Name: flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.

Achtung: Einige Chemikalien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind Reizstoffe und sind im Falle von Hautkontakt gefährlich. Wenden Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung vor dem Durchführen dieses Protokoll. Die in Schritt (1.1.1) verwendet Piranha-Lösung ist stark ätzend und erfolgt durch Zugabe der Peroxid langsam zu der Säure unter Rühren hergestellt werden. Behandeln Sie diese Lösung mit äußerster Vorsicht in einer Abzugshaube. Verwenden Sie geeignete Schutzbrille und säurefeste Handschuhe. Trimethylchlorsilan (TMCS) ist eine ätzende, brennbare Chemikalie in einem optionalen Schritt nach (1.1.6) verwendet. Behandeln Sie diese Chemikalie in einem Abzug. Hinweis: Führen Sie die Barcode-Schiebe Fertigung und kritische Strömung-Strukturierungsverfahren in einem Reinraum, um eine Verunreinigung durch Partikel zu minimieren. Staubpartikel können die Ports und Mikrokanäle PDMS Formen blockieren und stören Fluss-Strukturierung. 1. Bau des One-dimensional DNA Barcode Slide <ol><li> Vorbereitung des SU-8 Master für Barcode-Strömungsmuster Anmerkung: Die Zeichnungen für den senkrechten Strömungsmuster (1A-B) unter Verwendung eines Computer-Aided Design (CAD) geschaffen. Diese Muster werden auf einer Chrommaske erstellt. Transparenten Bereichen der Maske entsprechen den Merkmalen der SU-8-Master. <ol><li> Reinigen einer Siliziumwafer (Durchmesser 100 mm) gründlich in einem Gemisch von 3 H 2 SO 4: 1 30% H 2 O 2 (Piranha-Lösung) auf 96 ° C erwärmt. Waschen Sie die Wafer mit deionisiertem Wasser und Isopropylalkohol, durch Trocknen mit einem Stickstoffluftpistole gefolgt. </li><li> Pour etwa 4 ml SU-8-Fotolack 2025 auf dem Wafer. Verwenden einer programmierbaren Schleuderbeschichter gleichmäßig verteilt den Photoresist auf dem Wafer 10 Sekunden lang bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. Dies schafft eine Photoresistschicht mit einer Dicke von ~ 25 &amp; mgr; m. Nach und ermöglichen zum Stillstand kommen, vor dem Anhalten zu verlangsamen - das ist nach MaiNtain eine gleichmäßige Beschichtung auf der Oberfläche des Wafers. </li><li> Backen des beschichteten Wafers auf einer Heizplatte für 1 min bei 65 ° C, dann für 5 min bei 95 ° C. Dieser Schritt ermöglicht die Beschichtung zu verfestigen. Cool, für 5 min RT. </li><li> Legen Sie die Chrommaske (Abbildung 1c) auf dem Fotolack beschichten. Setzen die Maske Eigenschaften, um im nahen UV-Licht (350 bis 400 nm, einer Belichtungsenergie von 150 bis 160 mJ / cm 2) für 20 sec. Hinweis: Das Design auf der Chrommaske enthält 20 Kanäle, von denen jeder 20 &amp; mgr; m breit mit 50 &amp; mgr; m Steigung sind. Die Kanäle Wicklung von einem Ende der Struktur auf der gegenüberliegenden Seite. Insgesamt sind die 20 Kanäle umfassen eine rechteckige Fläche mit einer Länge von ~ 40 mm und einer Breite von ca. 20 mm. Jeder Kanal ist durch zwei kreisförmige Merkmale, die zu einem Einlass und einem Auslass entsprechen flankiert. Einlässe und Auslässe sind austauschbar. </li><li> Backen Sie die belichteten Wafer auf einer Heizplatte 5 min bei 95 ° C. Coole allmählich auf RT. </li><li> Tauchen des Wafers in SU-8-Entwickler unter Rührenfür 5 min. Der Wafer mit einem kleinen Teil des Frisch SU-8-Entwickler, gefolgt von Isopropylalkohol zu waschen. Trocknen Sie die Wafer unter Verwendung einer Stickstoffluftpistole. Hard-bake Wafers auf einem 200 ° C-Kochplatte für 30 min und damit der Wafer schrittweise auf RT abkühlen. Anmerkung: Die Entwicklung kann für eine längere Zeit durchgeführt werden, wenn ein weißer Film wird nach dem Waschen in diesem Schritt festgestellt. Optional: silanisieren die SU-8 Master, indem es Dampf in einer verschlossenen Petrischale für 10 min Trimethylchlorsilan. </li></ol></li><li> Herstellung der PDMS Barcode Form <ol><li> Kombinieren 40,0 g Siliconelastomer-Basis mit 4,0 g Härter. Rühre das Prepolymergemisch 10 min kräftig. Degas für 20 min unter Vakuum. Hinweis: In der Regel verwenden Sie ein 10: 1 (Basis: Härter) Massenverhältnis. </li><li> Gießen Sie das Präpolymer in eine Petrischale, die einen Silizium-Wafer mit dem SU-8 Master des Barcode-Musters. Die Höhe des PDMS-Mischung sollte etwa 7,5 mm oder mehr betragen. Entgasen des Gemischs in der Petri Gericht für ein zweites Mal, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, dann backen die Mischung für 1 h bei 75 ° C, damit PDMS zu heilen. Hinweis: Es ist wichtig, genügend Dicke der PDMS-Platte mit 7,5 mm zu halten ~ oder über Zugabe von zu viel Spannung auf das PDMS-Glas-Bindung beim Einsetzen der Stifte / Schlauch durch Löcher in der PDMS-Form in Schritt, um zu vermeiden (1.3.3.1) </li><li> Mit einem Skalpell vorsichtig um den Bereich der PDMS-Platte, die den Barcode Formmerkmale enthält, und ziehen Sie die Platte aus dem Wafer geschnitten. </li><li> Die Kanten der Platte, um die gewünschte Form des PDMS Barcode-Form zu erreichen. Stempel 20 Löchern (1,0 mm Durchmesser) durch die Form mit Hilfe einer Biopsie Schlag mit Kolben. Sicherzustellen, dass die Löcher mit den kreisförmigen Merkmalen der Strichcodemuster ausgerichtet sind. Diese Löcher dienen als Ein- und Ausgänge. </li></ol></li><li> Eindimensionale Strukturierung von Poly-L-Lysin (PLL) <ol><li> Entfernen Sie Staub auf der Oberfläche einer Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträger unter Verwendung einer Stickstoffluftpistole. Attach die PDMS-Form auf die sauberen Glasobjektträger. Sicherzustellen, dass die Kanten der Form und dem Schlitten ausgerichtet sind. </li><li> Backen für 1,5 h bei 75 ° C, um die Bindung zwischen der PDMS-Form und der PLL-beschichteten Objektträger zu verstärken. Währenddessen werden 20 Stücke aus flexiblem Polyethylenschlauch (3- bis 4-Zoll-Stücke, mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einem Außendurchmesser von 1,5 mm). Anmerkung: Die Anzahl der Schlauchstücke, entspricht der Anzahl von Einlässen im PDMS Barcodeform. Der Schlauch dient zur Kopplung der Kanäle auf dem PDMS Barcodeform zu einem Stickstoffgastank mit einem Druckregler ausgestattet ist. </li><li> An einem Ende jedes Rohrstück, befestigen eine Edelstahlhohlbolzen (1 mm Durchmesser). Aspirat sterilfiltriert Poly-L-Lysinlösung durch den Stift, bis mindestens 1 cm des Schlauchs wird mit der Lösung gefüllt. <ol><li> Befestigen Sie die Stifte (zur Lösung gefüllten Schlauch verbunden) an den Einlässen der PDMS Barcode Form (1E). Schließen Sie das andere Ende der Rohre zueine druckgeregelte Stickstofftank Set-up. Die Lösung wird durch die Form mit einem Druckbereich von 0,5-1 bar für mindestens 6 h fließen. Hinweis: Siehe Schritt (1.3.3) für alle Flussstrukturierungsverfahren. </li></ol></li></ol></li><li> Eindimensionale Strukturierung ssDNA 14 Anmerkung: Die Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) in den nachfolgenden Schritten verwendet wird, aus 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 und 2 mM KH 2 PO 4. Der pH-Wert des Puffers beträgt 7,4 hergestellt. <ol><li> Vorzubereiten 2 mM Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) -Lösung in PBS. Vorzubereiten 300 uM Lösungen A, B und C ssDNA (5&#39;-Amin-modifizierten, 80 Nukleotide) in PBS oder Reinstwasser. Hinweis: Mit der BS3-Lösung innerhalb von 30 min nach der Herstellung, da die N-Hydroxysuccinimid Ester leicht