The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Herstellung von Photoaktive Substrate <ol><li> Vorbereitung einer P3HT: PCBM Lösung (1: 1 w / w) in Chlorbenzol bei einem P3HT Konzentration von 20 g / L. Mische die Lösung mit einem Magnetrührer mindestens 4 Stunden bei 60 ° C. Betrachten wir ein Volumen von 150 ul der Lösung für jedes Substrat hergestellt werden soll. </li><li> Sauberes ITO-beschichtete Glasobjektträger (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, Dicke 170 um) mit aufeinanderfolgenden Bädern von entionisiertem Wasser, Aceton und Isopropanol in ein Ultraschallbad (10 Minuten für jeden Schritt). Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Stickstoff-gun. Setzen Sie die Proben in einem Plasma cleaner bei 100 W Leistung für 10 min. </li><li> Abzuscheiden einen dünnen Film der aktiven Schicht auf den gereinigten Substraten durch Spin-Beschichtung. <ol><li> Mit einer Diamantspitze, schneiden ein Mikroskopglasträger (Dicke ≈ 1 mm), um den gleichen lateralen Abmessungen der ITO-beschichteten Substrate. Entfernen Sie die P3HT: PCBM-Lösung von der Heizplatte und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Stellen Sie eine Zwei-steps Spincoater Programm: i) 30 Sekunden bei 800 Umdrehungen pro Minute; ii) 30 sec bei 1600 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie die Folie auf dem Spannfutter der Spin-Coater und starten Sie das Vakuum, um es zu beheben. Einen Tropfen Aceton auf der Folie und dann das gereinigte Substrat, wobei die ITO-beschichtete Seite nach oben. Starten Sie den Spin-Coater Drehung des überschüssigen Aceton loszuwerden. </li><li> Setzen Sie 150 ul P3HT: PCBM-Lösung auf den Substraten und starten erneut die Spin-Coater (verwenden Sie in 1.3.2 beschrieben das gleiche Protokoll). </li><li> Nach dem Schleuderbeschichtungsvorrichtung beendet ist, entfernen Sie die Probe und vorsichtig lösen das beschichtete Substrat aus dem Glasobjektträger. Reinigen Sie die Rückseite des Substrats mit einer Reinraum-Tupfer in Aceton getaucht. Hinweis: Die photoaktiven Substraten kann für ein paar Tage in einem dunklen Kasten gelagert werden, bis sie verwendet. Für längere Zeiträume, halten sie in einem Handschuhfach mit Inertgas. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Zellkulturmedium Electrophysiology Lösungen <ol><li> Bereiten Sie die komplette Wachstumsmedium (CGM) fürHEK-293-Zellen: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) nicht hitzeinaktiviert, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Sterilisieren des Mediums mit einem 0,2 &amp; mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie den extrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 CaCl 2, 1 MgCl2. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 &amp; mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung der intrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 12 KCl, 125 K-Gluconat, 1 MgCl 2, 0,1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Beachten Sie, dass ATP-Na 2 ist hitzeempfindlich und letzten hinzufügen. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 &amp; mgr; m-Filtersystem, aliquoten in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. </li></ol> 3. Überzug HEK-293 Zellenauf die aktive Untergründe <ol><li> Platzieren des photoaktiven Substrat in einem Becherglas mit Aluminium oder einer verschlossenen Petrischale abgedeckt und in einen Ofen gegeben bei 120 ° C für 2 h zur Sterilisation. Von diesem Zeitpunkt an, führen alle Operationen unter sterilen Bedingungen. Setzen Sie die Proben in einem sterilen Haube und lassen Sie sie abkühlen. </li><li> Beschichten des photoaktiven Substrat mit einer Haftschicht, um die Oberflächenhydrophobie zu vermindern und die Zelladhäsion fördern. <ol><li> Legen Sie die aktiven Substraten in einer P35 Petrischale oder ein 6 Multiwellplatte. Angesichts der Hydrophobie der konjugierten Polymerschicht, stellen ein Polydimethylsiloxan (PDMS) auch, um die Probe zu fixieren und beschränken die Lösungen. <ol><li> Mischungs PDMS und Katalysator in einem 10: 1-Verhältnis mit einem Glasstab, um eine viskose Aufschlämmung zu erhalten. </li><li> Gießen der Aufschlämmung in eine Multiwell-Platte 6, Abgeben einer ausreichenden Menge, um die Hälfte der Vertiefungen bedecken. </li><li> Warten PDMS Polymerisation bei RT. </li><li> Schneiden Sie die gehärtete PDMS in der Mitte für OBTAining eine quadratische Form mit den gleichen Abmessungen der Polymerprobe. </li><li> Sterilisieren PDMS