Diese Studie stützt sich auf die NSF (HBCU-UP-Forschungspreis der Initiation, HRD 1401426 und EPSCoR EPS-0814251) und NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.s. wird unterstützt durch ein Stipendium von der Delaware INBRE III 6404.

Das Protokoll, die unten gegeben hat um zu testen, die Auswirkungen von BPA-Exposition in der (frühen) Embryogenese standardisiert worden und kann für die Verwendung mit BPS, BPF oder andere EDC in Küken embryonalen Nervenzellen geändert werden.
Dieses Protokoll folgt der institutionellen Politik der Delaware State University und der NIH-Politik für Vogelgrippe Embryonen. Das Protokoll ist auch in Bestätigung DSUS Material und chemische Sicherheitsrichtlinien.
1. materielle Setup
<ol><li>Lösen Sie BPA (m.w. 228.29) in 10 % Ethanol (V/V) im Wasser, eine 1 mM Stammlösung (0,23 mg / mL 10 % Ethanol) zu machen. Machen Sie spätere Verdünnungen (0,1 µM 0,5 µM, 1 µM, 5 µM und 10 µM) in Neurobasal Medium. Vorsicht: BPA ist ein Umweltgift und Vorsicht beim Umgang mit des Pulvers.</li>
	<li>Inkubieren Sie Küken-Eiern in einem handelsüblichen Tabletop Ei Inkubator bei 37 ° c 7 Tage für E7 Embryonen inkubieren Sie Eiern.</li>
	<li>Bereiten Sie MEAs entkeimen die erforderliche Anzahl von MEAs durch Einweichen in 70 % igem Ethanol für 3 bis 4 h und dann spülen Sie dreimal in ca. 10 mL sterilem destilliertem Wasser in der BSLII-Haube. Hinweis: Die MEAs enthalten 64 nanoporöse Platin-Elektroden in einem 8 x 8-Raster angeordnet. Die Elektrodendurchmesser 30 µm und der Abstand zwischen den Elektroden ist 200 µm. Verwenden Sie nicht denaturiertem Ethanol für die Sterilisierung der MEAs, denn dies führt zu Korrosion der MEA.</li>
	<li>Legen Sie die MEAs in einen sterilen Behälter mit Deckel (Aufrechterhaltung der Sterilität) und bewegen sich in einem Table-Top-Inkubator. Backen Sie für mindestens 6 Stunden bei 55 ° C. Dieser Schritt ist wichtig für die richtige Sterilisation und die Temperatur sollte nicht mehr als 60 ° C. Aufrechterhaltung der Sterilität, verschieben Sie die Schale mit MEAs, BSLII Haube für die Lagerung bis zur weiteren Verwendung. Hinweis: Wir verwenden ein Ofen sicher Glas Auflaufform mit Kunststoffdeckel und Oberfläche Sterilisieren sie mit 70 % Ethanol und in der BSLII-Haube zum Trocknen.</li>
	<li>Aliquot der extra-zellulären ECM-Matrixlösung. Tauen Sie das Fläschchen bei 4 ° C über Nacht auf und frieren Sie 100 µL-Aliquots bei-20 ° C ein. Hinweis: ECM wird gefroren geliefert. ECM sollte nicht sein auf Raumtemperatur gebracht bis bereit zu beschichten, da es bei Raumtemperatur polymerisiert und einmal polymerisiert, es unmöglich zu beschichten ist. ECM ohne Wachstumsfaktoren wird bevorzugt, um zusätzliche Effekte durch unbekannte Faktoren zu verhindern.</li>
	<li>Alle Instrumente der Dissektion (Dumont Nr. 5 Pinzetten, gebogenen Pinzette, kleine Schere und Feder Schere) zu sterilisieren und selbstdichtend Material beschichtet Dissektion Gerichte mit 70 % Ethanol und in der Dissektion Haube trocknen lassen.</li>
</ol>2. Küken embryonalen Neuron Kultur und Netzwerk-Aktivität
<ol><li>Am Tag der Beschichtung entfernen ein Fläschchen von ECM aus der Tiefkühltruhe-20 ° C, Sprühen Sie mit 70 % Ethanol, und auf Eis. Durch Zugabe von 300 µL kalter Neurobasal Medium in BSLII Kapuze auf 25 % zu verdünnen.</li>
