Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gastroenterologie über die Auswirkungen der Mitglieder der Mikrobiota, insbesondere die der Gattung Helicobacter, auf Entzündungen und Krebs zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die Untersuchung von Helicobacter-Infektion und seine Auswirkungen auf den Magen unter physiologischen Bedingungen ermöglicht. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Therapien zur Vorbeugung oder Eliminierung von Helicobacter-Infektionen oder deren Folgen, einschließlich Antibiotika, Medikamenten oder Impfstoffen.
Diese Methoden liefern Spezifische Einblicke in die Pathogenese der Helicobacter-Infektion. Jedoch, mehrere der Techniken können an die Untersuchung von anderen Magen-Darm-Erregern angepasst werden. Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird mit der Vorbereitung eines bakteriellen Inokulum in der Lage, eine Infektion bei Mäusen zu etablieren kämpfen.
Es ist zwingend erforderlich, dass die Helicobacter Isolate bekannt sind Maus-kolonisierende Stämme, die nicht umfangreiche Subkultur in vitro durchlaufen haben. Darüber hinaus sollte die Anzahl der In-vitro-Subkulturen für diese Stämme erfasst werden. Fügen Sie 15-Milliliter-Polystyrol-Röhren bakterielle Suspensionen hinzu und übertragen Sie mit einer Kunststoffschlaufe ein 10-bis 20-Mikroliter-Tröpfchen aus jeder Kultur auf einzelne Glasmikroskop-Dias.
Bewerten Sie dann die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Bakterien unter Phasenkontrastmikroskopie bei einer 100-fachen Vergrößerung. Verwenden Sie die H.pylori-Inocula nur, wenn die Mehrheit der Bakterien eine bacilläre Form hat. H.felis Inocula sollte in erster Linie helical-förmige Bakterien enthalten.
Und laden Sie die Inocula in einzelne Einweg- und Ein-Milliliter-Spritzen. Legen Sie jede Spritze mit einer 23-Spur-Nadel aus und verwenden Sie Eine Kunststoff-Paraffinfolie, um einen Einweg-Polyethylenkatheter an jeder Nadel zu befestigen. Als nächstes halten Sie eine sechs bis acht Wochen alte spezifisch pathogenfreie und helicobacterfreie Maus manuell an Hals und Schwanz zurück und legen Sie einen Katheter in die Mitte des offenen Kiefers ein.
Führen Sie den Katheter in einem Kaudal in Richtung der Speiseröhre, den Hals der Maus zu verlängern, um einen einfachen Zugang zum Magen durch die Speiseröhre und weg von der Luftröhre zu ermöglichen, bis der größte oder der gesamte Katheter nicht mehr sichtbar ist und ein Widerstand zu spüren ist. Dann, liefern Sie mindestens ein mal 10 an die fünften Bakterien, um eine optimale Besiedlung und Krankheitspathologie zu gewährleisten. Verwenden Sie am Ende des Experiments eine feine, gekrümmte Schere, um die Bauchhöhle für die Exzision des Magens zu öffnen.
Schneiden Sie den Magen entlang der größeren Krümmung, und waschen Sie das Organ vorsichtig zwei Mal in einem 50-Milliliter-Rohr mit frischem PBS pro Wäsche, um Restnahrung zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche das Gewebe in eine geteerte, sechs Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff legen, um das Nassgewicht aufzuzeichnen. Nach der Abflachung des Magens, bisect die Probe sagittal in zwei gleiche Gewebefragmente, die die Antrum, Körper, und nicht-drüsense Vorstomach Regionen.
Entfernen Sie den nichtdrüsenseen Bereich und wiegen Sie die Hälfte jedes Magens, bevor Sie das Gewebestück in der geeigneten Lösung für die geplante nachgelagerte Analyse aufbewahren. Fügen Sie die andere Hälfte des Magengewebes in ein 15-Milliliter konisches Rohr mit 10% Formalin, Abflachen des Gewebes gegen die Oberseite der Röhren nach 10 Sekunden. Wenn das Gewebe an den Rohrwänden befestigt wurde, tauchen Sie die Proben für mindestens 24 Stunden wieder in das Formalin ein.
Um die Anzahl der lebensfähigen H.pylori im Magen nach der Infektion zu zählen, homogenisieren Magenproben in BHI gespeichert, und führen doppelte serielle Verdünnungen der resultierenden Magenhomogenate in frischer, steriler Brühe. Vorgetrocknete Pferdeblutagar oder HBA, Platten mit zusätzlichen Antibiotika ergänzt in drei oder vier Segmente, und fügen Sie mit einer Anpassung der Miles und Misra Technik 10 bis 100 Mikroliter jedes Magen homogenate Verdünnung auf ein Segment jeder Agarplatte. Die Homogenate mit sterilen Kunststoffschlaufen verteilen und die Platten trocknen lassen.
Legen Sie die Platten dann in eine umgekehrte Position in anaerobe Gasgefäße, die eine Petrischale mit Wasser und eine Gaspackung enthalten. Dann bebrüten die Gläser bei 37 Grad Celsius für vier bis sieben Tage. Wenn Kolonien beobachtet werden können, zählen Sie die Segmente auf, die zwischen 10 und 100 isolierte Kolonien enthalten.
Nach der Euthanasie wird der Magen von den Tieren geerntet und gewogen. Der nichtdrüsensee Bereich wird entfernt, und der Magen ist in zwei gleiche Hälften unterteilt, die das Antrum und den Körper umfassen. Eine erfolgreiche Kolonisation wird in der Regel durch eine lebensfähige Zählung und nachfolgende Aufzählung einzelner Kolonien aus Magenhomogenaten bestätigt, die auf HBA-Platten gestreift sind.
Beachten Sie, dass das Vorhandensein von kontaminierenden Bakterien aus der Magenmikrobiota der Maus oder einer großen Anzahl von H.pylori-Kolonien die Aufzählung von H.pylori KBE erschweren kann. Alternativ kann PCR verwendet werden, um Infektionen mit spezifischen validierten Primern zu überprüfen, die auf eine 325-Basis-Paarregion der H.felis- und H.pylori ureB-Gene gerichtet sind. In diesem repräsentativen Experiment zeigten Wildtyp C57 Black-6-Mäuse moderate Anzeichen einer Entzündung, einschließlich Hyperplasie und Drüsenatrophie bei sechs Monaten nach der Infektion mit H.felis, sowie zelluläre Infiltration der Submucosa.
Schwerere Entzündungen werden bei Knockout-Mäusen gleichzeitig beobachtet, wobei die zusätzliche Anwesenheit von Lymphfollikel in unmittelbarer Nähe der zellulären Infiltrate beobachtet wird. H.felis Bakterien können auch in Giemsa-befleckten Abschnitten des infizierten Mausmagengewebes visualisiert werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie quantitative PCR, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Arten von Wirtsreaktionen zu beantworten, die während einer Helicobacter-Infektion induziert werden.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie und Gastroenterologie, um die ursächliche Rolle von Helicobacter pylori bei Magenerkrankungen beim Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mäuse mit Helicobacter-Arten reproduzierbar infizieren und die mit der Infektion verbundene Pathologie untersuchen können. Vergessen Sie nicht, dass die Helicobacter-Stämme, die in diesem Protokoll verwendet werden, infektiös sind, und daher sollten Standard-Biosicherheitsverfahren immer bei der Arbeit mit diesen Bakterien befolgt werden.