Vertiefungen durch Eintauchen in eine 70% Ethanol-Wasser-Mischung für mindestens 30 min. </li></ol></li><li> Wenn mit den PDMS gut, Kratzer auf der photoaktiven Schicht entlang der gesamten Grenze zwischen dem mit spitzen Pinzette, um die Ablösung der gesamten Schicht zu vermeiden, wenn das Entfernen der PDMS auch nach Zellkultivierung. </li><li> Decken die gesamte Oberfläche jeder Probe mit einer Fibronektin-Lösung (2 mg / l in PBS). Ein Volumen von 500 bis 750 &amp; mgr; l pro Probe ist normalerweise ausreichend, wenn ein PDMS auch verwendet wird (klare Oberfläche der Wanne: 15x15 mm 2). Ohne die PDMS gut, sind notwendig, um die Probe vollständig einzutauchen etwa 2 ml Fibronektin-Lösung; darauf achten, dass das Substrat nicht zu schweben, während die Zugabe der Lösung. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für mindestens 1 Std. </li><li> Entfernen Sie die Fibronektin-Lösung mit einer Glaspipette und einmal mit 2 ml PBS waschen. </li></ol></li><li> Plaß HEK-293-Zellen an Fibronektin behandelten Proben mit einer Dichte von 15.000 Zellen / cm 2 in vollständigem Wachstumsmedium. Verwenden ein Volumen von 750-1.000 ul CGM für jede Probe, ob ein PDMS auch verwendet, ansonsten 2-3 ml CGM notwendig sind. Die Zellen für 24-48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 4. Optische Stimulation Protokoll und elektrophysiologische Messungen <ol><li> Setzen der extrazellulären Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C bis zu thermalisieren; tauen die intrazelluläre Lösung, steckte es in eine 1 ml-Spritze mit einer 34-Gauge-Nadel und halten Sie sie in Kontakt mit Eis, um den Abbau des ATP zu vermeiden. </li><li> Werfen Sie einen Zell beschichtete Substrat aus dem Inkubator, sorgfältig Entfernen der PDMS auch, falls vorhanden. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einer Glaspipette und spülen Sie die Probe mit extrazellulären Lösung. Gehen Sie langsam auf Zellablösung zu vermeiden. </li><li> Legen Sie das Gerät in den Probenhalter des Elektrophysiologie-Station mit extrazellulären solution und die Referenzelektrode. Bereiten Sie frische Glasmikropipetten für Patch-Clamp mit einem Abzieher (ideal Widerstand im Bereich von 2-4 MOhm). Füllen Sie die Hälfte der Pipette mit intrazellulären Lösung und montieren es auf dem Mikromanipulator. </li><li> Suchen Sie nach einer gesunden Zelle, um das Gerät zu patchen. Um unerwünschte Anregung des photoaktiven Substrats zu vermeiden, die IR-Beleuchtung für die Abbildung, indem ein Langwellenlängenpassfilter (zum Beispiel kann ein Kantenwellenlänge λ = 750 nm für Polymere absorbieren im sichtbaren verwendet werden) vor der Mikroskopleuchte. </li><li> Patch die ausgewählte Zelle und wenden das gewünschte Protokoll für optische Stimulation durch Liefern Licht an die Probe über die Fluoreszenzanregung Gang des Mikroskops (1). Eine detaillierte Beschreibung der patch-clamp-Protokoll kann in dem Bezugszeichen 20 festgestellt werden. <ol><li> Positionieren Sie die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe zu der Zellmembran mit einem mikrometrischen Manipulator. Während der Positionierung gelten overpressure auf die Pipette, um Schmutz kleben an der Spitze zu vermeiden. Die Pipette sollte wenige Mikrometer über der Zelle sein. </li><li> Starten Absenken der Pipette auf die Zellmembran, während die Pipette Widerstand auf der Patch-Steuerungssoftware. Wenn die Pipettenwiderstand hat etwa 1 M erhöht wird, entfernen Sie den Überdruck aus der Pipette, während eine sanfte Saugwirkung, um die undurchlässige Verbindung von der Pipette und der Zellmembran bilden (dh, der gemessene Widerstand sollte bei Werten zu erhöhen mehr als 1 G &amp; Omega;) . </li><li> Anwenden eines negativen Potentials an die Pipette in der Nähe der erwarteten Zellenruhepotential (für HEK293-Zelle ein Potential von -40 mV verwendet werden kann), um die Stabilisierung der Dichtung. Kompensation der kapazitiven Transienten aufgrund der Pipette Kapazität mit den relativen Befehle auf der Patch-Verstärker und / oder dem Patchsteuerungssoftware. </li><li> Brechen Sie die Membran in elektrische Zugang zum Zytoplasma der Zelle durch Anlegen eines kurzen und intensiven Saugimpuls ermöglichenan der Pipette. Gesetzt den Patch Verstärker aktuellen Clamp-Modus (I = 0, das heißt, kein Strom in die Zelle injiziert), um den Zellmembranpotential verfolgen. Einige Minuten warten, um zu sehen, wenn die Zellspannung stabil ist. </li><li> Bringen die gewünschten Beleuchtungsablauf zur