	<li>Mit einem P200 Pipetteman hinzufügen 100 µL 25 % ECM in die Mitte der MEA kümmert sich nicht um die Elektroden zu berühren und sofort verlassen einen dünnen Film auf der Oberfläche zu entfernen. Abdecken der MEA und im CO2 Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) erst unmittelbar vor der Neuronen Platte.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die äußere Hülle der Eizelle E7 (embryonale Tag 7, für 7 Tage bei 37 ° C inkubiert) mit 70 % Ethanol. Enthaupten Sie den Embryo in einen Sylgard unteren Dissektion Teller, kalte sterile Hank ausgewogen Salze Lösung (HBSS) ohne Calcium enthält. Um die Augen herum schneiden Sie und entfernen Sie die Augäpfel. Mit DuMont #5 feine Pinzette und Feder Schere einen Einschnitt auf der Bauchseite machen und entfernen Sie die äußeren Schichten der Haut, das Vorderhirn und Optik Tectum verfügbar zu machen. Schälen und die pial Membran vorsichtig entfernen. Übertragen Sie das Vorderhirn in einem anderen Petrischale und schneiden Sie es in kleine Stücke von ca. 2 mm mit Feder Schere. Hinweis: Es sollte Blutgefäße Vorderhirn nach Entfernung der pial Membran befestigt. Falls vorhanden, ist es vorzuziehen, die Zerlegung in einem sterilen Dissektion Abzug durchzuführen, obwohl wir ziemlich gute Ergebnisse erzielt haben, wenn Dissektion außerhalb einer Haube durchgeführt wird, solange die Instrumente und die Dissektion Bereich gründlich mit 70 % Ethanol sterilisiert werden .</li>
	<li>Mit einer sterilen transferpipette, sammeln Sie das Vorderhirn in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel HBSS wie möglich nach dem Loslassen der Stücke des Vorderhirns Waschbecken am unteren Rand die Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin/EDTA (vorgewärmt auf 37 ° C) und 15 Minuten bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Mit einer Pasteurpipette, sorgfältig entfernen Sie Trypsin ohne zu stören die Stücke des Gewebes zu und fügen Sie 1 mL Neurobasal Medium. Lassen Sie die Teile des Gewebes sinken nach unten und entfernen Sie das Medium. Wiederholen Sie diese Waschen noch einmal. Dieser Schritt ist die Trypsin/EDTA abwaschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL des Neurobasal Mediums hinzu und starten Sie verreiben. Verreibung beinhaltet unter einer sterilen Pasteurpipette feuerpoliert und übergeben das Gewebe dadurch mehrmals sanft, bis keine weitere Stücke des Gewebes sichtbar sind. Wenn irgendwelche Stücke nach wiederholten Durchläufen zu bleiben, lassen sie sich auf den Boden. Hinweis: Vermeiden Sie Aufschäumen beim verreiben - wenn Schaum bilden, zu stoppen und durch Absaugen entfernen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die neu suspendierten Zellen 01:10 mit Neurobasal Medium und zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau färben und eine Hemocytometer. Mix 50 µL der verdünnten Zellen mit 50 µL Trypan blau-Lösung in eine 0,5 mL Zentrifugenröhrchen. Die Hemacytometer nach Auflegen des Deckglases 10 µL hinzu und zählen Sie die helle klare Zellen (blaue Zellen sind tot und nicht gezählt werden soll). Hinweis: Typische Zelle Zahlen aus einer einzigen E7 optic Tectum Bereich zwischen 1 und 5 x 107 Zellen/mL.</li>
	<li>Platte der dissoziierten Zellen auf ECM MEAs bei einer Dichte von 2.200 Zellen/Quadrat mm beschichtet. Für unser MEA-System entspricht dies etwa 130.000 Zellen pro MEA. Fügen Sie Neurobasal Medium bringen die Lautstärke in der MEA zu 1 mL und MEAs in der CO2 Inkubator über Nacht für Zellhaftung und Neurit Erweiterung (Abbildung 1). Hinweis: Für MEAs aus verschiedenen Bereichen und Elektrode Zahlen, unterschiedlichen Zelldichten könnte versucht werden - in der Regel höhere Zelldichte ergibt größere Netzwerk-Aktivität, sondern führt auch zu kürzeren gelebten Kulturen.</li>
	<li>Fügen Sie am nächsten Tag eine Endkonzentration von 10 µM im Neurobasal Medium aus dem 1 mM bestand in Schritt 1.1 gemacht, um die behandelten MEA BPA hinzu. Das Steuerelement MEA fügen Sie das gleiche Volumen von 10 % Ethanol in (V/V) Wasserlösung hinzu.</li>
