Name: optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers at JoVE.com

The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. הכנת מצעי photoactive <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן P3HT: פתרון PCBM (1: 1 w / w) בchlorobenzene בריכוז P3HT של 20 גרם / ליטר. מערבבים את הפתרון עם בוחש מגנטי לפחות 4 שעות ב 60 ° C. שקול נפח של 150 μl של פתרון לכל מצע להיות מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות נקיות מצופה איטו זכוכית (ים R = 10 Ω / מ&quot;ר, 18x18 מ&quot;מ 2, 170 מיקרומטר העובי) עם אמבטיות רצופות של מים ללא יונים, אצטון וisopropanol בsonicator (10 דקות לכל שלב). יבש coverslips עם אקדח חנקן. שים את הדגימות בשואב פלזמה ב 100 כוח W במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד סרט דק של השכבה הפעילה במצעים ניקו באמצעות ספין ציפוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טיפ יהלום, לחתוך שקופיות זכוכית מיקרוסקופ, (עובי ≈ 1 מ&quot;מ) לאותו ממדי רוחב של מצעים מצופים איטו. הסר את P3HT: פתרון PCBM מהפלטה החשמלית ולתת לו להתקרר לטמפרטורת סביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר שני-stתכנית eps ספין coater: i) 30 שניות ב 800 סל&quot;ד; ii) 30 שניות ב1,600 סל&quot;ד. מניחים את השקף על צ&#39;אק של הספין-coater ולהתחיל הוואקום כדי לתקן את זה. לשים טיפה של אצטון בשקופית ולאחר מכן המצע ניקה, עם הצד מצופה איטו יפנה כלפי מעלה. התחל את סיבוב הספין coater להיפטר מעודף אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 150 μl של P3HT: פתרון PCBM על מצעים ולהתחיל שוב את הספין-coater (משתמש באותו הפרוטוקול מתואר ב1.3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספין-coater סיים, להסיר את המדגם ולנתק את המצע המצופה משקופיות הזכוכית בזהירות. נקה את החלק האחורי של המצע עם ספוגית חדר נקי הטבולה באצטון. הערה: מצעי photoactive יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים בקופסא חשוכה עד שימוש. לתקופות ארוכות יותר, לשמור אותם בתא כפפות עם גז אינרטי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת פתרונות תרבית תאים בינוניים ואלקטרופיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום מלא צמיחה (CGM) לHEK-293 תאים: השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) לא לחמם מומת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. לעקר בינוני עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון תאי במי ultrapure (ריכוזים במ&quot;מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 גלוקוז, 1.8 CaCl 2, 1 MgCl 2. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון תאיים במי ultrapure (ריכוזים במ&quot;מ): 12 KCl, 125 K-Gluconate, 1 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. שים לב שה- ATP-Na 2 הוא רגיש לחום ולהוסיף אותו אחרון. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת 0.2 מיקרומטר סינון, aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 3. HEK-293 תאי ציפויעל מצעים הפעילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצע photoactive בכוס זכוכית מכוסה באלומיניום או בצלחת פטרי סגורה ולשים בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לעיקור. מרגע זה ואילך, לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים. שים את הדגימות במנדף סטרילי ולתת להם להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל מצע photoactive עם שכבת הדבקה כדי להפחית את הידרופוביות פני השטח ולקדם הידבקות תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצעים הפעילים בצלחת פטרי P35 או צלחת multiwell 6. בהתחשב בהידרופוביות