Name: optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
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The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Preparazione di substrati fotoattivi <ol><li> Preparare una P3HT: soluzione PCBM (1: 1 w / w) in clorobenzene ad una concentrazione di 20 g P3HT / L. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno 4 ore a 60 ° C. Consideriamo un volume di 150 ml di soluzione per ciascun substrato da preparare. </li><li> Pulire vetrini ITO rivestite (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, spessore 170 micron), con bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore (10 min per ogni passo). Asciugare il coprioggetto con una pistola di azoto. Mettere i campioni in un pulitore di plasma a 100 W di potenza per 10 min. </li><li> Depositare un film sottile dello strato attivo sui substrati puliti tramite spin-coating. <ol><li> Con una punta di diamante, tagliare un vetrino da microscopio, (spessore ≈ 1 mm) per le stesse dimensioni laterali dei substrati rivestiti ITO-. Rimuovere il P3HT: soluzione PCBM dalla piastra e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Impostare un due steps programma di spin-coater: i) 30 sec a 800 rpm; ii) 30 sec a 1.600 giri al minuto. Posizionare il vetrino sul mandrino dello spin-verniciatore e avviare il vuoto per risolvere il problema. Mettere una goccia di acetone sul vetrino e quindi il substrato pulito, con il lato ITO rivestito rivolto verso l&#39;alto. Avviare la rotazione di spin-coater per sbarazzarsi di acetone in eccesso. </li><li> Mettere 150 ml di P3HT: soluzione PCBM sui substrati e riprendere lo spin-coater (usare lo stesso protocollo descritto in 1.3.2). </li><li> Dopo lo spin-verniciatore ha finito, rimuovere il campione e staccare con cura il substrato rivestito dal vetrino. Pulire la parte posteriore del substrato con un tampone camera bianca immerso in acetone. Nota: I substrati fotoattivi possono essere conservati per alcuni giorni in una scatola buia fino all&#39;uso. Per periodi più lunghi, tenerli in un cassetto portaoggetti con gas inerte. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di coltura cellulare e Elettrofisiologia Solutions <ol><li> Preparare il terreno di coltura completo (CGM) perCellule HEK-293: Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) termicamente inattivati, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Sterilizzare il mezzo con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione extracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 135 NaCl, KCl 5.4, 5 HEPES, 10 glucosio, 1.8 CaCl 2, 1 MgCl 2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione intracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Si noti che l&#39;ATP-Na 2 è sensibile al calore e aggiungerlo scorso. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron, aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. </li></ol> 3. placcatura cellule HEK-293sui substrati attivi <ol><li> Posizionare il substrato fotoattivi in ​​un bicchiere di vetro rivestito con alluminio o una piastra di Petri chiusa e messo in stufa a 120 ° C per 2 ore per la sterilizzazione. Da questo momento in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. Mettere i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare. </li><li> Coat substrato fotoattivi con uno strato di adesione per ridurre l&#39;idrofobicità superficiale e di promuovere l&#39;adesione cellulare. <ol><li> Posizionare i substrati attivi in ​​una capsula di Petri P35 o un piatto pozzetti 6. Data l&#39;idrofobicità dello strato polimero coniugato, fare un polidimetilsilossano (PDMS) e fissare il campione e confinare le soluzioni. <ol><li> Mescolare PDMS e catalizzatore in 10: 1 proporzione con una bacchetta di vetro per ottenere un impasto viscoso. </li><li> Versare l&#39;impasto in una piastra multipozzetto 6, erogazione quantità sufficiente a coprire la metà di ciascun pozzetto. </li><li> Attendere PDMS polimerizzazione a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare il PDMS curati in mezzo per obtaining una forma quadrata della stessa dimensione del campione di polimero. </li><li> Sterilizzare il PDMS pozzetti per immersione in una miscela etanolo-acqua 70% per almeno 30 min. </li></ol></li><li> Se si utilizza bene le PDMS, graffiare lo strato fotoattivo lungo tutto il bordo del pozzetto con pinzette a punta, in modo da evitare il distacco dello strato intero quando si rimuovono le PDMS bene dopo coltura cellulare. </li><li> Coprire l&#39;intera superficie di ciascun campione con una soluzione di fibronectina (2 mg / L in PBS). Un volume tra 500-750 microlitri per campione è di solito sufficiente se un PDMS pozzo viene utilizzato (chiaro superficie del pozzetto: 15x15 mm 2). Senza le PDMS oltre, sono necessarie per immergere completamente il campione di circa 2 ml di soluzione di fibronectina; prestare attenzione che il substrato non galleggia durante l&#39;aggiunta della soluzione. Incubare i campioni a 37 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Rimuovere la soluzione fibronectina con una pipetta di vetro e lavare una volta con 2 ml di PBS. </li></ol></li><li> Plate cellule HEK-293 sui campioni fibronectina trattata ad una densità di 15.000 cellule / cm 2 in terreno di coltura completo. Utilizzare un volume di 750-1,000 ml di CGM per ciascun campione se un PDMS bene è utilizzato, altrimenti 2-3 ml di CGM sono necessari. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-48. </li></ol> 4. ottico Stimolazione protocollo e misurazioni elettrofisiologiche <ol><li> Mettere la soluzione extracellulare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per thermalize; scongelare la soluzione intracellulare, metterlo in una siringa da 1 ml con un ago calibro 34 e tenerlo a contatto con il ghiaccio per evitare il degrado della ATP. </li><li> Prendete un substrato cellulare rivestito dal termostato, togliendo con cura il PDMS bene se presente. Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta di vetro e risciacquare il campione con una soluzione extracellulare. Procedete lentamente per evitare il distacco delle cellule. </li><li> Mettere il dispositivo nel campione-titolare della stazione di elettrofisiologia con solutio extracellularen e l&#39;elettrodo di riferimento. Preparare micropipette di vetro freschi per patch-clamp con un estrattore (resistenza ideale è nel range 2-4 MW). Riempire la metà della pipetta con la soluzione intracellulare e montarlo sul micromanipolatore. </li><li> Cercare una cellula sana di patch sul dispositivo. Per evitare eccitazione indesiderato del substrato fotoattivi, utilizzare illuminazione IR per l&#39;imaging, ponendo un filtro passa-lunghezza d&#39;onda (ad esempio, un taglio di lunghezza d&#39;onda λ = 750 nm può essere utilizzato per i polimeri che assorbono nel visibile) davanti dell&#39;illuminatore microscopio. </li><li> Patch la cella selezionata e applicare il protocollo desiderato per la stimolazione ottica fornendo luce per il campione attraverso il percorso di fluorescenza di eccitazione del microscopio (Figura 1). Una descrizione dettagliata del protocollo patch-clamp può essere trovato in riferimento 20. <ol><li> Posizionare la pipetta di patch in prossimità della membrana cellulare con un manipolatore micrometrica. Durante il posizionamento, applicare overpressure alla pipetta per evitare incollamenti sporcizia sulla punta. La pipetta deve essere pochi micron sopra la cella. </li><li> Avviare abbassando la pipetta verso la membrana cellulare controllando la resistenza pipetta sul software di controllo patch. Quando la resistenza pipetta è aumentata di circa 1 MW, rimuovere la sovrapressione dalla pipetta durante l&#39;applicazione di una aspirazione delicata, per formare la gigaseal fra la pipetta e la membrana cellulare (cioè, la resistenza misurata deve aumentare a valori superiori a 1 GΩ) . </li><li> Applicare un potenziale negativo per la pipetta vicino alla cella di attesa potenziale di riposo (per HEK293 cella un potenziale di -40 mV possono essere utilizzati) per contribuire a stabilizzare la tenuta. Compensare i transitori capacitivi causa delle capacità di pipetta con i comandi relativi sull&#39;amplificatore cerotto e / o il software di controllo patch. </li><li> Rompere la membrana per consentire l&#39;accesso elettrico al citoplasma cella applicando un impulso di breve e intensa aspirazionealla pipetta. Impostare l&#39;amplificatore patch clamp modalità corrente (I = 0, cioè, senza corrente iniettata nella cellula) per monitorare il potenziale di membrana cellulare. Attendere pochi minuti per vedere se il potenziale cella è stabile. </li><li> Applicare il protocollo illuminazione desiderata per la cella e registrare l&#39;effetto sul potenziale di membrana. Nota: L&#39;illuminazione può essere consegnato al campione sia dal basso o dall&#39;alto, a seconda dell&#39;architettura microscopio. <ol><li> Selezionare una lunghezza d&#39;onda di eccitazione che viene ben assorbita dal materiale attivo; per il P3HT: PCBM miscela, una lunghezza d&#39;onda nell&#39;intervallo 450-600 nm può essere utilizzato. Densità photoexcitation adatti sono nell&#39;intervallo 10-100 mW / mm 2. Nota: impulsi brevi di luce (sotto 10-20 msec) risultato in una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con illuminazione prolungata (centinaia di millisecondi o impulsi più lunghi) una iperpolarizzazione sostenuta si osserva fino a quando la luce è spenta. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Passaggi critici del protocollo riportato in vitro per stimolazione ottica di cellule riguardano principalmente la scelta del polimero fotosensibile, i parametri di sterilizzazione termica, l&#39;intensità e la durata di stimoli luminosi. A P3HT: film sottile PCBM stato selezionato qui, dal momento che garantisce una buona stabilità temporale e elettrochimica. Tuttavia, si dovrebbe notare che non tutti i polimeri fotosensibili in grado di offrire prestazioni analogici, 22 più specificamente su ill...