	<li>Ersetzen Sie verbrachte Medium mit Neurobasal-haltigem Medium 10 µM BPA jeden zweiten Tag bis 7 Tage in Vitro (7DIV) und jeden Tag danach, als die Netzwerk-Aktivität erhöht. Hinweis: Da die Netzwerk-Aktivität erhöht, erhöht die Stoffwechselaktivität und Medien Änderungen müssen immer häufiger. Lassen Sie sich nicht das Medium Orange drehen.</li>
</ol>3. Aufnahme neuronalen Netzwerk-Aktivität
<ol><li>Am Tag der Übernahme das Kulturmedium mit frischen Neurobasal Medium auszutauschen und CO2 Inkubator für mindestens 2 Stunden vor der Aufnahme die MEAs zurückzukehren. Starten Sie die Aufnahmesoftware und stellen Sie die Temperatur der MEA auf 37 ° C, indem Sie auf das Symbol der Temperatur (ergänzende Abbildung 3.1a-b). Hinweis: Aufnahme kann beginnen so früh wie Tag 3 der Beschichtung und kann fortfahren, solange die Kulturen lebendig sind.</li>
	<li>Richten Sie die Aufnahmeparameter mit der rechten Maustaste auf das Symbol "Muse" (unter Streams im linken Fenster Panel) und wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Spike Detector" und klicken Sie auf "OK" im Pop-up Fenster. "Spike Detector (6 X STD)" erscheinen unter dem Dateinamen (ergänzende Abbildung 3.2a-b).</li>
	<li>Als nächstes klicken Sie rechts auf den Spike-Detektor, wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Burst-Detektor" und klicken Sie auf "OK" im Pop-up Fenster. "Burst Detektor" (ISI) erscheint unterhalb des Muse-Symbols (ergänzende Abbildung 3.3a-b).</li>
	<li>Als nächstes klicken Sie rechts auf Burst-Detektor, wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Neuronale Statistiken Compiler." Sicherzustellen Sie im Pop-up Fenster, dass die Datei-Header, aggregiert auch Statistiken und Synchronität ausgewählt sind. Klicken Sie auf OK. "Statistik-Compiler" erscheint unterhalb (ergänzende Abbildung 3,4-b). Hinweis: Dies setzt das adaptive Schwelle überschreiten (6 X STD Filter), das Inter Spike-Intervall bei 100 ms mit einer minimalen Anzahl von Spikes auf 5, der Mittelwert feuern Rate Erkennung bei 10 s mit Synchronität Parameter bei 20 ms und die minimale spikerate bei 0,083333 Spikes pro Minute.</li>
	<li>Richten Sie die eingeplante Aufzeichnung für die Aufnahmezeit von 5 Minuten (300.000 ms) durch Klicken auf das Uhr-Symbol an der Unterseite. Dies geschieht durch Ändern der Informationen im Abschnitt "Einstellung" alle 5,1 Minuten aufzeichnen und für 5 Minuten aufzeichnen. Dies wird sofort gestartet und wird einmal ausgeführt (ergänzende Abbildung 3.5).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der MEA 37 ° C erreicht hat, vor dem Umzug MEA. Entfernen Sie die MEA aus dem Inkubator zu, legen Sie es auf die Aufnahmeeinheit und Sperren Sie die MEA. Starten Sie die Netzwerk-Aktivität durch Klicken auf den Start-Rekord im Abschnitt programmierte Aufnahme oder das Aufnahmesymbol im Fenster "Wiedergabe". In der Regel genügt eine Aufnahmedauer von 5 Minuten (300.000 ms), obwohl längere Aufnahmen von bis zu 10 Minuten erreicht werden können.</li>
	<li>Nach der Aufnahme der MEA zurück in den Inkubator. Hinweis: Vorsicht ist geboten, Sterilität zu halten und die Zeit zu minimieren, wird die MEA außerhalb des Inkubators.</li>
</ol>(4) Datenanalyse
<ol><li>Analyse der Rohdaten kann offline mit der Recording-Software erledigt werden. Klicken Sie auf das Pulldown-Menü Datei und öffnen Sie Aufnahme. Wählen Sie die raw-Daten-Datei analysiert werden. Wiederholen Sie die raw Aufnahmen um einen erforderlichen Parameter zu erfassen.</li>
	<li>Um die durchschnittliche Anzahl der Spikes zu erhalten, verwenden Sie das Spike-Detektor-Modul und für den Erhalt der Synchrony Index, verwenden Sie das neuronale Statistiken Compiler-Modul.</li>
	<li>Laden Sie die Spike-Detektor, Burst-Detektor und Compiler Statistikmodule als vor (Abschnitt 3).</li>