Zelle und Aufzeichnung der Wirkung auf das Membranpotential. Anmerkung: Die Beleuchtung kann auf die Probe entweder von unten oder von oben zugeführt werden, abhängig von der Mikroskop-Architektur. <ol><li> Wählen einer Anregungswellenlänge, die auch von dem aktiven Material absorbiert wird; für die P3HT: PCBM Mischung kann eine Wellenlänge in dem 450-600 nm-Bereich verwendet werden. Geeignete Photoanregung Dichten liegen im Bereich von 10-100 mW / mm 2. Anmerkung: Kurze Pulse von Licht (unterhalb 10-20 msec) führen zu einer vorübergehenden Depolarisation der Zelle, während bei längerem Beleuchtung (hundert Millisekunden oder mehr Impulse) eine anhaltende Hyperpolarisation beobachtet wird, bis das Licht ausgeschaltet wird. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Kritischen Schritte der gemeldeten Protokoll für in-vitro optische Stimulation von Zellen die Wahl des lichtempfindlichen Polymers, der thermischen Sterilisationsparameter, die Intensität und die Dauer der Lichtreize hauptsächlich betreffen. Eine P3HT: hier wurde PCBM dünnen Film ausgewählt, weil es eine gute zeitliche und elektrochemische Stabilität garantiert. Allerdings sollte man beachten, dass nicht alle lichtempfindliche Polymere können analoge Leistungen insbesondere bei Beleuchtung bieten, 22. Darüber hinaus wird in diesem Fall ausgewählt thermischen Sterilisationsparameter nicht zu beträchtlichen Abbau der Polymeroptoelektronischen Eigenschaften führen; man aber durch den, falls das Sterilisationsverfahren oder dem Wärmebehandlungsparameter geändert werden, möglich, Effekte auf die Polymereigenschaften sollten sorgfältig abgewogen werden. Es ist bekannt, zum Beispiel, dass die UV-Belichtung führt schnell zu irreversiblen Polymer Bleichen und Verschlechterung aufgrund von Verlust der Konjugation. Darüber hinaus verschiedene GlühenTemperaturen und Dauer kann auf verschiedenen morphologischen, um der Polymeroberfläche führen, mit negativen Auswirkungen auf die elektrischen Ladungstransporteigenschaften. Die Parameter der Photoanregung Protokoll sollte sorgfältig geprüft werden, sowie: Anregungsdichten oberhalb von 100 mW / cm 2, und / oder längerer Reize, leicht zu Polymerabbau und Ausfall des Photo Protokoll führen. Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll besteht in der Verwendung einer Protein-Haftschicht, durch die hohe Hydrophobie-Grad des P3HT: PCBM Oberfläche. Wenn keine Haftschicht in der Realisierung des Bio-Polymer-Grenzfläche, Zellbesiedelung und Proliferation eingesetzt könnte ernsthaft beschädigt ist. Innerhalb der oben erwähnten kritischen Schritte und Einschränkungen jedoch das berichtete Protokoll kann ohne weiteres modifiziert werden, je nach den spezifischen experimentellen Anforderungen und Zielen. Andere stabile, lichtempfindliche Polymere, gefunden werden kann, 7 aus mehreren comkommerziellen Lieferanten oder durch geeignete Synthese neuer Verbindungen. Dies ermöglicht die Verwendung von unterschiedlichen Anregungswellenlängen, die sich vom blauen zur roten und NIR-Bereich. Darüber hinaus wird die Polymerabscheidungstechnik nicht auf die Schleuderbeschichtung Verwendung beschränkt. Tatsächlich können auch andere Verfahren Gewährleistung guter Homogenität und geeignete Filmdicke in Betracht gezogen werden, wie Tintenstrahldruck, Sprühbeschichtung oder Beschaufelung Die Auswirkungen der längeren Kontakt mit der Zellkultursubstrate und der Sterilisationsverfahren sollte für jeden neuen Materials ausgewertet werden berücksichtigt. Obwohl die Verwendung von Protein Haftschichten ist notwendig, um eine gute Zellkulturen auf der Oberseite der Polymeroberflächen, die spezifische Verwendung von Fibronektin enthalten, wie hier berichtet, ist nicht zwingend. Verschiedene Adhäsionsprotein Schichten verwendet werden, ebenfalls in Übereinstimmung mit der Zelllinie zu wachsen, 21 sind beispielsweise Nervenzellen in der Regel auf einem Poly-L-Lysin-Schicht gezüchtet. Schließlich können Beleuchtungs Protokolle verändert und angepasst, um specific Bedürfnisse in Bezug auf Wellenlänge, Punktgröße, Stromanregungsdichte, Dauer und Häufigkeit Reize, Lichteinfallsrichtung (aus dem Substrat bzw. aus dem Elektrolyt-Bad). Wie oben kurz erwähnt, aber die Definition der Protokollparameter zu berücksichtigen, die das Polymer optischen Absorptionsbereich und mögliche Abbaueffekte, die eine Menge von Fall zu Fall unterschiedlich sein kann zu nehmen. Die begrenzte zeitliche und elektrochemische Stabilität einiger lichtempfindlichen