של שכבת הפולימר מצומדות, לעשות polydimethylsiloxane (PDMS) גם כדי לתקן את המדגם ולהגביל את הפתרונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PDMS וזרז ב- 10: חלק 1 עם מוט זכוכית להשיג slurry צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את slurry בצלחת multiwell 6, מחלק כמות מספקת לכיסוי מחצית מכל הטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לפילמור PDMS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את PDMS נרפא באמצע לobtaining צורת ריבוע של אותו הממד של מדגם הפולימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את בארות PDMS על ידי טבילה בתערובת של 70% אתנול-מים לפחות 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות PDMS גם, לגרד את שכבת photoactive לאורך כל הגבול של היטב עם פינצטה המחודדת, על מנת להימנע מניתוק של כל השכבה בעת הסרת PDMS גם לאחר culturing התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את כל פני השטח של כל דגימה עם פתרון פיברונקטין (2 מ&quot;ג / ליטר בPBS). נפח בין 500-750 μl לדגימה הוא בדרך כלל מספיק אם PDMS גם משמש (משטח ברור של באר: מ&quot;מ 15x15 2). ללא PDMS גם, על 2 מיליליטר של פתרון פיברונקטין נחוץ כדי לטבול את המדגם לחלוטין; לשים לב שהמצע לא לצוף תוך הוספת הפתרון. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון פיברונקטין עם טפטפת זכוכית ולשטוף פעם אחת עם 2 מיליליטר של PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plאכלתי HEK-293 תאים בדגימות שטופל פיברונקטין בצפיפות של 15,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום גידול שלם. השתמש בנפח של 750-1,000 μl של CGM עבור כל דגימה אם PDMS גם משמש, אחרת 2-3 מיליליטר של CGM נחוצים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל24-48 שעות. </li></ol> 4. מדידות אופטיות גירוי פרוטוקול ואלקטרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הפתרון תאי באמבט מים ב 37 ° C לthermalize; להפשיר את הפתרון תאיים, לשים אותו במזרק 1 מיליליטר עם מחט 34 מד ולשמור אותו במגע עם קרח, כדי למנוע השפלה של ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מצע מצופה תא מן החממה, הסרת PDMS בזהירות גם אם קיימים. הסר את מדיום גידול עם טפטפת זכוכית ולשטוף את המדגם עם פתרון תאי. להתקדם לאט, כדי למנוע ניתוק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המכשיר לדוגמה-בעל תחנת אלקטרופיזיולוגיה עם solutio תאיn ואת האלקטרודה ההתייחסות. הכן micropipettes זכוכית הטרי לתיקון מהדק עם חולץ (התנגדות אידיאלית הוא בטווח 2-4 MΩ). מלא חצי של פיפטה עם פתרון תאיים ולהעלות אותו על micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש תא בריא לתיקון במכשיר. כדי להימנע מעירור לא רצוי של מצע photoactive, להשתמש תאורת IR עבור הדמיה, הצבת מסנן ארוך גל לעבור (לדוגמא, λ = 750 ננומטר אורך גל חתך יכול לשמש לקליטת פולימרים בגלוי) מול נורת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון התא הנבחר ולהחיל את הפרוטוקול הרצוי לגירוי אופטי על ידי מתן אור למדגם דרך השביל עירור הקרינה של מיקרוסקופ (איור 1). ניתן למצוא תיאור מפורט של פרוטוקול תיקון מהדק בהתייחסות 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פיפטה התיקון בקרבת קרום התא עם מניפולטור מיקרומטרי. במהלך המיצוב, להחיל overpressurדואר לפיפטה כדי למנוע הידבקות לכלוך על הקצה. פיפטה צריכה להיות כמה מיקרונים מעל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הורדת פיפטה לעבר קרום התא תוך שליטה על התנגדות פיפטה בתוכנת שליטת תיקון. כאשר התנגדות פיפטה גדלה על 1 MΩ, להסיר את לחץ היתר מפיפטה תוך יישום שאיבה עדינה, כדי ליצור את gigaseal בין פיפטה וקרום התא (כלומר, ההתנגדות הנמדדת צריכה להגדיל בערכים גדולים מ -1 GΩ) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פוטנציאל שלילי לפיפטה הקרובה לתא הצפוי פוטנציאל מנוחה (לHEK293 תא פוטנציאל של -40 יכול לשמש mV) כדי לעזור לייצב את החותם. לפצות ארעיים קיבולי בשל קיבול פיפטה עם פקודות יחסי על מגבר התיקון ו / או תוכנת שליטת תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את הקרום כדי לאפשר גישת חשמל לציטופלסמה התא על ידי החלת דופק יניקה קצרה ואינטנסיבילפיפטה. הגדר את מגבר התיקון למצב הנוכחי מהדק (אני = 0, כלומר, ללא נוכחית מוזרק לתוך התא) כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום תא. חכה כמה דקות כדי לראות אם פוטנציאל התא הוא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פרוטוקול התאורה הרצויה לתא ולהקליט את ההשפעה על פוטנציאל הממברנה. הערה: התאורה יכולה להיות מועברת למדגם או מלמטה או מלמעלה, בהתאם לארכיטקטורת מיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גל עירור שנספג היטב על ידי החומר הפעיל; לP3HT: תערובת PCBM, ניתן להשתמש באורך גל בטווח 450-600 ננומטר. צפיפות photoexcitation מתאימה נמצאות ב10-100 mW / מ&quot;מ הטווח 2. הערה: פולסים קצרים של אור (להלן 10-20 אלפיות שנייה) תוצאה בשלילת קוטביות חולפת של התא, ואילו עם תאורה ממושכת (מאות אלפיות שנייה או פולסים ארוכים יותר) hyperpolarization מתמשך הוא ציין עד האור כבוי. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping.">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li><li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology.">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li><li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation:+advances+and+challenges.">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li><li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+Light+on+Living+Cells.">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li><li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+semiconductors+for+artificial+vision.">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li><li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic-based+tristimuli+colorimeter.">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509 (2007).</li><li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+Organic+Electronics+in+Biology:+Materials+and+Devices.">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li><li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroGrid:+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain.">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li><li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold.">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li><li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface.">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li><li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons.">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li><li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rise+of+Organic+Bioelectronics.">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li><li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate:+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering.">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li><li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation.">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li><li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas.">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li><li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films.">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li><li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces.">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li><li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment.">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology.">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li><li>Scarpa, G., Idzko, A. L., G&#246;tz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly(3-hexylthiophene)+Layers+for+Sensing+Applications.">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li><li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+P3HT/Oxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water.">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li><li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo.">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li><li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light.">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שלבים קריטיים של הפרוטוקול דיווח ב- מבחנה גירוי אופטי של תאים בעיקר נוגע לבחירה של הפולימר רגיש לאור, פרמטרים עיקור התרמיים, העצמה והמשך הזמן של גירויי אור. P3HT: סרט דק PCBM נבחר כאן, שכן הוא מבטיח יציבות זמנית ואלקטרוכימיים טובה. עם זאת, יש לשים לב שלא כל הפולימרים הרגישים לאור יכולים להציע הופעות אנלוגיות, 22 באופן ספציפי יותר על תאורה. בנוסף, במקרה זה נבחר עיקור תרמית פרמטרים לא יובילו להשפלה גדולה של תכונות אופטו פולימר; הודעה, עם זאת, במקרה שיטת העיקור או הפרמטרים טיפול התרמיים משתנות, השפעות אפשריות על מאפייני הפולימר יש להעריך בזהירות. זה ידוע, למשל, שהחשיפה לקרינת UV במהירות מובילה להלבנת פולימר בלתי הפיכה והשפלה, כתוצאה מאובדן הצמידה. יתר על כן, חישול שונהטמפרטורות ומשך עלולות להוביל לכדי מורפולוגיים שונה של פני השטח הפולימר, עם השפעות שליליות על נכסי תחבורת מטען החשמליים. הפרמטרים של פרוטוקול photoexcitation יש להעריך בזהירות, כמו גם: צפיפות עירור מעל 100 mW / 2 סנטימטר, ו / או גירויים ממושכים, עלולה בקלות להוביל להשפלת פולימר וכישלון של פרוטוקול photostimulation. עוד צעד קריטי בפרוטוקול מורכב בשימוש בשכבת הדבקת חלבון, כתוצאה ממידת הידרופוביות הגבוהה של P3HT: משטח PCBM. אם אין שכבת הדבקה מועסקת במימוש ממשק יו-פולימר, זריעת תאים וההתרבות עשוי להיות בסכנה ברצינות. בתוך השלבים הקריטיים שהוזכרו לעיל ואילוצים, לעומת זאת, דיווח הפרוטוקול יכול להיות שונה בצורה ישירה, בהתאם לצרכי הניסוי הספציפיים והמטרות. ניתן למצוא פולימרים רגישים לאור אחר יציבים, 7, מכמה commercial ספקים או על ידי סינתזה כראוי תרכובות חדשות. זה מאפשר שימוש באורכי גל עירור שונה, המשתרע מהכחול לאדום הטווח וניר. יתר על כן, הטכניקה בתצהיר הפולימר אינה מוגבלת לשימוש ציפוי ספין. ואכן, ניתן בחזון שיטות אחרות להבטיח אחידות טובה ועובי סרט מתאים, כגון הדפסה בהזרקת הדיו, ציפוי תרסיס, או Blading ההשפעות של המגע הממושך עם תקשורת גוברת התא ושל שיטת העיקור יש להעריך עבור כל חומר חדש נלקח בחשבון. למרות שהשימוש בשכבות הידבקות חלבון יש צורך לקבל תרביות תאים טובות על גבי המשטחים פולימריים, השימוש הספציפי של פיברונקטין, כפי שדווחו כאן, לא חובה. ניתן להשתמש בשכבות חלבון הידבקות שונות, גם בהתאם לקו התא לגדול; 21 לדוגמא, תאים עצביים הם בדרך כלל בתרבית על שכבת פולי-L ליזין. לבסוף, ניתן לשנות פרוטוקולי תאורה ומותאמים לSPצרכי ecific, במונחים של אורך גל, גודל נקודה, צפיפות עירור כוח, משך זמן ותדירות גירויים, כיוון