	<li>Wählen Sie aus den Pulldown-Menüs innerhalb der Spike-Detektor, Burst-Detektor und Statistiken Compiler Modul Windows Spike Liste, Netzwerkliste platzen und erweiterte Metriken, beziehungsweise.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Record-Taste zum Starten der Aufnahme der Datendatei schaffen eine CSV-Datei im Ordner "gerichtet". Die Spike-Parameter - die Gesamtzahl der Spitzen und der Synchrony-Index - werden in der CSV-Datei aufgezeichnet werden. Hinweis: Analyse in Echtzeit während der Aufnahme von raw-Daten wird nicht empfohlen, da dies Prozessorzeit und computational Ressourcen verbrauchen konnte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+agonists,+17+beta-estradiol,+bisphenol+A,+and+diethylstilbestrol,+decrease+cortactin+expression+in+the+mouse+testis.">Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis.</a> Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).</li><li>Dodds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+oestrogens.">Synthetic oestrogens.</a> Br. Med. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Rat+Glioma+Growth,+Invasion,+and+Vascularization+in+a+Novel+Chick+Embryo+Brain+Tumor+Model.">Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li><li>Chiappalone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+cortical+networks+show+spontaneously+correlated+activity+patterns+during+in+vitro+development.">Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development.</a> Brain Res. 93, (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recording+on+multi-electrode+array+reveals+degraded+inhibitory+connection+in+neuronal+network+development.">Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development.</a> Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Phasen des schnellen Wachstums und Entwicklung z. B. Embryogenese sind besonders anfällig für die nachteiligen Auswirkungen der verschiedenen endokrinen Störung Verbindungen einschließlich BPA. Wir bieten ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Auswirkungen von BPA-Exposition in einem in Vitro vertebrate neuronalen Netzwerk-Modell. Unter Verwendung dieses Protokolls, festgestellt wir, dass BPA die spikerate sowie die Synchronität Index in der Entwicklung neuronaler Netzwerke (Abbildung 2a-b senkt).
Unsere Methodik wurde entwickelt, um die BPA-Exposition in der frühen Embryogenese studieren und kann leicht angepasst werden, um die Untersuchung der Auswirkungen von anderen EDZ. Embryonale neuronale Kulturen aus der Küken sind relativ leicht zu schaffen im Vergleich zu anderen vertebrate Modelle, darunter auch die Ratte oder Maus. Darüber hinaus gibt es keine Notwendigkeit, eine separate tierraum – ein einfache Inkubator auf einem Labortisch ist ausreichend, um diese Tests durchzuführen. Wir beschreiben die Verwendung eines Multi-Elektroden-Systems (MEA) für die Beurteilung der Wirkung von EDC, BPA, auf Netzwerk-Aktivität. Die hier beschriebenen Protokolle können mit anderen Systemen angewendet werden. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Sterilität. Dazu gehören Dissektion des Embryos unter sterilen Bedingungen – Sterilisation von Instrumenten mit 70 % Ethanol und sterile Hank ausgewogen Salze Lösung ist ausreichend. Da die Daten über einen Zeitraum von Wochen gesammelt werden, ist es wichtig, sterile Handhabung der MEAs pflegen. Die neuronalen Kulturen einmal etabliert können gezüchtet werden langfristig - bis zu drei Monaten – und eignen sich somit für das Studium Langzeitexposition gegenüber EDZ und anderen Verbindungen auf neuronale Vernetzung. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Zeit zwischen Präparation und Beschichtung. Der optimale Zeitpunkt ist 30 min, einschließlich die Inkubation des Gewebes mit Trypsin. Je länger die Zeit, desto schlechtere das Überleben der Zellen.
