This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

1.建立胃化培养的注意：此协议可用于从鼠或人组织胃腺的隔离。它建议使用约1平方厘米的组织。人体组织可以从胃切除术或活组织检查获得。 <ol><li>材料的制备 注意：使用地下室矩阵是基底膜。置于冰上地下室矩阵在任何时候。存储地下室基质在-20℃并在使用前解冻冰上。基础培养基是指高级的DMEM / F12补充有HEPES;适当的谷氨酰胺源如Glutamax的和适当的抗生素，如1×Primocin。所用的培养箱是一个标准的细胞培养孵化器中（37℃，湿润气氛，5％的CO 2） <ol><li>锋利的钳子，剪刀，手术刀和玻璃显微镜载玻片：通过高压灭菌或用100％异丙醇消毒准备餐具。 </li><li>隔离的前一天，放置24 WEL升细胞培养板的孵化器。 </li><li>根据制造商的建议，准备地下室矩阵。准备1毫升等分，以避免反复冻融循环。 </li><li>制成500毫升之螯合缓冲和冷静的冰。制备1×缓冲液从灭菌蒸馏水以5.6毫的 Na 2 HPO 4，8.0毫KH 2 PO 4，96.2毫摩尔NaCl，1.6毫米氯化钾，43.4毫蔗糖，54.9毫D-山梨醇，0.5mM的DL-二硫苏糖醇（注意），pH值7.如果计划数隔离，没有做好准备的DL-二硫5倍浓缩液。无菌过滤器的缓冲器。隔离之前，稀释5倍的缓冲用无菌水，以1x和刚分离之前添加DL-二硫苏糖醇。 </li><li>准备并根据制造商的建议冲淡一切的生长因子。使用小尺寸的等分试样，并避免反复冻融。官能生长因子是对结果的关键。 </li><li>在冰上凉爽基础培养基并冷却离心机到46℃。 </li><li>暖基础培养基的另一等分试样至37℃。 </li></ol></li><li>腺的分离<ol><li>在冰冷的培养基收集大约1平方厘米的组织。置于冰上，直到准备。虽然这是优选尽快处理组织，在介质商店组织在冰上如果必要的。 </li><li>将组织在一个10cm培养皿并用冷的1×螯合缓冲器覆盖。轻轻来回移动清洗。 </li><li>将组织在干燥10cm培养皿。使用镊子，小心地取出在立体显微镜下粘液以及肌肉层。轻轻来回移动用冷1×螯合缓冲器的组织。 </li><li>地点1 平方厘米的组织在一个新的，干燥的10cm培养皿。用剪刀把它切成20-50小块​​约2-5平方毫米大小。 </li><li>使用镊子，将所有片放入5​​0毫升管中。 </li><li>取10ml无菌塑料吸管。潮湿1X螯合缓冲吸液管。保持使用整个过程中同样的吸管。 </li><li>加入10毫升冷的1×螯合缓冲器向50ml管中。通过大力吹打向上和向下10倍洗片。让片安定。去除上清。 </li><li>重复洗涤（步骤1.2.7），直到上清液是明确的。这1平方厘米的人体组织大约需要1个螯合缓冲50-100毫升。 </li><li>孵育组织片在20ml 1×螯合缓冲补充有10毫摩尔EDTA于室温进行10分钟，轻轻颠倒每2分钟。 注意：时间孵育的温度和可为任何一个的速度和/或保存腺体结构的最优化。它们的范围可以从几个小时的孵育在4℃下在滚动平台至5分钟，在37℃，在用200rpm的摇床。很好的出发点为小鼠胃是30分钟，在4℃下在滚动平台和人胃，在室温10分钟。 </li><li>吸取一次轻轻地上下用10毫升吸管。允许PI欧洲经委会的解决。弃去上清液。 </li><li>使用移液管，将片转移到一个干净10cm培养皿。除去液体。 </li><li>放置在组织片的顶部上的玻璃显微镜载玻片上。观察倒置显微镜与放大10倍的细胞培养下的完整的组织。 </li><li>施加压力，在载玻片和培养皿。同时按住手（带无菌手套），并按下玻璃用拇指。所述组织的周缘将出现混浊表明腺体释放出来的组织。 </li><li>观察倒置显微镜与放大10倍的细胞培养下发布的腺体。 </li><li>收集腺体及组织在30毫升冷的基础培养基。让大型组织碎片定居。 </li><li>收集含腺体上清两个15ml试管。 </li><li>离心5分钟，在200×g离心并4℃。弃上清。该颗粒包含分离的腺体。让他们在冰上。 </li></ol></li><li>腺的播种<ol&gt; <li>对于播种，保持地下室矩阵冰冷的时刻，所以它会留液体。 </li><li>方案1：种子6口井的稀释排。 <ol><li>暂停在60微升地下室矩阵的沉淀。 </li><li>准备5无菌1.5毫升管在冰上用每个含有50微升的地下室矩阵。转移10微升腺体/地下室基质悬浮液进入第一1.5毫升管。暂停腺体和转移10微升的该溶液到下一个1.5毫升的试管。重复下一个管。 </li></ol></li><li>选择2：每孔种子腺体的计算量。开始在24孔板的一个孔每50μl地下室矩阵100腺体。 <ol><li>仔细暂停在10ml基本培养基中的沉淀腺体。将50微升放在一个干净的10毫升培养皿。数倒置显微镜与放大10倍的细胞培养下腺体的数量。 </li><li>计算在溶液腺体的浓度。转移体积CONTA插件400腺体到一个新的15ml试管。 </li><li>离心5分钟，在200×g离心并4℃。弃上清，保持管在冰上。加入200μl地下室矩阵，仔细悬浮。置于冰上。 </li></ol></li><li>采取37℃的温水24孔板（见步骤1.1.2）从培养箱。放置一滴50μl的腺体地下室矩阵在阱的中央。液滴就会形成圆顶。 </li><li>板小心地转移回细胞培养孵化器。让地下室矩阵固化10分钟。 </li><li>准备御寒中所有的生长因子。 <ol><li>人类腺：有以下的生长因子对人胃癌组织体补充基础培养基：50毫微克/毫升的EGF，10％的noggin条件培养基，10％的R-spondin1条件培养基，50％的Wnt-条件培养基，200纳克/ ml成纤维细胞生长因子（FGF）10，1nM的胃泌素，和2μMTGFbeta抑制剂和10μMRho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶<html>抑制剂（RHOKi）。 </li><li>对鼠腺：有以下的生长因子对小鼠胃组织体补充基础培养基：50毫微克/毫升的EGF，10％的noggin条件培养基，10％的R-spondin1条件培养基，50％的Wnt-条件培养基，100纳克/毫升FGF10，10nM的胃泌素，0.5毫TGFbeta抑制剂和10μMRHOKi。 </li></ol></li><li>就拿板的孵化器。小心加入所有的生长因子（1.3.6），以每500微升介质良好，无干扰的地下室矩阵。将其放回孵化器。 </li><li>刷新每周介质3次（每2-3天）。对于刷新的媒体，它留下的地下室矩阵的下降完好删除旧的介质。小心地加入新鲜，温暖中所有的生长因子。不要添加RHOKi。只有后腺体播种直接或类器官（步骤2）的分割后添加RHOKi。 </li></ol></li></ol> 2.胃通道化培养的显微注射前。 ove_content“&gt;注：每种类型化培养都有自己的倍增时间小鼠肠道和胃的文化通常被分成1：5每5-7天人类肠道文化被分割1：5每隔10-12天人类胃的文化被分成1：5每14天，如果从单个细胞开始，人类的胃组织体也可能需要20天的正常形成，是一个好兆头，如果崭露头角结构环绕中心腔在这个协议中，类器官被分成。 4孔板用于显微注射。维护组织体遵循相同的协议，但可以使用任何其他的细胞培养板，如标准的24孔细胞培养板。 <ol><li>材料的制备<ol><li>高压灭菌巴氏吸管。 </li><li>一天通道之前，放置4孔细胞培养板在孵化器在37℃。 4孔板具有低边和允许显微操作。 </li><li>根据制造商的建议，准备地下室矩阵。上passagi的天NG，解冻地下室矩阵冰上。 </li><li>准备并根据制造商的建议冲淡一切的生长因子。 </li><li>在冰上凉爽基础培养基并冷却离心机至4℃。 </li></ol></li><li>类器官文化通道<ol><li>就拿板从孵化器中的组织体。从一个孔中取出介质。 </li><li>加入1毫升冷基础培养基，以在阱地下室矩阵。使用1ml微量，大力吸管上下直至地下室矩阵打破。转移到15毫升管。放置在冰上。 </li><li>拿一个玻璃巴斯德吸管，并为本生​​灯火源等。 <ol><li>握住吸管尖在火直到针尖的开口已经从1.5毫米缩小到约0.5毫米（ 图1）。让吸管冷却至室温。 </li><li>潮湿基础培养基的吸管。一个最佳收窄吸管会占用介质明显比未缩小吸管慢，但它还是会所有流移液好。 </li></ol></li><li>拿起类器官中的吸管，大力吸液管10倍上下。的组织体的断裂可通过眼睛观察到。 </li><li>添加9ml冷基础培养基和离心5分钟，在200×g离心并4℃。 </li><li>小心丢弃所有上清。暂停在250微升地下室基质沉淀。置于冰上。 </li><li>以37℃的温水4孔培养板，并放置在每个下降了50微升类器官/地下室矩阵很好。 </li><li>转移板仔细回孵化器。让地下室基质固化，在37℃下进行10分钟。 </li><li>备的小鼠或人类器官适当介质如在步骤1.3.6列出。 </li><li>就拿板的孵化器，并覆盖500微升中每个地下室矩阵下降。 </li><li>板转移到孵化器。 </li><li>刷新介质，每周3次，每2-3天（见1.3.8。）。 </li><li>对于组织体冻结，mechanically破坏类器官如本协议描述的分割（步骤2.2.1-2.2.5）。暂停在500毫升冷冻介质中的组织体碎片和冷冻至-80℃，用冷冻管和冷冻集装箱。