La possibilità di manipolare l&#39;attività cellulare con una risoluzione spaziale e temporale preciso rappresenta una strategia fondamentale nella ricerca neuroscientifica e nel trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici. 1 metodi tradizionali si basano sulla stimolazione elettrica delle cellule utilizzando elettrodi posizionati in prossimità o in contatto con il sistema mirato, 2 che può essere di diversa complessità (singola cellula, rete cellulare, sezioni di cervello, in vivo tessuti cerebrali). Nel secolo scorso, l&#39;uso di patch-clamp, metallo e elettrodi substrato integrato hanno fornito un quadro dettagliato della fisiologia e fisiopatologia dei singoli neuroni e dei meccanismi di funzionamento delle reti neurali. Tuttavia, la stimolazione elettrica soffre di importanti limitazioni. Il primo è legato a una risoluzione spaziale generalmente scarsa a causa delle dimensioni fisiche degli elettrodi e la loro geometria fissa, che non può essere facilmente adattatoa sistemi organizzati complessi come i tessuti biologici. Inoltre, i problemi relativi alla impedenza elettrodi e di cross-talk tra sistemi di stimolazione e di registrazione possono deteriorare il rapporto finale segnale-rumore delle misurazioni. 3 D&#39;altra parte, l&#39;uso di luce per stimolazione può contribuire a superare molte limitazioni dell&#39;approccio elettrico. Prima di tutto, offre spaziale senza precedenti (&lt;1 um) e risoluzione temporale (&lt;1 msec), rendendo possibile bersaglio specifici tipi cellulari o anche compartimenti sub-cellulari. Inoltre è altamente non invasiva poiché evita qualsiasi contatto fisico con il tessuto di interesse e districa stimolazione da registrazione. Inoltre, sia l&#39;intensità della luce e lunghezza d&#39;onda può essere regolata con precisione e possono essere applicati protocolli di stimolazione così diverse. 3,4 Tuttavia, la maggior parte delle cellule animali non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce. Diverse strategie per stimulatio ottican sono stati quindi proposti, sia sfruttando mediatori molecolari fotosensibili nelle vicinanze o all&#39;interno delle cellule, o utilizzando un dispositivo fotoattivi collocato esternamente, vicino alla cella. La prima categoria si riferisce a meccanismi endogeni come la stimolazione tramite (IR) di luce visibile o infrarossa, così come l&#39;uso di composti photoisomerizable / photocleavable o l&#39;espressione genetica di attuatori molecolari fotosensibili (optogenetics). Quest&#39;ultima categoria comprende tecniche di stimolazione esogena ottenuta con l&#39;uso di nano / micro-particelle inorganiche o substrati di silicio fotoconduttori. 5 Tuttavia, tutti questi sistemi hanno lati luminosi e svantaggi. In particolare, l&#39;assorbimento endogena di cellule nel visibile è debole e non affidabile, e la generazione contemporanea di specie reattive dell&#39;ossigeno può essere dannoso per la cella. In generale, IR viene utilizzato per indurre il riscaldamento termico locale dovuto all&#39;assorbimento di acqua, ma il coefficiente di estinzione dell&#39;acqua è piccola, richiedendo così strong luce infrarossa (da decine a centinaia di W / mm 2) che è difficile da trasportare via ottica microscopio standard e può comportare problemi di sicurezza per le applicazioni in-vivo. D&#39;altra parte, foto-commutabile ingabbiamento composti hanno un&#39;azione limitata tempo e spesso richiedono la luce UV che è difficile da trasportare a causa della penetrazione tissutale limitata. Inoltre essi soffrono di problemi di diffusione dei composti attivati ​​su fotolisi fuori dell&#39;area illuminata. Infine, gli strumenti optogenetic hanno permesso agli scienziati di indirizzare sottopopolazione cellulare specifico e sotto-scompartimenti e stanno rapidamente emergendo come una delle tecnologie chiave nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, l&#39;inserimento di un segmento di DNA esogeno tramite un vettore virale solleva importanti problemi di sicurezza, soprattutto in vista di adozione su pazienti umani. 5,6 Per queste ragioni, la ricerca di nuovi materiali e dispositivi in grado di cellula manipolazione ottica è un argomento estremamente caldo. Recentemente, un romanzo, è stato proposto approccio basato sull&#39;uso di polimeri coniugati fotosensibili, in grado di trasdurre efficientemente uno stimolo ottico in una modulazione di cellula attività elettrica. La stimolazione delle cellule da Polymer fotoeccitazione (CSPP) tecnica sfrutta molte caratteristiche chiave di abilitazione tipico di semiconduttori organici: sono intrinsecamente sensibili alla luce nel campo del visibile, 7 sono biocompatibili, morbida e adattabile e la loro flessibilità meccanica permette un&#39;interfaccia intima con tessuti sia in vitro e in vivo 8-10. Oltre a questo, possono essere facilmente funzionalizzati per meglio adattarsi all&#39;interfaccia con cellule viventi, e per consentire l&#39;eccitazione specifico, sondando e sentendo capacità. 11,12 Inoltre, essi sostengono elettronica e trasporto ionico, che li rende ideali per la combinazione dell&#39;elettronica annuncio biologia. 13,14 interessante, possono lavorare in modalità fotovoltaico, evitando la necessità di applicare una polarizzazione esterna fo la stimolazione ottica cella efficiente. 15 L&#39;affidabilità della tecnica CSPP è già stata dimostrata in diversi sistemi, compresi i neuroni primari, 15,16 astrociti, 17 linee di cellule secondarie 18 e tessuti retinici espiantati. 16 In questo lavoro, tutti i passi necessari per fabbricare un biopolimero sensibile alla luce interfaccia 19 per la stimolazione ottica di sistemi in vitro sono descritte in dettaglio. Come caso di studio, una miscela fotovoltaico organico prototipo di regione-regolare poli (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), che funge da donatore di elettroni, e fenil estere-C61-butirrico acido-metile (PCBM), in qualità di accettore di elettroni è impiegato. Poiché il sistema biologico, sono utilizzati embrionali umane di rene (HEK-293) le cellule. Viene fornito un esempio di un protocollo fotostimolazione con la relativa registrazione dell&#39;attività delle cellule tramite misurazioni elettrofisiologiche. La piattaforma descrittaè tuttavia di validità generale, e può essere facilmente esteso per l&#39;uso di altri polimeri coniugati (regolando correttamente il processo di soluzione preparazione ei parametri di deposizione), diversi tipi di cellule (modificando adeguatamente il protocollo coltura cellulare, placcatura procedura e il tempo richiesto per la semina e la proliferazione delle cellule), e diversi protocolli di stimolazione (lunghezza d&#39;onda della luce, frequenza stimoli e durata, densità fotoeccitazione).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Le cellule possono essere facilmente coltivate su P3HT: substrati PCBM, a condizione che uno strato di adesione è depositato adatto (come la fibronectina utilizzato nel passaggio 3.2 del protocollo descritto). P3HT: PCBM picchi di assorbimento ottico nella parte verde dello spettro visibile; tuttavia altri polimeri coniugati fotosensibili possono essere selezionati, secondo la gamma d&#39;onda fotostimolazione preferita (figura 2). Biocompatibilità di questi substrati ...