Wir beschreiben hier ein einfachen Protokolls, das angewendet werden kann, für die Beurteilung von chemischen oder Medikament, das Verhalten und die neuronale Funktion auswirkt. Hier haben wir eine Zelldichte von 2.200 Zellen pro mm2verwendet; Allerdings kann dies geändert werden und andere Zelldichten eingesetzt werden. Im Allgemeinen haben wir festgestellt, dass Zelldichte Netzwerkaktivität - mehr Spikes in kürzerer Zeit erhöht. Die Methode hat beschrieben, obwohl sehr nützlich bei der Beurteilung der Auswirkungen von Chemikalien auf Netzwerk-Aktivität Einschränkungen. Eine der größten Einschränkungen der Methode ist, dass diese in-vitro-Kulturen zweidimensional die dreidimensionale Architektur des vertebrate Gehirns nicht wiedergibt. Dies kann mithilfe von Slice-Aufnahmen überwunden werden. Eine weitere Alternative bedeutet für die Behandlungen auf sich entwickelnden Küken-Embryos durch Anwenden eines kleinen Fensters Schneiden am breiten Ende des Ei-15, sezieren das Gehirn am Ende der Therapie, dicke Schichten auf eine Vibratome zu machen und setzen auf die MEA für Aufnahme-Netzwerk-Aktivität.
Unser Protokoll gilt, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von endokrine Disruptoren auf die Entwicklung von Netzwerk-Aktivität und die Erforschung einer mechanistischen Basis für die Auswirkungen dieser Chemikalien bietet.

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, gemeinhin als Bisphenol-A oder BPA, Zusatzstoff Anti-Oxidationsmittel findet in einer Vielzahl von Polycarbonat und Epoxy Harz basierte Produkte reichen von Thermopapier, CDs und zertrümmern Beweis Glas auf der Innenseite der Beschichtung Getränkedosen. Obwohl BPA bekannt wurde, dass eine endokrine hormonhemmende Agent zu sein, der Östrogen1imitiert, haben Studien über die negativen Auswirkungen aufgrund der täglichen lässig Exposition gegenüber BPA vor allem in den letzten 10 – 15 Jahren kommen. Selbst geringe Mengen an BPA-Exposition folgen tiefsten in frühen Entwicklungs-Perioden, einschließlich in der Embryogenese durch Exposition von Müttern2,3. In Utero Belastung von weiblichen Embryonen mit endokriner Chemikalien hat auch mit erhöhter Krankheitsanfälligkeit von vaginalen Brust Krebs4,5verbunden worden. Tierstudien haben gezeigt, dass BPA-Exposition zu atypischen Gehirnstruktur und funktionellen Abnormitäten manifestiert sich in Verhalten6führt. Infolgedessen hat die Verwendung von BPA in kleinen Fläschchen durch die Zulassungsbehörden in Europa und Nordamerika, darunter der FDA verboten. Zur Einhaltung der Vorschriften haben viele Hersteller auf 4, 4'-Sulfonyldiphenol oder Bisphenol-S (BPS) umgestellt. Dass BPA und BPS sind strukturelle Analoga und, dass die jüngsten Berichte vergleichbare Wirksamkeit der BPS in Östrogene Transkription7 zeigten, ist es wichtig, die Toxizität dieser zusammengesetzten verwandten BPA zu studieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von BPA (und andere endokrine Disruptoren) auf Netzwerken von Neuronen, die mit einem Wirbeltier-Modell, die Küken-Embryos zu testen. In-vitro- Kulturen von Neuronen bilden synaptischen Kontakte und generieren Aktionspotentiale (Spikes auch genannt). Die spiking Aktivität dieser Kulturen kann mit Multi-Elektroden-Array (MEA) Systemen erfasst werden. Spitzen werden als synchron sein, wenn sie innerhalb von 5 ms voneinander auftreten. Erste zufällige spiking Aktivität, die schließlich synchronisiert ist ein wesentliches Merkmal der Entwicklung neuronaler Netzwerke8,9. Synchronität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden und mehrere Algorithmen werden in der Literatur9,10,11beschrieben. In unseren Analysen verwenden wir einen Algorithmus entwickelt von Paiva und Mitarbeiter12 die Recording-Software integriert ist, das MEA-Erfassungssystem treibt. Die robuste spiking Aktivität embryonalen Küken Neuronen bietet einen Prototyp für die Untersuchung der Wirkung von BPA auf neuronale Aktivität13. Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays zu Rekord spiking Aktivität haben wir beobachtet, dass BPA-Exposition die Entwicklung von neuronalen spiking Synchronität9,14 hemmt. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für BPA-Exposition auf die Küken Embryos Neuronen in der Kultur sowie repräsentative Ergebnisse über die Entwicklung der neuronalen spiking Synchronität in Küken embryonalen Kulturen zu studieren.

