Die Autoren danken Patricia Baldacci, Vanessa lagal und Sabine Thiberge für das kritische Lesen, Irina Dobrescu und Sabine Thiberge um Hilfe in Bildern und Pauline Formaglio für den Unterricht in - vivo - Bildgebung von Sporozoiten - Motilität in der Mäusehaut nehmen. Wir möchten auch Marek Szatanik und das Zentrum für Produktion und Infektion von Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) für Mückenzucht zu danken. Diese Studie wurde von der AXA Research Fund und Mittel aus dem Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Integrative Biologie der Emerging Infectious Diseases&quot; unterstützt (Förder-Nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).

<html> und durchgeführt in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften:; Alle Verfahren wurden vom Ausschuss des Pasteur-Institut und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (2012-0015 Vertragsnummer Ethikkommission IDF-Paris 1, Paris, Frankreich) genehmigt. 1. Materialien und Reagenzien <ol><li> Verwenden weiblichen Anopheles - Mücken stephensi (Sda500 Stamm) , die auf infizierten Mäusen ernähren 3-5 Tage nach dem Auflaufen und hinten wie zuvor 21 beschrieben. </li><li> Verwenden Parasiten Plasmodium berghei ANKA Klon mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Heat Shock Protein 70 (HSP70) Promotors. Dies ergibt helle Fluoreszenz während des gesamten Lebenszyklus Parasit 22. </li><li> Verwenden weibliche C57BL / 6JRj Mäuse (7 Wochen alt). HINWEIS: Alle Reagenzien in dem beschriebenen Protokoll verwendet werden , in der T aufgeführt Lage von Materialien / Ausrüstung. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-attenuierten Sporozoiten-Isolation von Mosquito Speicheldrüsen <ol><li> Zwischen 18-25 Tage nach dem infektiösen Blutmehl, sammeln und kalt betäuben Stechmücken in einen 15 - ml - Röhrchen auf Eis , wie zuvor 21 beschrieben. übertragen Sie sie vorsichtig auf eine Petrischale durch das Rohr zu invertieren. Pflegen Sie die Insekten auf Eis und entlarven die Mücken zu einer 12 krad Dosis von γ- oder Röntgenbestrahlung. </li><li> Isolieren abgeschwächten Sporozoiten aus bestrahlten Moskitospeicheldrüsen , wie zuvor beschrieben 21. Sammeln infizierten Speicheldrüsen in einem kleinen Volumen (etwa 15 ul) 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und sanft zerdrücken sie Sporozoiten freizusetzen. HINWEIS: Die Injektion einer stark konzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen kritisch, es ist daher wesentlich, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von einer hohen Anzahl von vorgewählten gut infizierten Mücken zu ernten, wie durch ihre robuste ExpressionGrün-Fluoreszenz. </li><li> Filtern Sie die Sporozoiten-Suspension durch eine 35 &amp; mgr; m Zellsieb Kappe angepasst auf eine niedrige Adhäsion 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu beseitigen, um Klumpen und Moskito Schutt. </li><li> Zählen Sie die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten wie zuvor 21 beschrieben und stellen Sie die Konzentration der Parasiten Suspension mit kaltem 1x DPBS 83.000 Sporozoiten / ul zu erhalten. Lagern Sie die Parasiten auf Eis, während die nächsten Schritte fort. </li><li> Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Speicheldrüsen von nicht infizierten Moskitos, die als Negativkontrolle verwendet werden und verarbeiten, um die Probe wie in den Schritten 2.2 und 2.3. Verdünne die Probe wie oben angegeben ähnliche Konzentration der Speicheldrüsenextrakten in der Suspension zu erhalten. HINWEIS: Sporozoiten können für maximal 2 Stunden auf Eis gelagert werden. Allerdings, im Idealfall sind sie innerhalb einer Stunde eingespritzt, nachdem die Speicheldrüsen zerdrücken. </li></ol> 3. Die Injektion von Sporozoiten in die Dermal Layer des Ohres <ol><li> Anästhesieren Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (50 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) -Mischung. Warten 5-8 min für die Maus in einen Zustand der Bewusstlosigkeit sein und gelten Augensalbe für die Augen kornealen Austrocknen zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch eine sanfte Zehe Prise an beiden hinteren Füße durchführen. HINWEIS: Die Dosis der Anästhesie dauert weniger als 20 Minuten, so dass die nächsten Schritte müssen schnell ausgeführt werden. </li><li> Stabilisieren Sie die Ohrmuschel der Maus durch die Bauchseite mit durchsichtigem Klebeband Befestigung zuvor unter einem Stereomikroskop (1A) angeordnet. Drücken Sie vorsichtig die Ohrschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine 10 ul Spritze / 35 Gauge abgeschrägte Nadel mit 0,6 ul resuspendiert Parasiten 10. </li><li> Liefern den Sporozoiten - Suspension in 4 Injektionsstellen (0,15 &amp; mgr; l pro Stelle) durch vorsichtiges die Nadel auf der Rückenseite des Ohres (1A) Einsetzen unter der Epidermis, mitdie Schräge nach oben, Pflege keine Blutgefäße zu vermeiden,. Erlauben die Nadel in der Dermis zu verbleiben einige sec Rückfluss des Injektats zu