This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

1. Gründung von Magen Organoide Kultur Hinweis: Dieses Protokoll kann für die Isolierung von Magendrüsen von Maus oder menschlichem Gewebe verwendet werden. Es wird empfohlen, um Gewebe von ca. 1 cm² zu verwenden. Menschlichem Gewebe kann von Magen-Resektionen oder Biopsien erhalten werden. <ol><li> Materialzubereitung Hinweis: Die verwendeten Keller Matrix Matrigel. Halten Sie das Untergeschoss Matrix auf Eis zu allen Zeiten. Bewahren Sie die Keller-Matrix bei -20 ° C und Auftauen auf Eis vor der Verwendung. Grundmedium bezieht sich auf erweiterte DMEM / F12 mit HEPES; eine geeignete Glutaminquelle wie Glutamax und geeignete Antibiotika wie 1x Primocin. Das verwendete Inkubator ist ein Standard-Zellkulturbrutschrank (37 ° C, befeuchteten Atmosphäre, 5% CO 2) <ol><li> Sterilisieren Vorbereitung Utensilien durch Autoklavieren oder mit 100% Isopropylalkohol: scharfen Zangen, Scheren, ein Skalpell und ein Glas-Mikroskopie Objektträger. </li><li> Am Tag vor der Trennung, legen Sie einen 24 well Zellkultur-Platte in den Inkubator. </li><li> Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Bereiten Aliquots von 1 ml bis Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. </li><li> Bereiten Sie 500 ml chelatisierende Puffer und kühl auf Eis. Vorbereitung 1x Puffer aus sterilem destilliertem Wasser mit 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM Saccharose, 54,9 mM D-Sorbitol, 0,5 mM DL-Dithiothreit (Vorsicht), pH 7. Wenn die Planung mehrere Isolierungen, bereiten ein 5-fach konzentrierte Lösung ohne die DL-Dithiothreitol. Sterilfilter der Puffer. Vor der Isolierung, verdünnen das 5x Puffer mit sterilem Wasser auf 1x und fügen DL-Dithiothreitol kurz vor Isolation. </li><li> Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Verwenden Sie kleine Teilmengen und vermeiden Frost-Tau-Zyklen. Functional Wachstumsfaktoren sind von entscheidender Bedeutung für die Ergebnisse. </li><li> Coole Basismedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge bis 46; C. </li><li> Erwärmen weiteres Aliquot Basalmedium auf 37 ° C. </li></ol></li><li> Isolierung von Drüsen <ol><li> Sammeln Sie ca. 1 cm² des Gewebes in eiskaltem Grundmedium. Halten Sie auf Eis, bis Vorbereitung. Während es bevorzugt ist, Gewebe so schnell wie möglich zu verarbeiten, zu speichern Gewebe Medium auf Eis, wenn nötig. </li><li> Legen Sie das Gewebe in einer 10 cm Petrischale und decken Sie es mit kaltem 1x Chelat-Puffer. Durch leichtes hin und her zu waschen. </li><li> Legen Sie das Gewebe in einem trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Pinzette, entfernen Sie vorsichtig den Schleim als auch die Muskelschicht unter einem Stereomikroskop. Durch leichtes Hin- und Herbe Waschen Sie das Gewebe in kaltem 1x chelatbildenden Puffer. </li><li> Zeigen 1 cm 2 Gewebe auf einem neuen, trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Schere schneiden Sie es in 20-50 kleine Stücke von etwa 2-5 mm² groß. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie alle Teile in einen 50-ml-Tube. </li><li> Nehmen Sie eine sterile 10 ml Plastikpipette. Befeuchten Sie die Pipette in 1x chelatbildenden Puffer. Behaltenmit dem gleichen Pipette während des gesamten Verfahrens. </li><li> 10 ml kaltem 1x chelatbildenden Puffer in die 50-ml-Tube. Durch kräftiges und Abpipettieren 10 Mal Waschen der Stücke. Lassen Sie die Stücke zu begleichen. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie waschen (Schritt 1.2.7), bis der Überstand klar ist. Dies dauert ca. 50 bis 100 ml 1x chelatbildenden Puffer für 1 cm² des menschlichen Gewebes. </li><li> Die Gewebestücke in 20 ml 1x chelatbildenden Puffer mit 10 mM EDTA ergänzt bei RT für 10 min unter leichtem Invertieren jedes 2 min inkubiert. Hinweis: Zeit und Temperatur dieser Inkubation kann entweder für Geschwindigkeit und / oder Konservierung von Drüsenarchitektur optimiert werden. Sie können von mehreren Stunden Inkubation bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform bis 5 min bei 37 ° C in einem Schüttler mit 200 Umdrehungen pro Minute liegen. Gute Ausgangspunkte für Maus Magen sind 30 min bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform und für den menschlichen Magen, 10 min bei RT. </li><li> Pipette einmal sanft nach oben und unten mit der 10 ml Pipette. Lassen Sie die piECES zu begleichen. Überstand