die Masse der Calciumcarbonatkristalle, die von der Glasscheibe abgekratzt wurden.
SEM-Bilder zeigen den Vergleich zwischen einer richtigen Steuerung mit glatten Calcitflächen und Calcitkristallen mit Gesichtern, die aus Schritten bestehen. Die kugelförmigen Kristalle sind vaterite. Die erfolgreichen und erfolglosen Kontrollexperimente führten zur Raman-Spektroskopie, die die typischen Spektren von Calcit bzw. Vaterit zeigte.
Die Teilung der Raman-Schicht bei rund 1080 Promille ist das offensichtlichste Merkmal von Vaterite. Die in Gegenwart von TapA gebildeten Kristalle von Calciumcarbonat unterscheiden sich von den Kontrollkristallen. Es entstand eine komplexe kugelförmige Calciumcarbonat-Baugruppe, die aus mehreren Calcit-Mikrokristallen besteht.
Das Raman-Spektrum der Kristalle, die in Gegenwart von TapA gebildet werden, ähnelt dem Spektrum von Calcit. Die saugfähigen Spektren von TapA und die Kontrolle ohne Additiv wurden nach Auflösung der Kristalle in Säure gemessen. Der Massenprozentsatz von TapA wurde auf 1,8 plus oder minus 0,2% festgelegt. Es ist wichtig, die Reinigungsschritte sorgfältig zu befolgen und sicherzustellen, dass die Kontrollstandards erfüllt werden, bevor die Auswirkungen der Zusatzstoffe auf die Bildung von Calciumcarbonat getestet werden.
Darüber hinaus ist es wichtig, überschüssiges Ammoniumcarbonat in pulverförmiger Form aus den Brunnen zu entfernen. Ammoniumcarbonat zersetzt sich in Ammoniak und Kohlendioxid. Ammoniak ist giftig, wenn es eingeatmet wird, und daher sollte Ammoniumcarbonat nur in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.
Um die innere Morphologie und Struktur der Kristalle zu bewerten, können Sie sie mit einem fokussierten Ionenstrahl abbilden, die Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop abbilden und die Elektronenbeugungsmuster von bestimmten Stellen entlang der Abschnitte messen. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um die Wirkung verschiedener Moleküle auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat zu untersuchen. Wir haben diese Methode auf Biopolymere ausgearbeitet, die von Bakterienzellen in Biofilmen hergestellt werden.
Es wird interessant sein, zusätzliche Studien mit anderen Biopolymeren durchzuführen, die von verschiedenen Bakterienstämmen produziert werden.