对于长期储存，将管转移到液氮中。 </li><li>对于组织体解冻，如步骤1.1.2，1.1.3，1.1.5，1.1.6，1.1.7概述准备培养板，地下室基质，生长因子，冷暖网上平台。解冻到15ml管，用10毫升冷基础培养基后立即暖冷冻瓶使用水浴，和转移的细胞。离心机和板细胞在2.2.5概述为2.2.12。 注：组织体的显微注射是费力，但允许独特的机会来研究互动3D。 </li><li>如果不需要三维研究，种子组织体在两个维度。为此，扰乱类器官如步骤2.2.1到2.2.6布局。所有生长因子加入2250微升冷介质250微升地下室马TRIX与类器官片段。 <ol><li>种子在5个孔24孔板中，每孔500微升。改变介质每周3次，用小心地仅更换上部400微升，以保持基底基质在板不受干扰的底部。 注意：类器官会附着在细胞培养板和扩大在2D。电子显微镜表明，细胞的顶侧面中的孔的介质（数据未显示）。 </li><li>感染前，所有交换介质，包括地下室矩阵，以允许细菌附着到细胞中。类似的协议也被感染描述H.幽门螺杆菌 14。二维的细胞层可以含有不存在于三维组织体的所有细胞类型。 </li></ol></li></ol></li></ol>化培养的3显微注射。 注意：此协议可用于microinject细菌进入组织体。它可能有助于启动注射类器官这是更宽容，以显微注射。例如，鼠标胃组织体可以长到非常大的囊性类器官，很容易的目标。 <ol><li>材料的制备<ol><li>拉玻璃毛细管成使用微量牵拉两个注射针，根据制造商的建议。的微量拉马将加热在中间的玻璃毛细管，将拉毛细管成两部分，从而产生两个玻璃针。它是实用拉几个针，并将它们存储在一个干净的培养皿中。 </li><li>以允许细菌感染，来自所有媒体取出抗生素至少3介质的变化（=一周）。这将稀释从地下室矩阵抗生素。如果使用的细菌菌株是抗特定抗生素，添加该特定的抗生素，以减少造成污染的机会。 </li><li>准备工作台上进行显微注射​​。在不同的生物安全水平工作，可能有必要将一个立体声显微镜无菌工作台内。在这个协议中，注入H.在生物安全级别下的无菌工作台内的立体显微镜2的条件幽门螺旋杆菌 。 </li><li>培养根据标准方法13,23细菌。 </li><li>为了估计感染复数（MOI）的多重性，估计两个参数：细菌的数量和如下所述每类器官的细胞数。教学语言可以与结果相关，例如与用户主机的IL-8的表达13。 <ol><li>来计算细菌密度在感染溶液，首先建立光密度和集落形成单位的根据标准方法24标准曲线（CFU）。 0.1在550nm处的光密度应该产生约10 7 CFU /毫升。 </li><li>来估计每类器官的细胞数，计算在1类器官的数目良好。扰乱类器官如步骤概述2.2.1-2.2.4。后离心5分钟，在200×g离心，4℃，加入1毫升酶解液，重悬。 <ol><li>孵育在37℃，反复振摇5-10分钟。确定是否细胞已（在放大10倍倒置显微镜，如徕卡DMIL）分解成显微镜下的单细胞。如果需要延长孵化。 </li><li>计数使用血球每类器官的细胞，并计算每组织体细胞的数目。人胃组织体的直径为约200μm有大约4,000个细胞。注射0.2微升的细菌溶液每毫升结果1×10 9细菌在50近似MOI。 </li></ol></li></ol></li></ol></li><li>注射组织体。 注意：对于显微注射，玻璃针被稳定在一个保持器，其可以通过显微操作被操纵3维。类器官保持在井的地下室基质内。由于尺寸和定位的好，并不是所有的组织体是同样一个menable注射。通常，在一个良好的30家最大的组织体可以有针对性在5分钟内。 <ol><li>根据标准方案24在基础培养基收获细菌并把它们洗干净。 </li><li>计算每根据光密度毫升细菌的数量（见步骤3.1.5.1）。稀释细菌每毫升1×10 9个细菌在基础培养基。 </li><li>拿一个玻璃针。使用镊子打破尖端，使得开口将约为10微米宽。 </li><li>针插入的注射保持器，并将其固定在微操作器。 </li><li>拿起约10微升菌液进针。 </li><li>将一个4孔培养板，低边包含了体视显微镜下的类器官文化。 </li><li>与显微导航，目标单一类器官用针。定位针靠近类器官，然后将针头插入与一快速运动的组织体。注入approximatel用微量Ÿ0.2微升菌液到每个类器官。 </li></ol></li><li>嘉实类器官的任何分析。 <ol><li>作为例子，4小时后修复类器官。除去上清液，加入1毫升2％的甲醛，并培育20分钟，在室温下或O / N在4℃。组织体可以根据标准程序25进行处理用于免疫组织化学。 </li></ol></li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