שכיחות אור (מהמצע או מאמבטית אלקטרוליט). כאמור לעיל בקצרה, לעומת זאת, ההגדרה של הפרמטרים הפרוטוקול צריכה לקחת בחשבון את טווח קליטת הפולימר אופטי ואפקטי השפלה אפשריים, אשר עשוי להשתנות הרבה ממקרה למקרה. היציבות הזמנית ואלקטרוכימיים המוגבלת של כמה פולימרים רגישים לאור למעשה מייצגת את המגבלות העיקריות של הטכניקה. בנוסף, שימוש בפולימרים מסחריים ללא כל טיהור נוספת עלולים להוביל במקרים מסוימים לדירות מוגבלות של תוצאות בין קבוצות שונות של החומר, בשל מידת טוהר שונה. כמו כן, אנו מבחינים כי המנגנונים המדויקים בבסיס השפעת phototransduction בפרוטוקולי CSPP עדיין צריכים להיות הובהרו נוסף ומאופיין. ph התרמי, חשמלי והכימיenomena הם אולי מעורב, במידות שונות במודלים ביולוגיים שונים. הבנה מלאה תהיה מפתח לנצל את הטכניקה באופן מלא. בפרט, את התרחשותן של תופעות בתיווך חום צריכה להיבדק כהגבלה של הטכניקה, שכן הוא יכול להיות כמעט בשליטה, ויכולה להוביל להשפעות התחממות יתר מקומיות, בפרט במקרה של יישומי in vivo. יישום ספציפי של המכשיר, שנועד לשלוט בדיפוזיה החום בסביבה תאית על ידי הנדסה נכונה של שבילי חום-מוליך, עלול לחשוף נחוץ בעתיד הקרוב לניצול המלא של הטכניקה. בספרות, בטכניקות שונות המשתמשות בפולסים אופטיים לגירוי בתיווך טמפרטורה של תאים ורקמות, ניתן למצוא גם במבחנה וב- vivo. במחקרים אלה, הקליטה של קרן לייזר IR על ידי מים משמשת בדרך כלל כמנגנון התמרה. 23-25 ​​עם כל הכבוד לאינפרא אדוםעצבי גירוי, יש מנגנון CSPP יתרונות ברורים, במיוחד לניסויים במבחנה. CSPP מבוסס על אור בטווח הנראה לעין ושל עוצמה מתונה, כך שגירוי יכול להיות מסופק על ידי נתיב העירור של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. להיפך, ספיגת מים דורשת אורכי גל בIR (בעיקר סביב 1.45 מיקרומטר ו1.93 מיקרומטר), שצריך להיות מועברים למדגם באמצעות מקורות חיצוניים כמו סיבים אופטיים micromanipulated בקרבתו של ההכנה, מאז הרכבת האופטית של סטנדרטי מיקרוסקופ לא ניתן להשתמש באורכי גל כזה. במקרה של CSPP, דפוסי האור שהושגו עם מערכות סריקת לייזר, כמו גם את מאפנני אור מרחבי יכולים להיות יחד ישירות לרכבת האופטית של רוב המיקרוסקופים. בדרך זו, photostimulation של מצעים המבוסס על מוליכים למחצה אורגניים יכול לעשות את זה אפשרי להשיג גירוי של כמה תאים בשדה הראייה באופן עצמאי, עם שני זמניים גבוהים<html> רזולוציה מרחבית nd. אלטרנטיבה יקרה מאוד אחרת לגירוי אופטי מוצעת על ידי שיטות גנטיות, המבוססת על ביטוי למיקוד של בדיקות גנטית בתאי photoactivatable. Optogenetics מציע כיום רזולוציה של זמן ומרחב חסר תקדים, עם עוצמות תאורה טיפוסיות בטווח של כמה עשרות mW / 2 מ&quot;מ, יכול גם לרגש ומעכבים את פעילות חשמלית, ויכול להיות ממוקד גנטי לתת-אוכלוסיות ספציפיות של אזורים במוח הספציפיים של עניין. עם זאת, זה עדיין מציג כמה בעיות שצריכות לפתור. בפרט, חששות בטיחות בנוגע לשימוש בוירוסים לביטוי גנים, במיוחד בבני אדם, וההישג של ביטוי חלבון Heterologous היציב לטווח ארוך ובשליטה עדיין מייצגים את האתגרים הגדולים. טכניקת CSPP מאפשרת לעקוף את הצורך בהעברת גנים, וכל חששות הבטיחות הקשורים, אשר רלוונטיים במיוחד עבור יישומים ב- vivo. jove_content &quot;&gt; בסך הכל, שיטת CSPP מציע מספר יתרונות ביחס לטכניקות photostimulation אנדוגני. מאז הוא לא פולשנית, זה יכול להיות בשילוב בקלות לכל תחנת עבודה אלקטרו הקיימת והוא אינו דורש מקורות לייזר מורכבים או transfection הגנטי, בעוד ש שמירה על סלקטיביות מרחב ובזמן גבוהה. מסיבות אלה, CSPP טומן בחובו הבטחה להפוך לכלי משלים במדעי מוח ב- מבחנה חקירות, ולפתוח אופקים חדשים ביישומים ב- vivo. עם זאת, מאמץ גדול ממדע, הפיזיקה והנדסת חומרים קהילות צפויות בשנים הקרובות, צריכה לחדד, לייעל ולנצל את הטכניקה באופן מלא.