<table style="border-collapse:collapse;width:903pt" width="1204">
	<colgroup>
		<col style="width:245pt" width="326" />
		<col style="width:164pt" width="218" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:237pt" width="316" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">#5 foreceps</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl20" style="width:258pt" width="344">11251-10</td>
			<td class="xl20" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Axion Muse MEA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Axion Biosystems</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">M64-GL1-30Pt200</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316">Will be called MEA system in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:245pt;height:31.5pt" width="326">Axis Software</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Axion Biosystems</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" style="width:237pt" width="316">Will be called recording software in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">BPA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">239658-250g</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">curved forceps</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">11272-50</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">EtOH</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">64-17-5</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Fertilized chicken eggs</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">from any local farm or Spafas</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">HBSS</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">14170112</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Hemacytometer</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">&#160;02-671-6</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl22" height="40" style="width:245pt;height:30.0pt" width="326">Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">BD Biosciences</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">356231</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316">Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Neurobasal medium</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">BrainBits</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">Nb4-500</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Neuroexplorer statistical software</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Nex Technologies</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">Neuroexplorer version 5</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Pasteur pipettes</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">&#160;13-678-20A</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">spring scissors</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">15514-12</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Sylgard bottom dissection dishes</td>
			<td class="xl19" style="width:164pt" width="218">Living Systems Instrumentaion</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td class="xl19" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Trypan Blue dye</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">15-250-061</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">15400054</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the effects of endocrine disrupting compounds on the development of vertebrate neural network function using multi-electrode arrays

BIZ-Phenole, wie BIZ-Phenol A (BPA) und BIZ-Phenol-S (BPS), sind Agenten am meisten benutzt in der Produktion von Kunststoffen und zahlreichen Produkten des täglichen Lebens dadurch. Sie werden als endokrine hormonhemmende Verbindungen (EDC) mit Estradiol-ähnliche Eigenschaften klassifiziert. Langfristiger Exposition gegenüber EDZ, selbst bei niedriger Dosierung wurde mit verschiedenen gesundheitlichen Mängel einschließlich Krebs, Verhaltensstörungen und Unfruchtbarkeit, mit größere Anfälligkeit Entwicklungsstörungen zu frühen Zeiten verbunden. Um die Auswirkungen von BPA auf die Entwicklung der neuronalen Funktion zu untersuchen, haben wir eine in-vitro- neuronalen Netzes abgeleitet aus dem frühen Küken embryonalen Gehirn als Vorbild verwendet. Wir fanden, dass die Exposition gegenüber BPA beeinflusst die Entwicklung der Netzwerkaktivität, speziell Spick Aktivität und Synchronisation. Eine Änderung der Netzwerk-Aktivität ist das entscheidende Bindeglied zwischen dem molekularen Ziel eines Medikamentes oder zusammengesetzte und seine Wirkung auf Verhaltensstörungen Ergebnis. Multi-Elektroden sind nützliche Werkzeuge, um die Auswirkungen von Drogen auf Netzwerk-Aktivität in VitroStudie zunehmend. Es gibt mehrere Systeme auf dem Markt und zwar gibt es Schwankungen in der Anzahl der Elektroden, die Art und Qualität der Elektroden-Array und Analysesoftware, die zugrunde liegenden Grundsätze und die Daten ist dasselbe über die verschiedene Systeme. Obwohl derzeit auf Analyse der zweidimensionalen in-vitro- Kulturen beschränkt, werden diese MEA-Systeme verbessert um in Vivo Netzwerkaktivität in Hirnschnitten zu ermöglichen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die embryonale Belichtung und Aufzeichnung von neuronalen Netzwerk-Aktivität und Synchronität sowie repräsentative Ergebnisse.

