Die große Menge an biologischen Informationen, die aus der Multiplex-Barcode-Bildanalyse gewonnen werden, ermöglicht es den Wissenschaftlern, die Mikroumgebung des Tumors und die spezielle Verteilung innerhalb der Tumorzellen besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie uns viel detailliertere Informationen aus derselben Gewebeprobe liefert und die Möglichkeit bietet, eine tiefere Phänotypisierung einzelner Zellen durchzuführen. Diese Methode ermöglichte anpassbare Panels zur Untersuchung der Tumormikroumgebung, um möglicherweise prädiktive Biomarker im Krebsgewebe zu entdecken, die als neue Zielbehandlung verwendet werden können.
Um mit der Färbung der Oligonukleotid-konjugierten Antikörper zu beginnen, tränken Sie die Deckgläser 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in 0,1%iger Poly-L-Lysin-Lösung, um sie für die Gewebeplatzierung und -haftung vorzubereiten. Waschen Sie die Deckgläser nach dem Abtropfen der Poly-L-Lysin-Lösung 30 Sekunden lang mit Reinstwasser. Entfernen Sie nach dem Waschen die Deckgläser aus dem Reinstwasser und legen Sie sie zum Trocknen über Nacht auf ein fusselfreies Handtuch.
Legen Sie 5 Mikrometer dicke Abschnitte des interessierenden Gewebes auf die Mitte eines mit Poly-L-Lysin beladenen Deckglases und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Einen Deckglashalter im Backofen bei 60 Grad Celsius über Nacht vorheizen. Legen Sie das Deckglas mit den Gewebeabschnitten in den vorgeheizten Halter.
Nachdem Sie es 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius gebacken haben, überprüfen Sie, ob das Paraffin vom Gewebe weggeschmolzen ist. Platzieren Sie den Deckglashalter mit der Probe schnell nacheinander in einer Reihe von Lösungen. Zum Schluss legen Sie den Deckglashalter für zwei Runden à fünf Minuten in DEPC-behandeltes Reinstwasser.
Bereiten Sie eine Feuchtigkeitskammer vor, indem Sie ein wassergetränktes Papiertuch auf den Boden einer leeren Pipettenspitzenbox legen. Füllen Sie einen Schnellkochtopf mit Wasser, das ausreicht, um die halbe Höhe eines 50-Milliliter-Bechers abzudecken. Geben Sie 5 Milliliter Methanol pro Probe bei 4 Grad Celsius in ein Becherglas.
Verdünnen Sie das erforderliche Volumen des AR9-Puffers auf 1X mit Diethylpyrocarbonat oder DEPC-behandeltem Reinstwasser. Füllen Sie anschließend ein 50-Milliliter-Glasbecherglas mit ca. 40 Millilitern des verdünnten AR9-Puffers. Tauchen Sie die Probe in den Deckglashalter im Becherglas und decken Sie das Becherglas vollständig mit Alufolie ab.
Stellen Sie den mit Alufolie überzogenen Becher in den mit Wasser gefüllten Schnellkochtopf und kochen Sie ihn 20 Minuten lang bei etwa 15 PSI. Nehmen Sie dann den Becher heraus und wickeln Sie die Alufolie vorsichtig aus. Den Becher ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
Entfernen Sie den Deckglashalter aus dem 1X AR9-Puffer. Inkubieren Sie es zweimal zwei Minuten lang in DEPC-behandeltem Reinstwasser. In der Zwischenzeit entnehmen Sie den Hydratationspuffer, das Antikörperverdünnungsmittel und die Blockierungslösungen N, G, J und S aus dem Multiplex-Imaging-Färbekit.
Geben Sie die Deckglasprobe zweimal für jeweils zwei Minuten in 5 Milliliter des Hydratationspuffers. Anschließend wird die Deckglasprobe in 5 Milliliter des Multiplex-Antikörper-Verdünnungsblocks gegeben und 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bereiten Sie während der Inkubation den Antikörpercocktail vor.
Legen Sie das Deckglas nach der Inkubation in die zuvor vorbereitete Feuchtigkeitskammer. 190 Mikroliter des Antikörpercocktails auf die Deckglasprobe pipettieren und drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Probe anschließend zweimal mit jeweils 5 Millilitern des Multiplex-Antikörper-Verdünnungsblocks für zwei Minuten.