Polymeren stellt tatsächlich die wichtigsten Grenzen der Technik. Zusätzlich kann die Verwendung von handelsüblichen Polymeren ohne weitere Reinigung in einigen Fällen beschränkt Wiederholbarkeit der Ergebnisse zwischen verschiedenen Chargen des Materials aufgrund unterschiedlicher Reinheitsgrad führt. Wir auch feststellen, dass die genauen Mechanismen auf der Basis des Phototransduktion Wirkung in CSPP Protokolle müssen noch näher erläutert werden und charakterisiert. Thermischen, elektrischen und chemischen phenomena sind möglicherweise beteiligt sind, bei unterschiedlichem Ausmaß in verschiedenen biologischen Modellen. Ein vollständiges Verständnis ist der Schlüssel, um die Technik voll ausschöpfen zu können. Insbesondere sollte das Auftreten von Wärme-vermittelte Phänomene als Einschränkung der Technik im Fall von in vivo-Anwendungen überprüft werden, da sie kaum gesteuert werden kann, und kann eine lokale Überhitzung Wirkungen führen, insbesondere. Eine spezielle Implementierung der Vorrichtung, auf die Kontrolle der Wärmeverteilung in der extrazellulären Umgebung durch die richtige Konstruktion von wärmeleitenden Pfaden ausgerichtet, könnte notwendig in der nächsten Zukunft für die volle Ausnutzung der Technik offenbaren. In der Literatur, verschiedene Techniken, die optische Impulse für die Temperatur-vermittelten Stimulation von Zellen und Geweben zu verwenden, sowohl in-vitro und in-vivo gefunden werden. In diesen Studien wird die Absorption von IR-Laserstrahlen, die durch Wasser in der Regel als Übertragungsmechanismus verwendet wird. 23-25 ​​Bezug auf InfrarotNeuronale Stimulation, hat das CSPP Mechanismus deutliche Vorteile, insbesondere für in-vitro Experimente. CSPP auf Licht im sichtbaren Bereich und mittlerer Intensität basiert, so dass die Stimulation durch den Anregungspfad eines Standard-Fluoreszenzmikroskop zur Verfügung gestellt werden. Im Gegenteil, die Wasserabsorption erfordert Wellenlängen im IR (hauptsächlich um 1,45 &amp; mgr; m und 1,93 &amp; mgr; m), die zu der Probe über externe Quellen, wie optischen Fasern in der Nähe des Vorbereitungs mikromanipulierter zugestellt werden müssen, da die optische Bahn eines Standard Mikroskop kann zu solchen Wellenlängen verwendet werden. Im Fall von CSPP können die mit Laser-Scanning-Systeme sowie die räumliche Lichtmodulatoren erhaltenen Lichtmuster direkt an den Strahlengang der meisten Mikroskope gekoppelt werden. Auf diese Weise kann die Photostimulation von Substraten auf Basis von organischen Halbleitern ist es möglich, die Stimulation von mehreren Zellen in dem Sichtfeld unabhängig zu erhalten, wobei sowohl eine hohe zeitliche<html> nd räumlicher Auflösung. Eine weitere, sehr wertvolle Alternative für die optische Stimulation durch genetische Methoden angeboten werden, basierend auf anzielbare Expression von gentechnisch photoaktivierbare Sonden in Zellen. Optogenetik bietet heutzutage beispiellose zeitliche und räumliche Auflösung, mit typischen Beleuchtungsstärken im Bereich von einigen zehn mW / mm 2, kann sowohl zu erregen und hemmen die elektrische Aktivität und kann genetisch bestimmte Subpopulationen von bestimmten Hirnregionen von Interesse ausgerichtet sein. Allerdings noch stellt sie einige Probleme, die gelöst werden müssen. Insbesondere Sicherheitsbedenken in Bezug auf die Verwendung von Viren zur Genexpression, vor allem bei Menschen, und das Erreichen der stabilen und kontrollierten Langzeit die heterologe Proteinexpression noch stellen die großen Herausforderungen. CSPP Technik erlaubt es, die Notwendigkeit für den Gentransfer und alle damit verbundenen Sicherheitsprobleme, die in-vivo-Anwendungen von besonderer Relevanz sind, zu umgehen. jove_content &quot;&gt; Alles in allem bietet das CSPP Verfahren mehrere Vorteile gegenüber endogenen Phototechniken. Da es nicht invasive, kann es leicht an jede vorhandene elektrophysiologischen Arbeitsstation gekoppelt werden, und es muss nicht komplex Laserquellen oder genetische Transfektion erfordern, während Beibehaltung hoher räumlicher und zeitlicher Selektivität. Aus diesen Gründen hält CSPP Versprechen, ein ergänzendes Instrument in den Neurowissenschaften in-vitro-Untersuchungen jedoch zu werden und neue Perspektiven in der in-vivo-Anwendungen zu öffnen., eine große Anstrengung von der Materialwissenschaften, Physik und Ingenieurwissenschaften Gemeinden wird in den kommenden Jahren, benötigt, um zu suchen, zu optimieren und die Technik voll ausschöpfen zu erwarten.