verwerfen. </li><li> Verwenden der Pipette die Stücke in einen sauberen 10 cm Petrischale. Entfernen Sie die Flüssigkeit. </li><li> Stellen Sie ein Glas Mikroskopie Objektträger auf der Oberseite der Gewebestücke. Beachten Sie die intakte Gewebe unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung. </li><li> Druck auf die Glasobjektträger und Petrischale. Halten Sie beide in der Hand (mit sterilen Handschuhen) und Drücken Sie das Glas mit dem Daumen. Der Rand des Gewebes wird bewölkt angezeigt, dass Drüsen werden aus dem Gewebe freigesetzt. </li><li> Beachten Sie die Freigabe Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung. </li><li> Sammeln Drüsen und Gewebe in 30 ml kaltem Grundmedium. Lassen Sie große Gewebestücke zu begleichen. </li><li> Sammeln Sie den Überstand, der Drüsen in zwei 15-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält isolierten Drüsen. Halten Sie sie auf Eis. </li></ol></li><li> Seeding der Drüsen <ol&gt; <li> Für die Aussaat, halten Keller Matrix eiskalten zu allen Zeiten, so wird es flüssiger zu bleiben. </li><li> Alternative 1: Seed 6 Vertiefungen einer Verdünnungsreihe. <ol><li> Hängen Sie das Pellet in 60 ul Keller Matrix. </li><li> Bereiten 5 sterile 1,5-ml-Röhrchen auf Eis mit jeweils 50 &amp; mgr; l aus Keller Matrix. Transfer 10 ul Drüsen / Keller Matrix Suspension in den ersten 1,5-ml-Tube. Suspend die Drüsen und Transfer 10 ul dieser Lösung auf den nächsten 1,5 ml-Tube. Wiederholen Sie für die nächsten Rohre. </li></ol></li><li> Alternative 2: Pflanzensamen eine berechnete Menge Drüsen pro Vertiefung. Beginnen Sie mit 100 Verschraubungen pro 50 ul Keller Matrix in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. <ol><li> Die pelletierten Drüsen in 10 ml Grundmedium vorsichtig suspendieren. Zeigen 50 ul auf ein sauberes 10 ml Petrischale. Count Anzahl der Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung. </li><li> Berechnen der Konzentration der Drüsen in der Lösung. Übertragen Sie das Volume, contaIns 400 Drüsen auf ein neues 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Fügen Sie 200 ul Keller Matrix und sorgfältig resuspendieren. Halten Sie auf dem Eis. </li></ol></li><li> Nehmen Sie die 37 ° C warme 24-Well-Platte (siehe Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Geben Sie einen Tropfen von 50 ul Drüsen im Keller Matrix in der Mitte des Brunnens. Der Tropfen wird eine Kuppel bilden. </li><li> Die Platte vorsichtig Transfer zurück zum Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie den Keller Matrix verfestigen 10 min. </li><li> Bereiten warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren. <ol><li> Menschennieren: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für menschliche Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 200 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 10, 1 nM Gastrin und 2 uM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM rho-assoziierten Coiled-Coil-bildendes Protein-Serin / Threonin-Kinase<html> Inhibitor (RHOKi). </li><li> Für murine Drüsen: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für Maus Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM Gastrin, 0,5 mM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM RHOKi. </li></ol></li><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. 500 &amp; mgr; l Medium bei allen Wachstumsfaktoren (1.3.6) zu jedem Vorsichtig gut ohne den Keller Matrix zu stören. Setzen Sie ihn wieder in den Inkubator. </li><li> Aktualisieren Sie die Medium 3 mal pro Woche (alle 2-3 Tage). Für erfrischende Medium, entfernen Sie das alte Medium mit dem Verlassen des Tropfen Keller Matrix intakt. Vorsichtig frischen, warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren. Sie RHOKi hinzufügen nicht. RHOKi nur direkt nach dem Aussäen von Drüsen oder nach der Aufspaltung der Organoide (Schritt 2) hinzuzufügen. </li></ol></li></ol> 2. Durchgang des Magen Organoide Kultur Vor Mikroinjektion. ove_content &quot;&gt; Hinweis: Jede Art von organoiden Kultur hat ihre eigenen Verdopplungszeit Maus Darm sowie Magen-Kulturen in der Regel aufgeteilt werden. 1: 5 alle 5-7 Tage menschlichen Darm-Kulturen sind gespalten. 1:. 5 alle 10-12 Tage Menschliche Magen-Kulturen werden im Verhältnis 1: 5 alle 14 Tage Wenn aus einzelnen Zellen initiiert, kann menschlichen Magen Organoide auch nehmen 20 Tage, um richtig zu bilden, ist es ein gutes Zeichen, wenn angehende Strukturen umgeben die zentrale Lumen In diesem Protokoll Organoide sind gespalten... 