病原体的研究依赖于适当的模型系统来模拟体内的感染。对于一些感染剂，适当的模型系统缺乏而一些使用的系统是远非最佳。一个例子是在胃幽门螺杆菌 （ 幽门螺杆菌 ），这是因果相关的胃癌的发展。然而，在不存在一个更合适的细胞培养体系，许多研究旨在分析癌症发展使用癌细胞系的分子机制，这代表了癌变级联的端点。伯，非转化细胞。将这些研究更好的模型。然而，原代细胞仅可从少数献血者的，并且不能在较长的时间周期中培养。近年来，干细胞研究取得了显著的进步，为原代细胞培养感染生物学研究新的来源。 从文化3干细胞来源已被用于：胚胎干细胞（ESC），诱导多能干细胞（IPSC）或成体干细胞。它们已被用于模拟感染的病毒，如巨细胞病毒1,2-或丙型肝炎病毒3 - 7，寄生虫，如恶性疟原虫 8或 弓形虫 9，和细菌，如Bacterioides thetaiotaomicron 10或肠道沙门氏菌 11。最近，一些方法已经被发布到感染H.模型幽门螺杆菌与来自ESC键或iPS细胞12，小鼠成体干细胞21,22或人类成体干细胞衍生的13类器官- 15。 类器官培养物从成体干细胞的发育源自研究，其中单个干细胞从鼠肠上皮分离接种到3维矩阵和嵌入在模仿含有EGF的有丝分裂原，R-脊椎蛋白的肠干细胞的环境，以提高Wnt信号和头蛋白抑制骨形态发生蛋白（BMP）信令16培养基。值得注意的是这些培养不需要共培养间充质细胞。在这些条件下，干细胞增殖并形成小的结构与结构域窝藏肠隐窝的细胞，以及包含肠绒毛的细胞结构域。的组织体从而自我组织以模拟体内情况 。今天，许多鼠和人性化的组织的成体干细胞可以在体外和生长自组织成类器官类似于其在体内对应物，如小肠和结肠17，胃13,18，19,20肝，胰腺和21前列腺22。 在这里，我们提供了一个视频协议，以培养小鼠和人胃癌组织体的成体干CELLS和microinject它们与H.幽门螺旋杆菌 。该协议是基于以往的报告13,18。该方法可适于用于培养和感染其他类器官培养物如肠组织体。

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL, final concentration 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;i A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final concentration 2 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;M, final concentration 1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHOKi Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &#181;g/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10</td>
			<td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic dissociation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell&#174; Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td>biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Neolabs</td>
			<td>2-1033</td>
			<td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Well Multidishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workbench</td>
			<td>Clean Air</td>
			<td></td>
			<td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100T-10</td>
			<td>1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Cag A antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-25766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

该协议允许胃腺（图2）的隔离。腺接种入地下室矩阵，它凝固成内井降，提供一个三维框架富含层粘连蛋白和胶原蛋白，以允许腺体生长成组织体（ 图3）。类器官通常开始为小囊肿和内12日至16日，它们扩展成球形的直径为50-300微米（图4）。有些组织体将留囊肿，有的会发展小buddings。后者通常是一个健康的生长培养的标志。在这个协议中一个24孔板的一个?...

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Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

类器官的模型传染病：人类的文化与小鼠胃组织体与幽门螺杆菌的显微注射

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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