Die Möglichkeit, die Zellaktivität mit einer präzisen räumlichen und zeitlichen Auflösung Manipulation stellt eine wichtige Strategie in der neurowissenschaftlichen Forschung und bei der Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Störungen. 1 Herkömmliche Verfahren werden auf eine elektrische Stimulation von Zellen unter Verwendung von Elektroden in der Nähe oder in Kontakt mit positioniert basierend die gezielte System, 2, die unterschiedlicher Komplexität sein kann (einzelne Zelle, Mobilfunknetzes, Hirnschnitten, In-vivo-Hirngewebe). Während des letzten Jahrhunderts, haben die Verwendung von Patch-Clamp, Metall und Substrat integrierten Elektroden ein detailliertes Bild von der Physiologie und Pathophysiologie von einzelnen Nervenzellen und der Funktionsmechanismen von neuronalen Netzen zur Verfügung gestellt. Allerdings leidet die elektrische Stimulation von wichtige Einschränkungen. Der erste wird mit einer allgemein schlechten räumlichen Auflösung aufgrund der physikalischen Abmessungen der Elektroden und deren fester Geometrie, die nicht ohne weiteres angepaßt werden kann bezogenenbis hin zu komplexen organisierte Systeme wie biologische Gewebe. Auch kann es zu Problemen mit den Elektroden-Impedanz und des Übersprechens zwischen Stimulations- und Aufzeichnungssysteme aus den Abschluss Signal-Rausch-Verhältnis der Messungen verschlechtert. 3 Auf der anderen Seite kann die Verwendung von Licht zur Anregung helfen, viele Einschränkungen zu überwinden der elektrischen Ansatz. Zunächst einmal bietet sie völlig neue Raum (&lt;1 um) und zeitliche Auflösung (&lt;1 ms), so dass es möglich ist, spezifische Zelltypen oder sogar Unter Zellkompartimente zu zielen. Darüber hinaus ist es sehr nicht-invasive, da es keine physischen Kontakt mit dem Gewebe von Interesse vermeidet und entwirrt Stimulation von Aufnahme. Außerdem kann sowohl der Lichtintensität und der Wellenlänge genau reguliert werden und somit unterschiedlichen Stimulationsprotokolle angewendet werden kann. 3,4 Allerdings wissen die meisten tierischen Zellen nicht vorhanden irgendeine spezifische Lichtempfindlichkeit. Mehrere Strategien für optische stimulation Damit haben vorgeschlagen, entweder in der Nähe oder innerhalb der Zellen auszunutzen lichtempfindliche molekulare Mediatoren oder mit photoaktiven Bauelementes außen gelegt, in der Nähe der Zelle. Die erste Kategorie bezieht sich auf endogene Mechanismen wie die Stimulation über sichtbares oder infrarotes (IR) Licht, wie auch die Verwendung von entweder photoisomerisierbare / photospaltbaren Verbindungen oder die genetische Expression von lichtempfindlichen molekularen Aktuatoren (Optogenetik). Letztere Klasse umfasst Techniken für die exogene Stimulation mit dem Einsatz von anorganischen Nano- / Mikropartikel oder photoleitende Siliziumsubstraten erreicht. 5 Doch alle diese Systeme haben helle Seiten und Nachteile. Insbesondere endogen Absorption von Zellen in dem sichtbaren Bereich schwach und nicht zuverlässig, und die damit verbundene Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies kann schädlich für die Zelle sein. Im allgemeinen wird IR zum Induzieren lokaler thermischer Erwärmung aufgrund der Wasserabsorption verwendet, aber die Extinktionskoeffizienten von Wasser gering ist, so st bedürftigenrong Infrarotlicht (von zehn bis hundert W / mm 2), die schwer über Standard-Mikroskop-Optiken liefern und kann Sicherheitsbedenken für die In-vivo-Anwendungen stellen ist. Auf der anderen Seite, haben photoschaltbare Käfigverbindungen eine zeitlich begrenzte Wirkung und erfordern oft UV-Licht, die schwer zu liefern, ist aufgrund der begrenzten Gewebepenetration. Außerdem leiden sie unter Diffusionsproblemen der aktivierten Verbindungen durch Photolyse außerhalb des beleuchteten Bereichs. Schließlich haben optogenetische Werkzeuge Wissenschaftlern erlaubt, spezifische zelluläre Subpopulation und Unterfächer zielen und sich rasch zu einer der Schlüsseltechnologien in der neurowissenschaftlichen Forschung. , Einsetzen eines exogenen DNA-Segment über einen viralen Vektor wirft jedoch wichtige Fragen der Sicherheit, insbesondere im Hinblick auf die Annahme an menschlichen Patienten. 