eine Hydrolyse. </li><li> Kombinieren 2,5 ul 300 uM A, B oder C ssDNA mit 2,5 ul 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberat in PBS für jeden Kanal. A, B, und C-DNA mit den Kanälen 1, 2 und 3 bezeichnet, und sind. Dieser Auftrag wird auch die verbleibenden Gruppen von 3 Kanälen (2A) angelegt wird. </li><li> Führen Sie Schritt (1.3.3). Dieses Mal absaugen 5 ul BS3 / DNA-Lösungen durch Edelstahlbolzen und in die Polyethylenschlauch, dann koppeln die PDMS Form, um die Stickstoffquelle. Damit der BS3 / DNA-Lösung, durch die Strichcodeform für etwa 40 Minuten oder bis an die Kanäle gefüllt sind, fließen. </li><li> Stoppen Sie den Fluss, wenn alle Kanäle belegt sind, dann inkubieren BS3 / DNA-Lösung in der Barcode bei RT für 2 h. Erlauben nicht die Lösung zu trocknen. Backen Sie die PDMS-Form mit angeschlossener Barcode-Schieber für 1 h bei 75 ° C. Hinweis: Um die Ausrichtung in den nachfolgenden Flussstrukturierungsschritte zu erleichtern, können die Ränder der Kanalmuster auf dem Barcode Schieber umrissen. Dies geschieht durch vorsichtiges Kratzen der Glasoberfläche mit einem Diamant Scrib getane an Ausrichtmarkierungen an der Unterseite des Objektträgers generiert. Ausrichtung in späteren Stufen des Protokolls können unter einem Mikroskop geprüft werden. </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Form von der Barcode-Folie. Sanft SDS einmal und dreimal mit hochreinem Wasser Waschen Sie die Objektträger mit 0,01%. <ol><li> Trocknen Sie die Barcode-Schieber mit einem Mikroskop-Objektträger Spinner. Bewahren Sie die Barcode-Folie in einer sauberen 50-ml-Zentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Validierung der eindimensionalen Muster auf dem Barcode-Slide Anmerkung: Diese Validierungsprotokoll können auch zur Verwendung bei der Beurteilung der Qualität von Nachfließen Strukturierungsschritten angepasst werden. <ol><li> Blockieren des Schiebers <ol><li> Vorbereitung 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Filtern dieser Lösung durch einen 0,45 um-Spritzenfilter vor dem Gebrauch. Verwendung eines gel-Ladespitze gelten 50 ul 1% BSA-Lösung, um einen Rand des Barcodeträger. </li><li> Inkubieren Sie die 1% BSA solutIon für 1 h bei RT. </li></ol></li><li> Inkubation mit Cyanine 3 (Cy3) -konjugiertem komplementäre DNA <ol><li> Bereiten Sie einen Cocktail von A &#39;, B&#39; und C &#39;Oligonukleotide an einem Ende konjugiert an Cy3. Die Sequenzen der A &#39;, B&#39; und C &#39;sind komplementär zu denen von A, B und C sind. Die Arbeitskonzentration des Cy3-DNA beträgt 0,05 &amp; mgr; M in 0,1% BSA. </li><li> Entfernen Sie die BSA-Lösung aus der Folie durch Pipettieren, so gelten 30 ul der DNA-Cocktail-Lösung auf dem gleichen Rand des Objektträgers. Inkubieren Sie die Cy3-DNA-Cocktail auf der Folie bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Führen Sie diese Inkubationsschritt in der Dunkelheit, die Cy3-Einheit von Photobleaching zu schützen. </li></ol></li><li> Analyse der Fluoreszenzintensität <ol><li> Pipettieren Sie die Cy3-DNA-Cocktail und waschen Sie die Folie in 1% BSA, PBS und schließlich in PBS verdünnt (1 S.Kunst PBS mit 50 Teilen hochreinem Wasser). Trocknen Sie den Schieber unter Verwendung einer Schleuder. </li><li> Beachten Sie die Fluoreszenz (2B) mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Microarray-Scanner. Bei der Verwendung eines Microarray-Scanner, stellen Sie den Laser-Emissionswellenlänge auf 532 nm, die Pixelgröße auf 5 Mikrometer, Photomultiplier (PMT) Verstärkung bei 450 und Leistung bei 15%. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von 2-dimensionalen (3x3) DNA-Arrays 14 <ol><li> Herstellung der PDMS Barcode Form <ol><li> Zuführen Verfahren (1.1), eine andere SU-8 Master realisiert werden, aber dieses Mal mit einem Chrommaske mit einem Strömungsmuster senkrecht zu der ersten Design. Führen Sie das Verfahren (1.2), um eine neue PDMS-Form mit der Senkrechten Muster zu konstruieren. </li></ol></li><li> Zweidimensionalen Strömungs Strukturieren ssDNA <ol><li> Für einen 3 x 3-Matrix, bereiten 150 uM Vorratslösungen A&#39;-i, B&#39;-ii, iii C&#39;-A&#39;-iv, B&#39;-v, vi C&#39;-A&#39;-VII, B&#39;-VIII und C&#39;-ix DNA in 3% BSA / PBS. Diese Oligonukleotide dienen als &quot;Brückensequenzen&quot; (2A). Verbinden die Oligonukleotid-Lösungen (Lösungen 1 bis 3), so dass die Arbeitskonzentration von 50 &amp; mgr; M für jedes Oligonukleotid. Benutzen Sie den Leitfaden in der Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. </li><li> Fließen 3% BSA / PBS Blocklösung in alle 20 Kanäle für 1 h bei 0,5-1 bar. </li><li> Strömungs Lösungen 1, 2 und 3 in den Kanälen 1, 2 und 3. Folgen Sie dieser Reihenfolge für nachfolgende Sätze von 3 Kanälen. Stroms normalerweise in etwa 40 min abgeschlossen. Die DNA-Lösungen bei RT inkubieren für 2 Stunden, damit die DNA zu hybridisieren. </li><li> Fließen 3% BSA / PBS Blocklösung in alle 20 Kanäle für 1 h bei 0,5-1 psi bis unhybridisierten DNA zu entfernen. Ziehen Sie die PDMS-Platte, und waschen Sie die erhaltenen DNA-Microarray-Objektträger durch Eintauchen der Objektträger in 3% BSA / PBS einmal und PBS zweimal durch verdünnte PBS (1 Teil PBS und 50 Teilen hochreinem Wasser) gefolgt. Dry die Folie mit einem Mikroskop-Objektträger Spinner. </li><li> Führen Sie eine zweite Validierungsschritt (2C) ähnlich wie in Abschnitt 2. Verwenden Oligonukleotide i &#39;bis ix&#39;, die Cy3-konjugiert sind. Speichern die 3 x 3-Matrix Folie in einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen für eine nachfolgende Verwendung. Anmerkung: Die DNA-Mikroarray bei RT in einem Exsikkator Monate gelagert werden. </li></ol></li></ol> 4. Umwandlung der 3 x 3 DNA-Array in ein Array Antikörper <ol><li> Herstellung von Antikörper-Oligonukleotid (DEAL) Konjugate <ol><li> Werden die Lösungen von 200 mM Succinimidyl-4-formylbenzoat (S-4FB) und 40 mM Succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HYNIC) in wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (DMF). </li><li> Vorbereitung bis zu 7 getrennte Lösungen von Fänger-Antikörper (1 mg / ml) in PBS. Hinweis: Wenn die Antikörper-Stammlösungen enthalten Natriumazid Bakteriostatikum, führen Pufferaustausch mit PBS unter Verwendung von Spin-Entsalzung columns 7 kDa Molekulargewichtsausschlußgrenze (MWCO). </li><li> Bereiten separaten 400 &amp; mgr; M Lösungen von I &#39;, II&#39;, III &#39;, IV&#39;, v &#39;, VI&#39; und vii &#39;DNA. Ordnen Sie jedem Capture-Antikörper auf einem Oligonukleotid-Sequenz. Kombinieren Sie 40 ul 400 uM DNA mit 12.25 ul DMF in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down, um gründlich zu mischen. <ol><li> Zu jeder DNA / DMF-Lösung, fügen 2,3 &amp; mgr; l 200 mM S-4FB in DMF. Für jede 100 ug Capture-Antikörper, fügen 2,25 &amp; mgr; l 40 mM S-HYNIC in DMF. </li></ol></li><li> Antikörper / S-HYNIC und DNA / S-4FB Lösungen inkubieren 4 h bei RT. </li><li> In Vorbereitung für den Antikörper-DNA-Kupplungsreaktion vorzubereiten neuen Spin Entsalzungssäulen (eine für jede DNA-Lösung und eines für jeden Antikörper) durch Waschen mit Citrat-Puffer bei pH 6. </li><li> Nach 4 Stunden Inkubation, führen Pufferaustausch für jeden Antikörper / S-HYNIC und DNA / S-4FB Lösung. Kombinieren Sie die S-4FB konjugierten <strong&gt; I &#39;, II&#39;, III &#39;, IV&#39;, v &#39;, VI&#39; und vii &#39;Oligonukleotide mit den Antikörper-S-HYNIC Konjugate. Die Gemische Inkubieren für 2 h bei RT. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Die Reinigung von Antikörper-Oligonukleotid (DEAL) Konjugate Hinweis: Um die Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate zu reinigen, führen schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) auf einer Standard-FPLC-System mit einer Superose 6 10/300 GL-Säule ausgestattet. <ol><li> Set der Wellenlänge des UV-Detektors der FPLC-System bis 280 nm. Verwenden isokratisch Fluss von PBS (pH 7,4) bei 0,3 ml / min, um die Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate von der überschüssigen S-4FB-DNA zu trennen. </li><li> Bündeln die Fraktionen, die das Konjugat und konzentrieren sich die Fraktionen auf ein Volumen von 150 ul unter Verwendung von Spin-Filter mit einer 10 kDa MWCO. </li></ol></li><li> Zweidimensionalen Strukturierung von Antikörpern <ol><li> Bereiten Sie einen anderen PDMS-Form mit Kleinstkammern oder Mikrovertiefungen unsing Herstellungsverfahren in Schritt (1.2). Die PDMS-Form kann Mikroliter bis Nanoliter-Vertiefungen für Immunoassays enthalten. Hinweis: Für allgemeine Biomarkern in fluidischen Proben wird ein PDMS-Form mit mehreren Vertiefungen, die mit dem Array Objektträger gedeckt. Die Merkmale der PDMS-Form hängen von das System untersucht. Zum Beispiel kann der Nachweis von Proteinen, die aus Einzelzellen-Experimente mit einem PDMS-Form enthaltenden Mikrokammern mit 0,15-nl Volumen durchgeführt werden. </li><li> (Optional) Betreff der PDMS-Form an Plasmareinigung (18 W) für 1,5 min um seine strukturierte Oberfläche hydrophil zu machen. Vor dem Plasmareinigung mit Klebeband alle anderen Oberflächen, die direkt an die 3 x 3-Matrix Schieber verbunden werden blockieren. Hinweis: Schritt (4.3.2) ist optional, aber ist in der Regel durchgeführt, wenn das PDMS-Form ist für den Einsatz in Einzelzellexperimenten bestimmt. </li><li> Kamerad die PDMS-Form mit dem 3 x 3-Array Rutsche, dann sperren Sie die Folie mit 1% BSA in PBS. Inkubieren für 1 h bei RT. Meanwhile, bereiten Sie einen Cocktail (200 ul Endvolumen) von Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate. Die Arbeitskonzentration jedes Konjugat 10 ug / ml in 1% BSA / PBS. </li><li> Hinzufügen des Antikörper-Oligonukleotid-Cocktail, dann Inkubieren für 1 h bei 37 ° C, damit das Oligonucleotid-Einheit der Konjugate mit bestimmten Stellen auf den 3 x 3 Matrizen hybridisieren, wodurch das DNA-Array-Konvertierung in einem Antikörper-Array. </li><li> Wiederholen Sie Schritt (3.2.4) zu reinigen und trocknen Sie die Folie. Die höchste Empfindlichkeit wird erreicht, wenn der Antikörper-Array sofort verwendet werden. Längere Lagerung kann zu einem Verlust der Empfindlichkeit führen. </li></ol></li><li> Nachweis von Proteinen <ol><li> Rekonstituieren rekombinanten Proteinen oder bereiten Sie eine gefilterte Zellprobe. </li><li> Kamerad des Mikroarrays mit einem speziell angefertigten Chip, und blockieren Sie die Oberfläche mit 3% BSA in PBS für 1 Stunde. Entfernen Sie dann die BSA-Lösung und gelten Proben und Inkubation für 2 Stunden. </li><li> Abwaschen der Proben unter Verwendung von 3% BSA in PBS dreimal eind fügen Nachweisantikörper in einer von der Produktdatenblatt vorgesehen Konzentration. Inkubieren für 2 Stunden. </li><li> Abwaschen der Nachweisantikörper durch 3% BSA in PBS dreimal, und fügen Cyanin 5 (Cy5) -streptavidin bei 1 ug / ml, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde. </li><li> Wiederholen Sie Schritt (3.2.4) zu reinigen und trocknen Sie die Folie für das Scannen. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing interests to disclose.