4-Well-Platten für die Mikroinjektion. Wartung Organoide folgt das gleiche Protokoll, kann aber andere Zellkulturplatte, wie Standard-24-Well-Zellkulturplatten zu verwenden. <ol><li> Materialzubereitung <ol><li> Autoklaven Pasteurpipetten. </li><li> Am Tag vor der Passage, legen Sie ein 4 well Zellkulturplatte im Brutschrank bei 37 ° C. Die 4-Well-Platten haben eine geringe Kanten und ermöglichen Mikromanipulation. </li><li> Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Am Tag der passaging, tauen Keller Matrix auf Eis. </li><li> Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Kühlen Basalmedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C. </li></ol></li><li> Durchgang von Organoide Kulturen <ol><li> Nehmen Sie die Platte mit den Organoide aus dem Inkubator. Entfernen Sie Medium aus einem gut. </li><li> 1 ml kaltem Basalmedium zum Keller Matrix in dem Bohrloch. Unter Verwendung einer 1 ml-Mikropipette, kräftig pipettieren nach oben und unten, bis der Keller-Matrix aufgebrochen. Transfer zu einem 15-ml-Tube. Auf Eis stellen. </li><li> Nehmen Sie ein Glas Pasteurpipette und eine Feuerquelle, wie zB einem Bunsenbrenner. <ol><li> Halten Sie die Spitze der Pipette in das Feuer, bis die Öffnung der Spitze von 1,5 mm bis etwa 0,5 mm (Abbildung 1) verengt. Lassen Sie die Pipette auf RT abkühlen. </li><li> Befeuchten Sie die Pipette in Grundmedium. Ein optimal verengt Pipetten dauern wird, bis das Medium sichtbar langsamer als ein nicht-verengten Pipette, aber es wird immer noch alleow Pipettieren gut. </li></ol></li><li> Nehmen Sie Organoide in der Pipette und kräftig pipettieren 10x auf und ab. Das Brechen der Organoide mit dem Auge beobachtet werden. </li><li> Hinzufügen 9 ml kaltem Basalmedium und Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. </li><li> Vorsichtig verwerfen alle Überstand. Hängen Sie das Pellet in 250 ul Keller Matrix. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen Sie die 37 ° C warme 4 Well-Kulturplatte und einen Tropfen von 50 ul Organoide / Keller Matrix in jeder Vertiefung. </li><li> Übertragen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator. Lassen Sie den Keller Matrix erstarren bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Bereiten geeigneten Medium entweder Maus oder Mensch Organoide wie in Schritt 1.3.6 aufgeführt. </li><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und überlagern Keller Matrix Tropfen mit 500 ul Medium. </li><li> Übertragen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Aktualisieren Sie das Medium 3 mal pro Woche alle 2-3 Tage (siehe 1.3.8.). </li><li> Für das Einfrieren von Organoide, mechantisch stören Organoide wie für die Spaltung in diesem Protokoll beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.5.). Suspendieren die organoiden Fragmente in 500 ml Gefriermedium und frieren bis -80 ° C unter Verwendung von Kryoröhrchen und eines Gefrierbehälters. Für langfristige Lagerung, übertragen Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff. </li><li> Zum Auftauen von Organoide, bereiten die Kulturplatte, Keller Matrix, Wachstumsfaktoren, kalte und warme Medium wie in den Schritten 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 beschrieben. Wärmen Sie das gefrorene Fläschchen mit einem Wasserbad, und Transfer Zellen unmittelbar nach dem Auftauen zu einem 15-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem Grundmedium. Zentrifuge und die Platte, die Zellen wie in 2.2.5 bis 2.2.12 beschrieben. Hinweis: Mikroinjektion von Organoide ist mühsam, aber erlaubt die einzigartige Möglichkeit, die Interaktion in 3D zu studieren. </li><li> Wenn 3D-Studien nicht benötigt werden, Saatgut Organoide in zwei Dimensionen. Dafür stören die Organoide wie in Schritten 2.2.1 bis 2.2.6 festgelegt. In 2250 ul kalten Medium bei allen Wachstumsfaktoren, um 250 ul Keller matrix mit organoiden Fragmente. <ol><li> Seed in 5 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul pro Vertiefung. Medium ändern 3 mal pro Woche, mit sorgfältig nur das Ersetzen der oberen 400 ul, in den Keller-Matrix an der Unterseite der Platte ungestört zu halten. Anmerkung: Organoide wird der Zellkulturplatte zu befestigen und in 2D zu erweitern. Elektronenmikroskopie zeigte, daß die apikale Seite der Zellen Flächen des Mediums in der Vertiefung (Daten nicht gezeigt). </li><li> Vor der Infektion, tauschen alle Medium einschließlich Keller Matrix, damit Bakterien an die Zellen anzuhängen. Ein ähnliches Protokoll wurde auch für eine Infektion mit H. beschrieben worden pylori 14. 