5,6 Aus diesen Gründen ist die Forschung an neuen Materialien und Vorrichtungen, die Zellenlichtmanipulation ist ein extrem heißes Thema. Kürzlich wurde ein neuartigerAnsatz basierend auf der Verwendung von lichtempfindlichen konjugierter Polymere in der Lage, einen optischen Reizes effizient transduzieren zu einer Modulation der Zell elektrische Aktivität, vorgeschlagen worden. Die Zellstimulation durch Polymer Photoanregung (CSPP) Technik nutzt viele Schlüssel ermöglicht Funktionen typischer organischer Halbleiter: Sie eigen empfindlich auf Licht im sichtbaren Bereich sind; 7 sie biokompatibel, angenehm weich und anschmiegsam sind und deren mechanische Flexibilität ermöglicht eine intime Schnittstelle mit Gewebe sowohl In-vitro- und In-vivo-8-10. Abgesehen davon, können sie leicht funktionalisiert werden, um eine bessere Anpassung an die Schnittstelle mit lebenden Zellen und spezifische Anregung zu ermöglichen, Sondieren und Erfassungsfähigkeiten werden. 11,12 Darüber hinaus unterstützen sie die elektronische als auch Ionentransport, wodurch sie ideal für die Kombination Elektronik ad Biologie. 13,14 Interessant ist, sie in der Photovoltaik-Modus arbeiten kann, wodurch die Notwendigkeit, eine externe Bias-f anwendenoder effiziente Zell optische Stimulation. 15 Die Zuverlässigkeit der CSPP Technik wird bisher in mehreren Systemen bewiesen, einschließlich primären Neuronen, Astrozyten 15,16, 17 sekundäre Zelllinien 18 und explantierten Netzhautgewebe. 16 In dieser Arbeit, alle notwendigen Schritte, um eine lichtempfindliche Biopolymer herzustellen Schnittstelle 19 für optische Stimulation der In-vitro-Systeme sind im Detail beschrieben. Wie eine Studie Fall einer prototypischen organischen Photovoltaik Mischung aus regions regelmäßigen Poly (3-hexylthiophen) (rr-P3HT), der als der Elektronendonor und Phenyl-C61-Buttersäure-Säure-Methylester (PCBM), als amtierender die Elektronenakzeptor verwendet. Wie das biologische System, sind menschliche embryonale Nieren (HEK-293-Zellen) verwendet. Ein Beispiel eines Photo Protokoll mit der relativen Aufnahme von Zellaktivität über elektrophysiologische Messungen vorgesehen. Die beschriebene Plattformist jedoch der allgemeine Gültigkeit, und es kann leicht auf die Verwendung von anderen konjugierten Polymeren ausgedehnt werden (durch geeignetes Einstellen der Lösung Herstellungsverfahren und die Abscheidungsparameter) für unterschiedliche Zelltypen (durch entsprechendes Ändern des Zellkulturprotokoll, Überzug Verfahren und die angeforderte für Zellaussaat und Proliferation) und verschiedene Stimulationsprotokolle (Lichtwellenlänge, Frequenz und Dauer Reize, Photoanregung Dichte).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Zellen können auf P3HT leicht gezüchtet werden: PCBM Substrate, sofern eine geeignete Haftschicht abgeschieden wird (wie das in Schritt 3.2 der beschriebenen Protokoll verwendet Fibronektin). P3HT: PCBM optischen Absorptionsmaxima im grünen Teil des sichtbaren Spektrums; aber andere lichtempfindliche konjugierte Polymere können ausgewählt werden, gemäß der bevorzugten Photowellenlängen-Bereich (Abbildung 2). Biokompatibilität dieser Substrate wurde gezeigt, nicht nur mit Zelllinien 18,21, wie HEK-293, sondern auch mit Primärkulturen von Neuronen