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Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

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An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Ricerca

Genetica

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Bioingegneria

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Neuroscienze

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca2+ tramite stimolazione ottica non genetica

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic location. To achieve this, we co-transfected cells with nuclear-targeted cAMP sensors and our laboratory-developed optogenetic protein, bacterial photoactivatable adenylyl cyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, when stimulated with 445 nm light or luciferase substrates, generates adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (cAMP). We employed a solid-state laser illuminator connected to a point scanning system that allowed us to create a grid/matrix pattern of small illuminated spots (~1 &#181;m2) throughout the cytoplasm of HC-1 cells. By doing so, we were able to effectively track the distribution of nuclear-targeted bPAC-nLuc and generate a comprehensive cAMP response map. This map accurately represented the cellular distribution of bPAC-nLuc, and its response to light stimulation varied according to the amount of protein in the illuminated spot. This innovative approach contributes to the expanding toolkit of techniques available for investigating cellular optogenetic proteins. The ability to map its distribution and response with high precision has far-reaching potential and could advance various fields of research.

This protocol involves transfecting cAMP sensors and bPAC-nLuc, an optogenetic protein, to accurately track its cellular distribution and response to light stimulation. The innovative approach of creating a cAMP response map using a point scanning system holds the potential for advancing research with optogenetic proteins in different fields.