Wir untersuchten die Wirkung von BPA auf Synchronität Entwicklung in Küken Embryos neuronalen Kulturen. Synchronisation von Spick Aktivität ist ein Indikator für die normale Entwicklung der neuronalen Netzwerke in Vitro. Wenn zwei Spitzen innerhalb von 5 ms voneinander auftreten, gelten sie synchron. In-vitro- neuronale Kulturen zeigen zunächst zufällige spiking Aktivität – Spitzen auftreten nach dem Zufallsprinzip und die Inter Spike-Intervalle zeigen eine normale Verteilung. Als die Kulturen Reifen, spiking Aktivität wird mehr synchronisiert und die Inter Spike-Intervalle konstant sind. Synchrone spiking Aktivität einer Kultur wurde durch die Kreuzkorrelation Analyse der Spike Zeiten abzuleiten ein Synchrony-Index (SI) mit Aufnahme Software12 quantitated. Wir fanden, dass BPA-Exposition Aktivität Netzentwicklung, beeinträchtigt indem spiking Aktivität und die Synchronität Index (Abbildung 2ein und 2 b). Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die schädlichen Auswirkungen von BPA-Exposition auf ein Embryo beeinflusst seine Entwicklung, einschließlich der neuronalen Funktion, die durch Synchronität Entwicklung in Küken Neuronen in Kultur beurteilt werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte vom sezieren von Küken Vorderhirn zur Dissoziation, Beschichtung und die Aufzeichnung der Netzwerkaktivität desdem. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg"> Abbildung 2: (A) die durchschnittliche Anzahl der Spikes ist deutlich niedriger in BPA behandelt E7 Küken Vorderhirn Kulturen im Vergleich zu Kontrolle Kulturen. Die durchschnittliche Anzahl der Spikes wurde mit der Recording-Software extrahiert. Die Mittel (Kontrolle, 14.890 ± 949.0, N = 15 und BPA, 5.624 ± 465,9, N = 22) unterschieden sich signifikant (ungepaarten t-Test, p < 0,0001). (B) die durchschnittliche Synchrony-Index (SI) ist deutlich geringer im BPA behandelt E7 Küken Vorderhirn Kulturen im Vergleich zu Kontrolle Kulturen. Die SI wurde gewonnen mit dem neuronalen Statistiken Compiler-Modul innerhalb der Recording-Software. Die SI-Mittel (Kontrolle, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 und BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) unterschieden sich signifikant (ungepaarten t-Test, p < 0,0001). Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Bewertung der Auswirkungen endokrin wirksamer Verbindungen auf die Entwicklung der Funktion des neuronalen Netzwerks von Wirbeltieren mithilfe von Multielektroden-Arrays | Entwicklungsbiologie | Video

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.

Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

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5.9K Aufrufe.  Delaware State University. Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.

Serie: Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) and the moment of the radiation of Angiosperms. This led to the hypothesis that alterations in GMF polarity may play a role in plant evolution. Here, we describe a method to test this hypothesis by exposing Arabidopsis thaliana to artificially reversed GMF conditions. We used a three-axis magnetometer and the collected data were used to calculate the magnitude of the GMF. Three DC power supplies were connected to three Helmholtz coil pairs and were controlled by a computer to alter the GMF conditions. Plants grown in Petri plates were exposed to both normal and reversed GMF conditions. Sham exposure experiments were also performed. Exposed plants were photographed during the experiment and images were analyzed to calculate root length and leaf areas. Arabidopsis total RNA was extracted and Quantitative Real Time-PCR (qPCR) analyses were performed on gene expression of CRUCIFERIN 3 (CRU3), copper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive Transcription Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), a cytosolic Ascorbate Peroxidase1 (APX1), and NADPH/respiratory burst oxidase protein D (RbohD). Four different reference genes were analysed to normalize the results of the qPCR. The best of the four genes was selected and the most stable gene for normalization was used. Our data show for the first time that reversing the GMF polarity using triaxial coils has significant effects on plant growth and gene expression. This supports the hypothesis that GMF reversal contributes to inducing changes in plant development that might justify a higher selective pressure, eventually leading to plant evolution.

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Entwicklung und Genexpression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...