2D Zellschichten möglicherweise nicht alle Zelltypen, die in 3D Organoiden vorhanden sind, enthalten. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Mikroinjektion von Organoide Kultur. Hinweis: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien in Organoiden microinject werden. Es kann hilfreich sein, um die Injektion mit Organoide startendie mehr permissive, um die Mikroinjektion sind. So kann beispielsweise der Maus Magen Organoide in sehr großen zystischen Organoide, die einfach zu zielen sind zu wachsen. <ol><li> Materialzubereitung <ol><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare in zwei Injektionsnadeln mit einer Mikropipette Puller, entsprechend der Empfehlung des Herstellers. Die Mikropipette Abzieher wird das Glaskapillare in der Mitte zu erwärmen und wird die Kapillare in zwei Teile zu ziehen, wodurch zwei Glasnadeln. Es ist praktisch, mehrere Nadeln ziehen und speichern sie in einer sauberen Petrischale. </li><li> Auf eine bakterielle Infektion zu ermöglichen, entfernen Sie die Antibiotika aus allen Medien für mindestens 3 mittel Veränderungen (= 1 Woche). Dies wird Antibiotika aus Keller Matrix zu verdünnen. Bei Verwendung eines Bakterienstammes, die resistent gegen ein bestimmtes Antibiotikum, fügen Sie diesen spezifischen Antibiotikum, um Chancen für die Kontamination zu minimieren. </li><li> Bereiten Sie den Arbeitstisch für Mikroinjektionen. Für die Arbeit an verschiedenen biologischen Sicherheitsstufen kann es notwendig sein, um eine Stereo platzierenMikroskop in einer Sterilbank. In diesem Protokoll injizieren H. pylori unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, unter einem Stereomikroskop in einer Sterilbank. </li><li> Kultur die Bakterien nach Standardprotokollen 13,23. </li><li> Um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu schätzen, schätzen, zwei Parameter: die Anzahl der Bakterien und die Anzahl der Zellen pro organoiden wie unten beschrieben. Das Innenministerium kann mit den Ergebnissen zu korrelieren, beispielsweise mit Gastgeber IL-8-mRNA-Expression 13. <ol><li> Um die Bakteriendichte in der Infektionslösung zu berechnen, zuerst anhand einer Standardkurve der optischen Dichte und der koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Standardprotokollen 24. Eine optische Dichte von 0,1 bei 550 nm sollte bei etwa 10 7 CFU / ml zu ergeben. </li><li> Um die Anzahl der Zellen pro organoiden schätzen, zählen Anzahl von Organoide in 1 gut. Disrupt Organoide wie in den Schritten umrissen 2.2.1-2.2.4. Nach Zentrifugation 5 Minuten lang bei 200 × g und 4 ° C,1 ml enzymatische Dissoziationslösung und resuspendieren. <ol><li> Inkubieren bei 37 ° C unter mehrmaliges Schütteln für 5-10 min. Bestimmen, ob die Zellen in einzelne Zellen unter dem Mikroskop (inverses Mikroskop wie Leica DMIL bei 10-facher Vergrößerung) dissoziiert. Bei Bedarf verlängern die Inkubationszeit. </li><li> Graf Zellen pro organoiden mit einer Zählkammer und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro organoiden. Menschlichen Magen Organoide mit einem Durchmesser von etwa 200 um in etwa 4.000-Zellen. Injektion von 0,2 ul einer Bakterienlösung mit 1 x 10 9 Bakterien pro ml zu einer ungefähren MOI von 50. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Die Injektion von Organoide. Anmerkung: Für die Mikroinjektion wird die Glas Nadel in einem Halter, der in 3 Dimensionen durch einen Mikromanipulator manövriert werden kann stabilisiert. Organoide bleiben im Keller Matrix innerhalb des Bohrlochs. Abhängig von der Größe und Positionierung in der gut, nicht alle sind gleichermaßen Organoide einmEnable zur Injektion. In der Regel lassen sich die 30 größten Organoide in einem gut in 5 min ausgerichtet sein. <ol><li> Ernte-Bakterien und waschen Sie sie in Basismedium nach Standardprotokollen 24. </li><li> Berechnung der Anzahl der Bakterien pro ml nach der optischen Dichte (siehe Schritt 3.1.5.1). Verdünnen der Bakterien bis 1 x 10 9 Bakterien pro ml in Basalmedium. </li><li> Nehmen Sie ein Glas Nadel. Mit einer Pinzette brechen Sie die Spitze, so dass die Öffnung ungefähr 10 &amp; mgr; m breit sein. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Injektionshalter und fixieren Sie sie mit dem Mikromanipulator. </li><li> Nehmen Sie etwa 10 &amp; mgr; l Bakterienlösung in die Nadel. </li><li> Legen Sie eine 4-Well-Platte mit niedrigen Kanten enthält organoide Kulturen unter dem Stereomikroskop. </li><li> Navigieren mit dem Mikromanipulator, gezielt eine einzelne Organoide mit der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in der Nähe des organoiden und legen Sie die Nadel in die organoiden mit einer schnellen Bewegung. Injizieren approximately 0,2 ul Bakterienlösung in jede organoiden mit der Mikroinjektor. </li></ol></li><li> Ernte Organoide für jede Analyse. <ol><li> Wie beispielsweise zu beheben Organoide nach 4 h. Überstand entfernen und 1 ml 2% Formaldehyd und Inkubation 20 min bei RT oder O / N bei 4 ° C. Organoide kann für die Immunhistochemie nach Standardverfahren 25 verarbeitet werden. </li></ol></li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Models+of+Human+and+Mouse+Ductal+Pancreatic+Cancer.">Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+single-cell+imaging+of+NF-kappaB+oscillations+using+monoclonal+cell+lines.">High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines.</a> BMC cell. 11, 21 (2010).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Helicobacter+Species.">Laboratory Maintenance of Helicobacter Species.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2006).</li><li>Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+lacking+the+Math1+tumour+suppressor+are+refractory+to+Notch+inhibitors.">Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors.</a> Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Video+Protocol+of+Retroviral+Infection+in+Primary+Intestinal+Organoid+Culture.">A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Stange, D. E., Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

Die Studie von Erregern beruht auf adäquate Modellsysteme, um die in vivo-Infektion nachahmen. Bei einigen Infektionserreger, sind adäquate Modellsystemen fehlt, während einige der verwendeten Systeme sind alles andere als optimal. Ein Beispiel ist der Magen-Bakterium Helicobacter pylori (H. pylori), die ursächlich für die Entwicklung von Magenkrebs in Beziehung steht. Doch in Ermangelung eines geeigneteren Zellkultursystem, viele Studien, die darauf abzielen, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krebsentstehung Verwendung Krebszelllinien, die den Endpunkt der Krebskaskade darstellen zu analysieren. Primäre, nicht-transformierten Zellen wäre ein besseres Modell für diese Studien. Jedoch sind primäre Zellen, die nur von einer kleinen Anzahl von Gebern zur Verfügung und können nicht über längere Zeit kultiviert werden. In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung große Fortschritte gemacht, um neue Quellen für primäre Zellkulturen für die Untersuchung von Infektionsbiologie liefern. Kulturen ausdrei Stammzellquellen verwendet: Embryonale Stammzellen (ESC), induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) oder adulten Stammzellen. Sie sind verwendet worden, um Infektionen mit Viren, wie Cytomegalovirus 1,2 oder Hepatitis C Virus modellieren 3-7, Parasiten wie Plasmodium falciparum 8 oder Toxoplasma gondii 9 und Bakterien, wie Bacterioides thetaiotaomicron 10 oder Salmonella ente 11. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze veröffentlicht worden, um eine Infektion mit H. modellieren pylori mit Organoide von ESC oder iPS-Zellen 12, Maus adulten Stammzellen 21,22 oder menschlichen adulten Stammzellen abgeleiteten 13 - 15. Die Entwicklung von organoiden Kulturen aus adulten Stammzellen stammen aus einer Studie, in der einzelne Stammzellen aus murinen Darmepithel isoliert wurden in eine 3-dimensionale Matrix ausgesät undin Medium, das die Umgebung des Darmstammzellen enthalten EGF mitogen, R-spondin nachgeahmt Wnt-Signalisierung und Noggin zu verbessern, um Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalisierungs 16 hemmen eingebettet. Insbesondere diese Kulturen erfordern keine Co-Kultur mit mesenchymalen Zellen. Unter diesen Bedingungen ist die Stammzellen proliferieren und bilden kleine Strukturen mit Domänen tragende Zellen der Darmkrypten und Domänen, die die Zellen der intestinalen Zotten enthalten. Die Organoide somit selbst zu organisieren, um die in vivo-Situation nachahmt. Heute adulten Stammzellen aus vielen murinen und humanen Geweben kann in vitro und angebaut werden Selbstorganisation Organoide, die ihre in-vivo-Gegenstück, ähnlich wie Dünn- und Dickdarms 17, Magen 13,18, 19,20 Leber, Bauchspeicheldrüse 21 und Prostata 22. Hier bieten wir ein Video-Protokoll zur Kultur Maus oder menschlichen Magen Organoide von adulten Stammzellen cells und microinject sie mit H. pylori. Dieses Protokoll basiert auf früheren Berichten 13,18 berechnet. Diese Methode kann für die Kultivierung und infizieren andere organoide Kulturen wie Darm Organoide angepasst werden.