und Astrozyten 17 15 Eine typische Mikrograph von gesunden HEK-293-Zellen auf einem P3HT kultiviert. PCBM Film gezeigt wird in 3. Optische Stimulation der Zellen durch die photoaktive Substrate vermittelt kann auf unterschiedliche Effekte auf die Zellmembran 18 beim Einsetzen des Lichtimpulses, die in Abhängigkeit von der Dauer der Lichtreiz., aschnelle Dorn (mit einer Intensität von etwa 3 mV und einer Dauer von etwa 1 ms) in den Zellmembranpotential Aufnahmen (4) beobachtet werden. Dieses Signal ist auf eine kapazitive Ladung der Polymer / Elektrolyt-Grenzfläche, auf die Ladungserzeugungs in dem aktiven Material. Nach dieser anfänglichen schnellen Spiking, wird eine vorübergehende Depolarisation (mit einer Intensität von etwa 1 mV und einer Dauer in der Größenordnung von zehn Millisekunden) in der Zelle (4) beobachtet. Für kurze Lichtimpulse, wenn das Licht ausgeschaltet ist, wird ein entgegengesetztes Verhalten beobachtet. Diese Signale zu einer Variation Membrankapazität aufgrund lokaler Erwärmung folgenden Lichtabsorption zugeschrieben. Für längere Beleuchtungs jedoch die anfängliche Depolarisation während der Lichtpulse wird zu einer Zellhyperpolarisation (Abbildung 5). Dieses Phänomen hat einegewinnen einen thermischen Ursprungs, aber in diesem Fall wird es zu einer Veränderung der Membrangewichtspotential aufgrund einer Änderung in der Ionenkanäle Leitfähigkeiten durch die erhöhte Temperatur induziert verwandt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig1.jpg" /> Figur 1 Skizze der photoaktiven Substrat. Die photoaktiven Schnittstellen für zellulare optische Stimulation verwendet werden, aus einem dünnen Film eines organischen Halbleiter auf einem ITO-beschichteten Glassubstrat abgeschieden ist. Die Zellen können direkt auf die Geräteoberflächen gewachsen, nachdem es mit einem geeigneten Haftschicht (zB Fibronektin) behandelt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig2.jpg" /> Abbildung 2. Absorption<html> Spektren von verschiedenen konjugierten Polymeren. Die Verwendung von dünnen Schichten organischer Halbleiter können große Abstimmbarkeit in Anregungswellenlänge ermöglichen unter Beibehaltung einer teilweisen Durchsichtigkeit des Substrats. Als Beispiel wird die Absorptionsspektren der verschiedenen konjugierten Polymeren in der Regel in der Photovoltaik eingesetzt werden gemeldet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig3.jpg" /> Abbildung 3 HEK-293 Zellen auf einem photoaktiven Substrat kultiviert. Typische mikroskopische Aufnahme von HEK-293-Zellen auf der Oberfläche eines photoaktiven Substrat nach 24 h Inkubation kultiviert. Maßstabsleiste, 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig4.jpg" /> Abbildung 4. Optische Stimulation von HEK-293 Zellen mit 20 msec Lichtimpulse. Variation des Membranpotentials einer HEK-293-Zellen mit einem 20 msec Lichtimpuls hervorgerufen wird. Eine anfängliche schnelle Spitze beim Einsetzen des Lichts wird durch eine Depolarisation der Zelle während des Impulses folgt. Als das Licht ausgeschaltet ist, ein entgegengesetztes Verhalten beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig5.jpg" /> Figur 5. Optische Stimulation von HEK-293-Zellen mit 200 msec Lichtimpulse. Variation des Membranpotentials einer HEK-293-Zelle, die durch ein 200 msec Lichtimpuls hervorgerufen wird. Die für kurze illum beobachtet anfängliche Depolarisationination ist nur ein vorübergehendes Phänomen, das nach einigen zehn Millisekunden längerer Beleuchtung verwandelt sich in eine Hyperpolarisation der Zelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Aufrufe.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Serie: Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Forschung