Strömungsmuster Design ist der erste wichtige Schritt bei der Herstellung der 2-D-Mikroarray. Um zwei überlappende DNA-Muster auf einem Glassubstrat zu erzeugen, müssen die Kanal Merkmale des ersten Design senkrecht zu denen des zweiten (1A-B). Die Entwürfe beachten Sie auch die nachgelagerten Anwendungen des Mikroarrays. Im Fall der Einzelzellanalyse wird der Mikroarray verwendet werden, um Proteine, die von einzelnen Zellen in Mikrokammern umschlossen erfassen, damit die Kanalabmessungen ...

Antikörper-Mikroarrays wurden weitgehend in der Proteomik seit Jahrzehnten verwendet, um die Anwesenheit von Zielproteinen, einschließlich Proteinbiomarker 1-3 zu prüfen. Obwohl dieser Bereich steht derzeit vor großen Herausforderungen von anderen Hochdurchsatz-Technologien wie Massenspektrometrie (MS), gibt es noch viel Raum für die Nützlichkeit der Antikörper Microarrays, vor allem, weil diese Geräte leisten einfache Dateninterpretation und einfache Schnittstelle mit anderen Tests. In den letzten Jahren hat sich die Integration von Microarrays in die Mikrochip-Gerüsten der Antikörper Microarray eine neue Möglichkeit, gedeihen 4-7 vorgesehen. Zum Beispiel hat der Barcode Microarray in eine Einzelzellmikrochip integriert in Zell-Kommunikation Studien 8,9 verwendet. Diese Technologie hat deutliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Microarray-Technologien. Es verfügt über Array-Elemente auf 10-100 um, viel kleiner als die typischen 150 um Größe in herkömmlichen Microarray elemen verwendetts. Der Bau von kleineren Arrayelemente mit systematischen Strömungsmusterbildungsverfahren erreicht wird, und dies führt zu kompakten Mikroarrays, die Einzelzell sezernierten Proteinen und intrazellulären Proteinen erkennen kann. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung eines einfachen, instrument freie Konfiguration. Dies ist besonders wichtig, weil die meisten Labors und Kleinunternehmen nicht in der Lage, um Mikroarray-Kerneinrichtungen zugreifen zu können. Solchen Barcode-Antikörper-Mikroarrays mit einer leistungsfähigen Assay Durchsatz und können verwendet werden, um hoch Multiplex-Assays an einzelnen Zellen durchzuführen, während eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität mit der von herkömmlichen Sandwich-Enzym-Immunoassay (ELISA 8) werden. Diese Technologie hat zahlreiche Anwendungen in der Detektion von Proteinen aus Glioblastom 9-11, T-Zellen 12 und 13 zirkulierenden Tumorzellen gefunden. Alternativ Barcode DNA Microarrays allein in der präzisen Positionierung von Neuronen und Astrozyten für mimick genutzt wordening der in vivo Anordnung von Hirngewebe 14. Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die experimentellen Schritte und Aufbaublöcke der zweidimensionalen (2D) Strichcode-Antikörper-Microarray, die Anwendungsmöglichkeiten in der Detektion von Biomarkern in Fluidproben hat und in einzelne Zellen. Die Technik basiert auf einem adressierbaren einzelsträngig, eindimensionale (1-D) DNA Microarray konstruiert unter Verwendung eines Orthogonal-Oligonukleotide, die sich räumlich auf Glassubstraten gemustert. Der 1-D-Muster gebildet wird, wenn parallele Strömungskanäle in Strömungsmusterungsschritt verwendet, und ein derartiges Muster wird als diskrete Banden visuell ähnlich zu 1-D Universal Product Code (UPC) Barcodes. Der Bau eines 2-D (n x m) Antikörper Array - erinnert an ein 2-D Quick Response (QR) Matrixcode - braucht mehr komplexe