verhindern, bevor es entfernt wird. Beobachten einer Charakteristik papule an jeder Injektionsstelle am Ende des Verfahrens (1B und 1C). </li><li> Nach der Injektion entfernen Sie vorsichtig das Ohr vom Band. </li><li> Spritzen Sie das kontralaterale Ohr mit der gleichen Dosis von Parasiten durch die Schritte 3,2-3,4 folgen. </li><li> Injizieren Sie 2 zusätzliche Mäuse entweder mit 0,6 ul 1x DPBS oder 0,6 ul 1x DPBS + Speicheldrüsenextrakt von nicht infizierten Mücken, um die Entzündungsreaktion zu bewerten allein durch die Injektion vermittelt und die Ablagerung von Moskitomaterial in der Dermis. </li><li> Überwachen Sie die Maus aus der Narkose, bevor es wieder in den Käfig legen. HINWEIS: Die richtige Sporozoiten - Ablagerung in der Haut kann durch Fluoreszenzmikroskopie (2A und 2B überwacht werden), Wobei die Maus previsously 23 beschrieben , hergestellt. </li></ol> 4. Haut und ableitenden Lymphknoten Dissektion <ol><li> Bereiten Standardmedium (SM), wie folgt: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), ergänzt mit 400 U / ml Kollagenase und 50 ug / ml Deoxyribonuclease (DNase) . </li><li> Bereiten Sie zwei 6-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten auf Eis mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb pro Vertiefung für dLN Proben (Tafel A) und 4,5 ml SM pro Vertiefung für Hautproben (Tafel B). </li><li> Zum gewünschten Zeitpunkt folgende Sporozoiten Inokulation betäuben tief mit der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg) / Xylazin (12,5 mg / kg) Mischung vor Zervikaldislokation. Stellen Sie sicher, dass die Maus Zeichen der klinischen Tod demonstriert und die Präparation sofort beginnen. HINWEIS: Die Kinetik der myeloiden Zellrekrutierung können zu verschiedenen Zeiten nach inj sucht werdenection (dh 2 Stunden, 4 Stunden und 24 Stunden , wie zuvor 14 beschrieben). </li><li> Desinfizieren des beimpften Ohr und den entsprechenden Halsbereich mit 70% Ethanol, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren. </li><li> Mit einer sterilen Schere und Pinzette, sezieren aseptisch das proximale Ohrmuschel dLN ohne das umgebende Fett zu sammeln. Führen Sie einen ersten Einschnitt in der jugulo-carotidian Sulcus und entfernen Sie die Haare aus dem Operationsfeld. Dehnen Sie den Schnitt mit 2 Zange die dLN auszusetzen, die im Vergleich zu dem umgebenden Gewebe gräulich erscheint. </li><li> Pinch das Bindegewebe vorsichtig auf der Oberseite des dLN mit einer Pinzette ihre Entfernung zu erleichtern. Extrahieren Sie die dLN durch eine Zange unterhalb des lymphatischen Gewebes platzieren (3A und 3B). Legen Sie die dLN in einer Vertiefung mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb (Tafel A). </li><li> Ernten Sie die gesamte beimpft Ohr mit einer sterilen scharfen Schere und Pinzette (4A). separaßen die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres durch Kneifen und Beabstanden den Schnitt mit zwei Zangenenden (4B - 4E). Legen Sie sie in einen Brunnen, die 4,5 ml SM (Tafel B) dafür, dass beide Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht. HINWEIS: Um die Zuverlässigkeit des Experiments zu verbessern und die Anzahl der Zellen von Interesse zu erhöhen, Pool 2 injiziert Ohren oder 2 DLNs aus der gleichen Maus pro Probe. </li><li> Ernte und Prozess parallel die Ohren und DLNs der Mäuse geimpft mit entweder 1x DPBS oder Speicheldrüsenextrakten. Fügen Sie zwei zusätzliche Ohr und Lymphknoten von einer naiven Maus geerntet Proben für negative und Einzelfärbung Kompensationssteuerungen. </li></ol> 5. Zellisolierung aus Lymphknoten <ol><li> Inkubieren der Lymphknoten (Tafel A) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 15 min unter leichtem Schütteln. Zugabe von 10 mM final Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Vertiefung zu neutralisieren Kollagenase und DNase activitäten. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Dissoziieren Lymphknoten das obere Ende eines 5 ml Spritzenkolben verwendet. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie das Zellsieb zweimal mit 500 &amp; mgr; l 1x DPBS + 2% fötales Rinderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Übertragen gesamte Volumen der gut in einem 15-ml-Tube. </li><li> Spülen Sie die gut zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 15-ml-Tube. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol> 6. Zellisolierung aus Haut des Ohres <ol><li> Inkubieren der Ohr Blättchen (Tafel B) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. HINWEIS: Nach 20 Minuten Inkubation, schneiden Sie die Ohr Faltblätter mit einer Schere in kleine Stücke Gewebe Verdauung und legte die Probe zurück in den Inkubator für die restlichen 40 min zu erleichtern. Einzelne Zellen können in dem Medium am Ende der Inkubationszeit beobachtet werden. </li><li> In 10 mM final<html> EDTA pro Vertiefung Kollagenase und DNase Aktivitäten zu neutralisieren. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie die Ohrgewebefragmente und das gesamte Volumen des Mediums in ein neues und ein 70 &amp; mgr; m Zelle Sieb mit einer 1 ml Pipette enthält. Schneiden Sie 2 bis 3 mm vom Ende der Spitze der Ohrgewebefragmente leichter zu sammeln. </li><li> Ohrgewebefragmente mit dem oberen Ende eines 5 ml Spritzenkolben dissoziieren. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie die Zelle strainers zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Übertragen, das gesamte Volumen der Vertiefung in eine 50 ml-Röhre durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> Spülen Sie die gut mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 50-ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen auf Eis. HINWEIS: Die verschiedenen Schritte gesamten Zellen aus der Haut und dLN Geweben in Figur 5 zusammengefaßt sind , zu isolieren. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Graf und Viability von gesammelten Zellen <ol><li> Zentrifugieren Sie die Haut und dLN Proben für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Sammeln ein kleines Volumen jeder Probe die Gesamtanzahl von Zellen aus der Haut und dLN unter Verwendung eines Hämozytometers getrennt zu zählen. In 0,04% Trypanblau die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. </li></ol> 8. Die Blockierung der Non Antigen-spezifische Bindung <ol><li> Werden 10 &amp; mgr; g / ml unmarkiertes CD16 / CD32 Fc-block-Antikörper. Inkubiere 20 Minuten bei 4 ° C (kann länger gehen). </li><li> 2 ml kaltem DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und halten Sie die Proben auf Eis. </li></ol> 9. Die Färbung der Haut und des Lymph Node myeloischen Zellen <ol><li> Inkubieren zuvor blockierten Skin und dLN isolierten Zellen mit Live / Dead tracker (dh 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI), anti-CD45 und anti-CD11b spezifischen Antikörper. Hinweise: Damit können die myeloischer Zell - Subpopulationen von Interesse, vor allem seltene, CD45 + Zellen und Lymphozyten bzw. von der Haut oder von der dLN von magnetischen Kügelchen erleichternde Zellsortierung verarmt gereinigt werden , um zu bereichern. Da die meisten der von der dLN isolierten Zellen sind CD45 +, die Verwendung von anti-CD45 ist nicht zwingend. Andere Marker können myeloischer Zell-Subpopulationen von Interesse zu identifizieren durch positive oder negative Anschnitts Strategie einbezogen werden. In diesem Protokoll werden die myeloische in der dLN rekrutierten Zellen durch den Ausschluss CD8a + Zellen angereichert wurden (die gesamte T - Zell - Fach unter Verwendung von Anti-CD3 - spezifischen Antikörper gezielt werden kann). </li><li> Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. In 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, Zentrifuge die Probe 5 min bei 450 × g bei 4 ° C und entsorgen Sie die Supernatant. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. </li><li> Resuspendieren der Proben mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Übertragen Sie das gesamte Volumen in einem FACS-Röhrchen durch ein 35 &amp; mgr; m Zelle Sieb. Spülen Sie den Filter mit 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor leben Einzelzellen (DAPI -, FSC-W) abgestorbenen Zellen und Dubletten auszuschließen. Plot CD45 + CD11b + Ereignisse für die Haut (6A) und (CD45 +) CD8a - CD11b + Veranstaltungen für die dLN (6B). </li></ol>

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	<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li><li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites.">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface.">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li><li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schl&#252;ter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li><li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8++T+cells.">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li><li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated,+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells.">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li><li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites.">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment.">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li><li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum.">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136 (2014).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal.">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li><li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site.">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li><li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li><li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation:+clearance+after+immunization,+susceptibility+to+primaquine,+and+contribution+to+blood-stage+infection.">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li><li>Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+protective+against+malaria+liver+stages+are+primed+in+skin-draining+lymph+nodes.">CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes.</a> Nat Med. 13 (9), (2007).</li><li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria.">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver.">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-node+resident+CD8&#945;++dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8++T+cell+responses.">Lymph-node resident CD8&#945;+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).</li><li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites.">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li><li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin.">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li><li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response.">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li><li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell.">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host.">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li><li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents.">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li><li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In der Perspektive von großen Impfung von Menschen eine ganze Sporozoiten - Impfstoff gegen Malaria verwendet, einer der wichtigsten Herausforderungen zu überwinden , ist es , optimierte Routen und Methoden der Parasit Verabreichung entwickeln erfolgreiche Immunisierung und Schutz 24,25 zu gewährleisten. Beim Menschen hat die Bewertung der Schutzwirkung vermittelt durch lebende , abgeschwächte Parasiten (LAP) nach Natur Mücke durchgeführt worden beißt 2 sowie intradermale, subkutane 25,...

Malaria ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten der Welt, mehr als eine halbe Million Menschen pro Jahr töten. Infektionen durch Plasmodium, dem Erreger der Krankheit beginnt mit einem vorge erythrozytären (PE) -Phase. Während dieser Phase in die Wirts Haut von einer Mücke weiblichen Anopheles injiziert Sporozoiten erreichen die Leber über die Blutbahn und im Inneren Hepatozyten in die Parasitenformen unterscheiden , die roten Blutkörperchen infizieren und bewirken , dass die Symptome der Krankheit. Die PE - Stadien von Plasmodium stellen eine privilegierte Ziel für Anti-Malaria - Impfung. Tatsächlich abgeschwächten Lebendimpfstoffe gegen diesen Phasen, wie Strahlung abgeschwächt Sporozoiten (RAS), genetisch verhaftet Parasiten (GAP) oder Chemoprophylaxe und Sporozoiten (CPS) haben ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt 1-9 sowohl Nagetier und menschlichen Wirten zu schützen. Im Nagetiermodell sind die meisten Impfung Studien intravenöse Immunisierung unter Verwendung von, Das ist der Goldstandard in Bezug auf die Schutzwirkung. Allerdings hat die Beschreibung einer Haut Stufe und die Bedeutung der Haut-assoziierten Lymphknoten (dLN) bei der Auslösung Schutz unserer Wahrnehmung der PE-Phase geändert und betonte die Bedeutung der intradermale Route der Injektion. Intravital Bildgebung von P. berghei - Sporozoiten in die Haut von Nagetieren injiziert hat gezeigt , dass nur ~ 25% des Inokulums über die Blutbahn in die Leber gelangt. Die verbleibende ~ 75% verteilt sich zwischen dem proximalen dLN (~ 15%) und der Haut (~ 50%) 10,11, wo ein kleiner Anteil verwandeln und am Leben bleiben über Wochen Innenhautzellen 12,13. Außerdem beschrieben nachfolgende Studien , dass die Schaffung von wirksamen Schutzimmunität nach intradermale Immunisierung vor allem in der Haut-dLN nimmt, wo Parasiten spezifischen CD8 + T - Zellen aktiviert werden, und nur geringfügig in der Milz oder Leber-DLNs 14,15. Währenddie meisten Studien haben sich auf die Charakterisierung der Effektor-Zellen in der Einrichtung protektive Immunantwort beteiligt konzentriert, noch viel weniger wird über das Schicksal von lebenden attenuierten Parasiten in die Haut injiziert bekannt, insbesondere ihre Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Insbesondere Charakterisierung von Antigen-präsentierenden in Parasit - Antigen - Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation für CD8 + T - Zellen beteiligten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, zu wissen , dass Akquisitions PE Antigen sowohl in der Haut und dLN Kompartimente auftreten können. Zurück intravital Bildgebungsstudien beschrieben einen frühen Zustrom von hell fluoreszierende Lys-GFP - positiven Zellen in der Haut nach einem infektiösen Mückenstich 16 , während frühe Interaktionen zwischen Sporozoiten und dendritischen Zellen wurden in der dLN 10,17 beobachtet. In jüngerer Zeit hat es sich durch Mücken in der Haut inokuliert Sporozoiten erhöht die Beweglichkeit der beiden dendritischen und regulatorische T-Zellen in der Haut berichtet, dassMäuse, während eine Abnahme Anzahl von Antigen - präsentierenden Zellen in der dLN 18 beobachtet. Wir sollen , zu identifizieren und genauer die Leukozytenuntergruppen rekrutiert in der Haut und entsprechenden dLN sowie diejenigen mit