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL, final concentration 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;i A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final concentration 2 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;M, final concentration 1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHOKi Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &#181;g/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10</td>
			<td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic dissociation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell&#174; Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td>biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Neolabs</td>
			<td>2-1033</td>
			<td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Well Multidishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workbench</td>
			<td>Clean Air</td>
			<td></td>
			<td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100T-10</td>
			<td>1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Cag A antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-25766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Dieses Protokoll erlaubt Isolierung von Magendrüsen (Abbildung 2). Drüsen in Keller-Matrix, die als Tropfen aus dem gut verfestigt, wodurch eine 3-dimensionale Rahmen reich an Laminin und Kollagen, damit die Drüsen wachsen zu Organoiden (Figur 3) angeimpft. Organoide beginnen in der Regel als kleine Zysten und innerhalb von 12-16 Tage, zu Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 300 &amp; mgr; m (Abbildung 4) erweitern Sie sie. Einige Organoide wird zystische bleiben,...

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Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K Aufrufe.  University Medical Centre Utrecht. Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Serie: Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

Der Madagaskar Zischen Schabe als Alternative nicht-Säugetier Tiermodell, Virulenz, Pathogenese und Wirksamkeit von Arzneimitteln zu untersuchen

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of secreting proteins into the bloodstream and are easily accessible, making them potentially superior tissue sites for replacement hormone production or vaccination by gene transfer. Suggested methods for gene delivery include transcutaneous injection and retrograde infusion through salivary ducts. We demonstrate how to perform Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) in non-human primates. We describe the important anatomic landmarks including identification of the parotid papilla, an atraumatic method of cannulating and sealing Stensen&#39;s Duct utilizing basic dental tools, polyethylene tubing, and cyanoacrylate, and the appropriate rate of infusion. While this is the least traumatic method of delivery, the method is still limited by the volume able to be delivered (&#60;0.5 mL) and the potential for trauma to the duct and gland. We demonstrate using fluoroscopy that an infusate can be fully delivered into the gland, and further demonstrate by immunohistochemistry the transduction of a typical vector and expression of the delivered gene.

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen&#039;s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Salivary glands have been proposed as a tissue target site for gene therapy, especially in the area of vaccination by gene transfer. We demonstrate gene delivery in a non-human primate model utilizing retrograde parotid infusion.

Retrograde Ohrspeicheldrüseninfusion durch Stensen-Kanal in einem nicht-menschlichen Primaten für vektorierte Genabgabe

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...