האפשרות לתפעל את הפעילות הסלולר עם רזולוציה מרחב ובזמן מדויקת מייצגת אסטרטגיה מרכזית במחקר נירולוגית מדעי ובטיפול בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. 1 שיטות מסורתיות מבוססות על גירוי חשמלי של תאים באמצעות אלקטרודות הממוקמים בקרבה או במגע עם המערכת ממוקדת, 2 אשר יכול להיות שונות של מורכבות (תא בודד, רשת סלולרית, פרוסות מוח, ב- vivo רקמות מוח). במאות השנים האחרונות, השימוש בתיקון מהדק, מתכת ואלקטרודות משולבות מצע סיפק תמונה מפורטת של הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של נוירונים בודדים ושל מנגנוני התפקוד של רשתות עצביות. עם זאת, גירוי חשמלי סובל ממגבלות חשובות. הראשון קשורה לרזולוציה מרחבית ירודה בדרך כלל עקב ממדיו הפיזיים של אלקטרודות והגיאומטריה הקבועה שלהם, שלא ניתן להתאים בקלותלמערכות מאורגנות מורכבות כמו רקמות ביולוגיות. כמו כן, בעיות הקשורות לעכבת אלקטרודות ודיבורים צולבים בין מערכות גירוי והקלטה עלולות להידרדר יחס אות לרעש הסופי של המדידות. 3 מצד השני, השימוש באור לגירוי עשוי לעזור להתגבר על מגבלות רבות של גישת החשמל. קודם כל, היא מציעה מרחבי חסרי תקדים (&lt;1 מיקרומטר) ורזולוציה של זמן (אלפיות שנייה &lt;1), מה שמאפשר למקד סוגי תאים ספציפיים או אפילו תאים תת-תא. בנוסף זה מאוד לא פולשנית שכן הוא נמנע מכל מגע פיזי עם הרקמה של עניין ומתיר גירוי מהקלטה. יתר על כן, שתי עוצמת אור באורך גל ויכולים להיות מוסדר דווקא וניתן ליישם פרוטוקולי גירוי כך מגוונים. 3,4 עם זאת, הרוב המכריע של תאים של בעלי חיים אינו מציג שום רגישות ספציפית לאור. כמה אסטרטגיות לstimulatio אופטיn יש לי כך הוצע, או ניצול מתווכים מולקולריים רגיש לאור סמוך או בתוך התאים, או באמצעות מכשיר photoactive להציב חיצוני, קרוב לתא. הקטגוריה לשעבר מתייחסת למנגנונים אנדוגניים כמו הגירוי באמצעות אור נראה או אינפרא אדום (IR), כמו גם השימוש בשני תרכובות photoisomerizable / photocleavable או הביטוי הגנטי של מפעילים רגישים מולקולריים (optogenetics). הכיתה האחרונה כוללת טכניקות לגירוי אקסוגני שהושג עם השימוש של ננו / מיקרו-חלקיקים אורגניים או מצעי סיליקון photoconductive. 5 עם זאת, יש את כל המערכות הללו צדדים וחסרונות בהירים. בפרט, קליטת אנדוגני של תאים בטווח הנראה לעין היא חלשה ולא אמינה, והדור הנלווה של מיני חמצן מגיבים עלולה להזיק לתא. באופן כללי, IR משמש לגרימת חימום תרמי מקומי עקב ספיגת מים, אבל מקדם ההכחדה של מים הוא קטן, ולכן דורש stאור אינפרא אדום רונג (מעשרות עד מאות W / 2 מ&quot;מ) שקשה לספק באמצעות אופטיקה מיקרוסקופ הרגילה ועלולים להוות חששות בטיחות עבור יישומים ב- vivo. מצד השני, יש לי תרכובות כליאת צילום החלפה מוגבלת פעולה בזמן ולעתים קרובות דורשות אור UV שקשה לספק בשל חדירת רקמה מוגבלת. בנוסף הם סובלים מבעיות דיפוזיה של התרכובות מופעלות על photolysis מחוץ לאזור המואר. לבסוף, כלים optogenetic אפשרו למדענים לכוון תת-אוכלוסייה סלולרית ספציפית ותת-תאים והם מתפתחים במהירות כאחת הטכנולוגיות המרכזיות במחקר נירולוגית מדעי. עם זאת, החדרת מקטע DNA אקסוגני באמצעות וקטור ויראלי מעלה סוגיות בטיחות חשובות, במיוחד לאור האימוץ בחולים אנושיים. 5,6 מסיבות אלה, מחקר על חומרים ומכשירים חדשים מסוגלים מניפולציה אופטית תא הוא נושא חם מאוד. לאחרונה, רומןהגישה מבוססת על השימוש בפולימרים מצומדות רגיש לאור, יוכלו transduce גירוי אופטי ביעילות לאפנון של פעילות החשמלית של תאים, הוצעה. גירוי התא על ידי פולימר Photoexcitation (CSPP) טכניקה מנצלת תכונות רבות המאפשרים מפתח האופייני של מוליכים למחצה אורגניים: הם מהותי רגישים לאור בטווח הנראה לעין; 7 הם ביולוגית, רכים וconformable והגמישות המכנית שלהם מאפשרת ממשק אינטימי עם רקמה גם במבחנה וב- vivo 8-10. חוץ מזה, הם יכולים להיות פונקציונליות בקלות טובה יותר להסתגל לממשק עם תאי חיים, ולאפשר לעירור ספציפי, חיטוט וחישת יכולות. 