dem Parasiten zu quantifizieren 19 folgende intradermale Injektion von immunisierenden Dosen von RAS zu interagieren. In diesem Zusammenhang isolierten wir myeloiden Zellen (CD45 + CD11b +) von beiden Geweben und gekennzeichnet Subpopulationen von Interesse durch Mehr = parametrischer Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit der Immunantwort in der frühen Phase der Haupt Leishmania beschrieben Infektion der Haut 20, die primäre Wirtsantwort Injektion Sporozoiten besteht aus einer aufeinanderfolgenden Einstellung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , gefolgt von inflammatorischen Monozyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) , die auf der Basis von differenti identifiziertal Expression der Ly6G und Ly6C Oberflächenmarker. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die myeloischen Zellen aus der Haut von Mäusen zu isolieren und dLN folgende intradermale Injektion von infizierten Mücke Speicheldrüsen extrahiert Dosen von RAS immunisieren. Reproduzierbare intradermale Injektionen und Gewebeverarbeitung sind wichtige Schritte phänotypischen Veränderungen infiltrieren Zellpopulation innerhalb infizierten Geweben zu quantifizieren. Der Ansatz detailliert unten stellt einen zuverlässigen Assay die Haut und dLN entzündliche Reaktion auf Plasmodium Parasiten zu bewerten und kann auf verschiedene experimentelle Systeme erweitert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine: Imalgene&#174; 1000</td>
			<td>Merial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine: Rompun&#174; 2%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican&#174; 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U.</td>
			<td>B. Braun Medical&#160;</td>
			<td>9151125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &#8211; Flat Bottom</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352350</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-02S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352098</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35&#181;m Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X + GlutaMAXTM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C5138</td>
			<td>400 U/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5025</td>
			<td>50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E-5134</td>
			<td>10mM or 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain (0,4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Dilution 1:10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>10&#181;g/ml final (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI FluoroPureTM grade</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D21490</td>
			<td>1&#181;g/ml final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559864</td>
			<td>&#160;Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td>&#160;Dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945; (5H10 clone)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MCD0830</td>
			<td>&#160;Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&#160;</td>
			<td>Janvier Laboratories</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

Malaria - Infektion beginnt , wenn die Sporozoiten - Stadium von Plasmodium in die Haut eines Säugerwirt durch einen Mückenstich beimpft. Der hoch motile Parasit nicht erreicht nur die Leber Hepatozyten einzudringen und in Erythrozyten-infektiöse Form verwandeln. Es wandert auch in die Haut und zum proximalen Lymphknoten die Injektionsstelle Entwässern, wo sie von resident und / oder rekrutiert myeloischen Zellen erkannt und abgebaut werden können. Intravital Imaging berichtet die frühe Rekrutierung von hell fluoreszierende Lys-GFP positiven Leukozyten in der Haut und den Wechselwirkungen zwischen Sporozoiten und CD11c + Zellen im Lymphknoten. Wir präsentieren hier ein effizientes Verfahren zu erholen, zu identifizieren und die myeloischen Zelluntergruppen aufzuzählen, die auf die Haut von Mäusen angeworben werden und ableitenden Lymphknoten folgende intradermale Injektion von Dosen von Sporozoiten in einem Mausmodell immunisieren. Phänotypischen Charakterisierung mittels Multi-parametrischer Durchflusszytometrie bietetein zuverlässiger Assay frühen dynamischen zellulären Veränderungen bei entzündlichen Reaktion auf Plasmodium - Infektion zu bewerten.

Wir haben kürzlich gezeigt , dass die Nadel-Spritze Injektion von immunisierenden Dosen von P. berghei Sporozoiten in die Haut von Mäusen eine sukzessive Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten , gefolgt von inflammatorischen Monozyten in der Haut und dLN 19 induziert. Das Protokoll Abschnitt oben beschriebenen Verfahrensdetails verwendet , um erfolgreich Live - myeloischen Zellen aus beiden Geweben nach mehrfachen Injektionen von großen Anzahl von Sporozoiten i...

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Aufrufe.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Serie: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...