Genetik

Monitoring the Effects of Illumination on the Structure of Conjugated Polymer Gels Using Neutron Scattering

We demonstrate a protocol to effectively monitor the gelation process of a high concentration solution of conjugated polymer both in the presence and absence of white light exposure. By instituting a controlled temperature ramp, the gelation of these materials can be precisely monitored as they proceed through this structural evolution, which effectively mirrors the conditions experienced during the solution deposition phase of organic electronic device fabrication. Using small angle neutron scattering (SANS) and ultra-small angle neutron scattering (USANS) along with appropriate fitting protocols we quantify the evolution of select structural parameters throughout this process. Thorough analysis indicates that continued light exposure throughout the gelation process significantly alters the structure of the ultimately formed gel. Specifically, the aggregation process of poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) nano-scale aggregates is negatively affected by the presence of illumination, ultimately resulting in the retardation of growth in conjugated polymer microstructures and the formation of smaller scale macro-aggregate clusters.

A protocol for the analysis of gels formed from the optoelectronic conjugated polymer poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) using small and ultra-small angle neutron scattering in both the presence and absence of illumination is presented.

Überwachung der Auswirkungen der Beleuchtung auf die Struktur des konjugierten Polymer-Gel mit Neutronenstreuung

We demonstrate a protocol to effectively monitor the gelation process of a high concentration solution of conjugated polymer both in the presence and ...

Chemie

Fabrication of Polymer Microspheres for Optical Resonator and Laser Applications

This paper describes three methods of preparing fluorescent microspheres comprising &#960;-conjugated or non-conjugated polymers: vapor diffusion, interface precipitation, and mini-emulsion. In all methods, well-defined, micrometer-sized spheres are obtained from a self-assembling process in solution. The vapor diffusion method can result in spheres with the highest sphericity and surface smoothness, yet the types of the polymers able to form these spheres are limited. On the other hand, in the mini-emulsion method, microspheres can be made from various types of polymers, even from highly crystalline polymers with coplanar, &#960;-conjugated backbones. The photoluminescent (PL) properties from single isolated microspheres are unusual: the PL is confined inside the spheres, propagates at the circumference of the spheres via the total internal reflection at the polymer/air interface, and self-interferes to show sharp and periodic resonant PL lines. These resonating modes are so-called "whispering gallery modes" (WGMs). This work demonstrates how to measure WGM PL from single isolated spheres using the micro-photoluminescence (&#181;-PL) technique. In this technique, a focused laser beam irradiates a single microsphere, and the luminescence is detected by a spectrometer. A micromanipulation technique is then used to connect the microspheres one by one and to demonstrate the intersphere PL propagation and color conversion from coupled microspheres upon excitation at the perimeter of one sphere and detection of PL from the other microsphere. These techniques, &#181;-PL and micromanipulation, are useful for experiments on micro-optic application using polymer materials.

Protocols for the synthesis of microspheres from polymers, the manipulation of microspheres, and micro-photoluminescence measurements are presented.

Herstellung von Polymer-Mikrosphären für optische Resonator- und Laseranwendungen

This paper describes three methods of preparing fluorescent microspheres comprising &#960;-conjugated or non-conjugated polymers: vapor diffusion, ...

Ingenieurwesen

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Biochemie

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Biotechnik

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Neurowissenschaften

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...