11,12 יתר על כן, הם תומכים אלקטרוניים, כמו גם תחבורה יונית, שהופך אותם אידיאליים לשילוב ביולוגיה מודעת אלקטרוניקה. 13,14 מעניין, הם יכולים לעבוד במצב פוטו, למנוע את הצורך ליישם F הטיה חיצוניאו גירוי אופטי תא יעיל. 15 האמינות של טכניקת CSPP כבר הוכיחה בעבר בכמה מערכות, כוללים נוירונים עיקריים, 15,16 האסטרוציטים, 17 קווים משניים תא 18 ורקמות רשתית explanted. 16 בעבודה זו, בכל הצעדים הדרושים כדי להמציא ביו-פולימר רגיש לאור ממשק 19 לגירוי אופטי של מערכות ב- מבחנה מתואר בפירוט. כמקרה מבחן, תערובת פוטו אורגנית טיפוסית של האזור-רגיל פולי (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), מתפקד כתורם אלקטרונים, ואסתר פניל-C61-butyric-חומצה-מתיל (PCBM), הפועל כ מקבל אלקטרונים הוא מועסק. כמערכת הביולוגית, תאי כליה העוברית אנושי (HEK-293) משמשים. דוגמא לפרוטוקול photostimulation עם ההקלטה היחסית של פעילות תאים באמצעות מדידות אלקטרו מסופקת. הפלטפורמה תיארהעם זאת תוקף כללי, וניתן להאריכה בקלות לשימוש בפולימרים מצומדות אחרים (על ידי התאמת תהליך פתרון ההכנה ופרמטרי התצהיר כראוי), תאים מסוגים שונים (על ידי שינוי כראוי פרוטוקול תרבית תאים, ציפוי הליך ושעה רצוי לזריעת תאים והתפשטות) ופרוטוקולים שונים גירוי (אורך גל אור, תדירות ומשך זמן גירויים, צפיפות photoexcitation).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

תאים יכולים להיות בקלות בתרבית על P3HT: מצעי PCBM, ובלבד ששכבת הדבקה מתאימה מופקדת (כמו פיברונקטין משמש בשלב 3.2 של הפרוטוקול המתואר). פסגות קליטה אופטי PCBM בחלק הירוק של הספקטרום הנראה;: P3HT עם זאת ניתן לבחור פולימרים מצומדות רגישים לאור אחרים, בהתאם לטווח אורכי גל photostimulation המועדף (איור 2). התאמה ביולוגית של מצעים אלה כבר הוכיחה לא רק עם שורות תאים 18,21 כמו HEK-293, אבל גם עם תרבויות עיקריות של נוירונים 15 והאסטרוציטים 17 מיקרוסקופ אופייני של HEK-293 תאים בריאים בתרבית על P3HT:. סרט PCBM מוצג באיור 3. גירוי אופטי של תאים בתיווכו של מצעי photoactive יכול לגרום להשפעות שונות על קרום התא, תלוי בזמן של גירוי האור. 18 עם תחילתה של דופק האור,ספייק המהיר (בעוצמה של mV על 3 ומשך של כ 1 אלפיות שני) ניתן לצפות בהקלטות קרום תא הפוטנציאליות (איור 4). אות זאת בשל טעינת קיבולי של ממשק הפולימר / אלקטרוליט על דור תשלום בחומר הפעיל. לאחר spiking המהיר הראשוני זה, שלילת קוטביות חולפת (בעוצמה של כ 1 mV ומשך בסדר הגודל של עשרות אלפיות השניה) הוא ציינה בתא (איור 4). פולסים קצרים של אור, כמו האור כבוי, התנהגות הפוכה הוא ציין. אותות אלה יוחסו לוריאציה בקיבול קרום עקב חימום המקומי הבא קליטת אור. לתאורה ממושכת, לעומת זאת, שלילת קוטביות הראשונית במהלך הבזקי האור הופכת לhyperpolarization תא (איור 5). לתופעה זו ישלהשיג מקור תרמית, אבל במקרה הזה זה קשור לוריאציה של פוטנציאל שיווי משקל קרום עקב שינוי במוליכות תעלות יונים הנגרמות על ידי הטמפרטורה עלתה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig1.jpg" /> איור 1. סקיצה של מצע photoactive. ממשקי photoactive משמשים לגירוי אופטי סלולארי עשויות משכבה דקה של מוליכים למחצה אורגניים שהופקדו על מצע זכוכית מצופה איטו. ניתן לגדל תאים ישירות על משטחי המכשיר לאחר שטופל בשכבה מתאימה הידבקות (למשל, פיברונקטין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig2.jpg" /> איור 2. התעסקות<html> ספקטרום tion של פולימרים מצומדות שונים. השימוש בשכבות דקות של מוליכים למחצה אורגניים עשויות לאפשר tunability הגדול בגל עירור תוך שמירת שקיפות חלקית של המצע. כדוגמא, ספקטרום הקליטה של פולימרים מצומדות שונים משמש בדרך כלל בphotovoltaics מדווחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig3.jpg" /> איור 3. HEK-293 תאים בתרבית על מצע photoactive. מיקרוסקופ אופייני של HEK-293 תאים בתרבית על פני השטח של מצע photoactive לאחר 24 שעות של דגירה. בר סולם, 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> e_content &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig4.jpg" /> איור 4. גירוי אופטי של HEK-293 תאים עם 20 הבזקי אור msec. וריאציה של פוטנציאל הממברנה של תא HEK-293 שהושרו על ידי דופק msec 20 של אור. ספייק המהיר ראשוני על תחילתה של האור ואחריו שלילת קוטביות של התא במהלך הדופק. כאור כבוי, התנהגות הפוכה הוא ציין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53494/53494fig5.jpg" /> איור 5. גירוי אופטי של HEK-293 תאים עם 200 הבזקי אור msec. וריאציה בפוטנציאל הממברנה של תא HEK-293 שהושרו על ידי דופק msec 200 של אור. שלילת קוטביות הראשונית נצפתה תאורה קצרהination היא רק תופעה חולפת, שלאחר כמה עשרות אלפיות השניה של תאורה ממושכת הופכת לhyperpolarization של התא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53494/53494fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers at JoVE.com

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Video: Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genetics

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Neuroscience

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic location. To achieve this, we co-transfected cells with nuclear-targeted cAMP sensors and our laboratory-developed optogenetic protein, bacterial photoactivatable adenylyl cyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, when stimulated with 445 nm light or luciferase substrates, generates adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (cAMP). We employed a solid-state laser illuminator connected to a point scanning system that allowed us to create a grid/matrix pattern of small illuminated spots (~1 &#181;m2) throughout the cytoplasm of HC-1 cells. By doing so, we were able to effectively track the distribution of nuclear-targeted bPAC-nLuc and generate a comprehensive cAMP response map. This map accurately represented the cellular distribution of bPAC-nLuc, and its response to light stimulation varied according to the amount of protein in the illuminated spot. This innovative approach contributes to the expanding toolkit of techniques available for investigating cellular optogenetic proteins. The ability to map its distribution and response with high precision has far-reaching potential and could advance various fields of research.

This protocol involves transfecting cAMP sensors and bPAC-nLuc, an optogenetic protein, to accurately track its cellular distribution and response to light stimulation. The innovative approach of creating a cAMP response map using a point scanning system holds the potential for advancing research with optogenetic proteins in different fields.