Strukturierungsstrategien, sondern ermöglicht für die Immobilisierung von Antikörpern mit einer höheren Dichte 8,15. Die Fertigungerfordert zwei DNA Strukturierungsschritte, wobei das erste Muster senkrecht zu der zweiten. Die Schnittpunkte dieser beiden Muster bilden die n x m Elemente des Arrays. Durch strategische Auswahl der Sequenzen der einzelsträngigen DNA (ssDNA) in Strömungsstrukturierung verwendet wird, wird jedes Element in einem gegebenen Array eine bestimmte Adresse zugewiesen. Diese Raumbezug ist bei der Unterscheidung zwischen Fluoreszenzsignale auf dem Microarray Objektträger notwendig. Die ssDNA-Array in einen Antikörper-Array durch den Einbau von komplementären DNA-Antikörper-Konjugate umgewandelt und bildet eine Plattform genannte DNA-kodierten Antikörperbibliothek (DEAL 16). Diese Video-Protokoll werden die wichtigsten Schritte bei der Erstellung nxm Antikörperarrays, umfassend die Herstellung schließen Polydimethylsiloxan (PDMS) Barcode Formen, Fließmuster ssDNA in zwei Orientierungen, die Vorbereitung Antikörper-Oligonukleotid-Konjugaten DEAL, und Umwandeln des 3 x 3-DNA-Array in ein 3x 3-Antikörper-Array.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafers&amp;nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine adhesive stock solution</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&amp;nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&amp;nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Capture antibodies</td><td>various</td><td>various</td><td>*Antibody selection depends on application</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid, anhydrous</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond scribe (Style 60)</td><td>SPI supplies</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Trimethylchlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

Die Entwürfe für die PDMS-Form (1A-1B) wurden unter Verwendung eines CAD-Programms (AutoCAD) erstellt. Zwei Entwürfe gezeigt Funktion Kanäle für Strömungs Strukturierung, eine horizontale und eine vertikale. Die linke und rechte Teile jedes Design symmetrisch sind; einer von ihnen könnte Einlässen oder Auslässen sein. Jeder der 20 Kanäle ist Wicklung von einem Ende hin zum anderen Ende. Jedes Design ist auf einem Chrom-Photomaske (Abbildung 1c)...

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Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.5K Aufrufe.  University at Albany, State University of New York.  Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern. 

Serie: Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Forschung

Krebsforschung

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em&gt; Cyanobakterien</em&gt; In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Umwelt

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Genetik

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Biologie

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Immunologie und Infektion

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

Source: Olivera-Ardid, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57662">Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Glycochips Production

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

Eine Peptid-Microarray-Technologie zur Erstellung von Spezifitätsprofilen von Antikörpern

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Zusammenfassung

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