Um die gebundenen Antikörper am Gewebe zu fixieren, inkubieren Sie die Deckgläser 10 Minuten lang in 16%igem Formaldehyd, verdünnt auf 1,6%, mit Aufbewahrungslösung und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Nach fünf Minuten Inkubation der Deckgläser in Methanol auf 4 Grad Celsius vorkühlen. Inkubieren Sie die Deckgläser nach dem Waschen erneut 20 Minuten lang in 5 Millilitern des mit PBS verdünnten Fixierreagenzes und waschen Sie sie vor der Lagerung dreimal mit PBS.
Bereiten Sie den Reporter-Mastermix nach der im Text erwähnten Zusammensetzung vor. Füllen Sie eine Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit 245 Mikrolitern einer Lösung, die den Reporter-Mastermix und die spezifischen Barcode-Fluorophore für diesen experimentellen Zyklus enthält. Die Abbildung zeigt eine Reporterplattenkonfiguration, die hier für ein Karzinompanel verwendet wird.
Um die Barcode-Fluorophore zu schützen, kleben Sie eine Folienplattenabdeckung über die 96-Well-Reporterplatte und legen Sie die Platte in das Multiplex-Bildgebungsinstrument. Kalibrieren Sie den Fokus der Bildgebung mithilfe des DAPI-Kanals, indem Sie ein Probenabdeckglas auf den Mikroskoptisch legen und 700 Mikroliter einer 1:1500-Titration einer Kernfärbelösung manuell auf das Gewebe pipettieren. Zur Herstellung des Multiplex-Bildgebungsgeräts wird der 10-fache Multiplex-Bildgebungspuffer mit DEPC-behandeltem Reinstwasser auf 1-fach verdünnt und die Reagenzflaschen mit geeigneten Lösungen oder Lösungsmitteln gefüllt.
Stellen Sie alle Parameter des Mikroskops ein und wählen Sie die Bereiche aus, die auf dem Probendeckglas von Interesse sind, die abgebildet werden sollen. Geben Sie das Versuchsdesign in die Gerätemanager-Software ein. Klicken Sie in der Steuerungssoftware auf die Schaltfläche "Experiment" und im Fenster "Experiment einrichten und verwalten" auf die Schaltfläche "Neue Vorlage".
Geben Sie den Projektnamen in das Feld neben der Schaltfläche Projekt ein und geben Sie die Gesamtzahl der Zyklen ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kanalzuweisung und geben Sie die Informationen für jeden Zyklus in die Spalten ein, z. B. den richtigen Zyklus, Well-Nummern, Z-Stapelplätze, Markername, Klasse und Belichtungszeit für jeden Zyklus. Starten Sie dann das Experiment, indem Sie auf Experiment starten klicken, und speichern Sie das Experiment.
Klicken Sie auf das QuPath-Symbol auf dem Computer und öffnen Sie die Software. Ziehen Sie die qptiff-Datei in das Viewer-Fenster. Klicken Sie auf die Schaltfläche Helligkeit und Kontrast, um das Fenster Helligkeitskontrast zu öffnen.
Aktivieren oder deaktivieren Sie die Markierung in der ausgewählten Spalte, um das Markierungssignal ein- oder auszublenden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zum Anpassen zoomen, um den gewünschten Bereich zu vergrößern oder zu verkleinern. Bei der Betrachtung mit einer Bildanalysesoftware zeigten die zusammengesetzten Bilder alle Marker oder ausgewählten Marker wie gewünscht an.
Die Signalintensität, der Dynamikumfang und die räumliche Verteilung aller Marker wurden aufgedeckt. Diese Technik ermöglichte die Analyse aller 26 Marker auf subzellulärer Ebene in einem einzigen Gewebeschnitt. Im Anschluss an den Multiplex-Bildanalyseprozess können informatische Ansätze die hochdimensionalen Einzelzelldaten verarbeiten und analysieren, um biologische und klinische Erkenntnisse abzuleiten.
Die Multiplexing-Barcoding-Bildanalyse ist eine leistungsstarke Methode, die es Wissenschaftlern ermöglicht, ein Profil von Tumorgewebe zu erstellen und ihre Forschungsfrage anhand der Marker in den Panels zu beantworten.
