저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA - 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 &quot;전염병을 신흥의 통합적인 생물학&quot;에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).

<html> 모든 절차는 파스퇴르 연구소의위원회와 지역 동물 실험에 대한 윤리위원회 (윤리위원회 IDF-파리 1, 파리, 프랑스,​​ 계약 번호 : 2012-0015)에 의해 승인하고, 해당 지침과 규정에 따라 수행. 1. 재료 및 시약 <ol><li> 이전 21 설명 된대로 3~5일 출현과 후면 후 감염된 쥐에 먹이 여성 아노 펠 레스 stephensi 모기 (Sda500 변형)를 사용합니다. </li><li> 사용 기생충 구성 적 열 충격 단백질 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현 변형체 berghei ANKA 클론. 이 기생충의 라이프 사이클에 걸쳐 22 밝은 형광을 산출한다. </li><li> 사용 여성 C57BL / 6JRj 마우스 (7 주령). 참고 : 설명 프로토콜에 사용 된 모든 시약은 재료 / 장비의 수 T에 나열되어 있습니다. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. 방사선 감쇠 모기 침샘에서 포자 소체 격리 <ol><li> 전염성 혈액 식사 후 18~25일 사이에 수집하고 이전 21 설명 된 바와 같이 얼음에 15 ML 튜브로 모기를 초기 마취. 조심스럽게 튜브를 반전하여 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 얼음에 곤충을 유지하고 γ- 또는 X-조사의 12 krad 용량에 모기를 노출합니다. </li><li> 조사 된 모기의 침샘에서 감쇠 포자 소체를 격리는 이전 21 설명했다. 포자 소체를 해제하도록 호감을 부드럽게 얼음에 배속 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 (15 μl의 주위에) 작은 볼륨에 감염된 침샘을 수집합니다. 참고들의 강력 발현에 의해 입증 비판적 소량의 고농도 기생충 현탁액의 주입, 미리 선택된 잘 감염된 모기의 높은 번호로부터 침샘의 충분한 수를 채취하는 것이 중요녹색 형광. </li><li> 덩어리 모기 파편을 제거하기 위해 낮은 밀착성 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 구성된 35 μm의 셀 스트레이너 캡을 통해 포자 소체 현탁액 필터. </li><li> 이전 21 바와 같이 절연 포자 소체의 총 수를 계산하고 83000 포자 소체 / μL를 얻는 냉간 1X DPBS로 기생충 현탁액의 농도를 조절한다. 다음 단계를 계속하는 동안 얼음에 기생충을 저장합니다. </li><li> 음성 대조군으로 사용하고 단계 2.2 및 2.3에 설명 된대로 샘플을 처리한다 감염되지 않은 모기의 침샘에 해당하는 번호를 수집합니다. 서스펜션의 침샘 추출물의 비슷한 농도를 얻기 위해 전술 한 바와 같이 샘플을 희석. 주 : 포자 소체 2 시간의 최대 얼음에 저장 될 수있다. 그러나 이상적으로 그들은 침샘을 분쇄 한 후 시간 이내에 주입된다. </li></ol> 진피 라에 포자 소체 3. 주입귀 YER <ol><li> 케타민의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 마우스가 의식 불명의 상태에 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하는 5-8 분을 기다립니다. 모두 후방 발에 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 평가합니다. 주 : 마취 투여 량 미만에서 20 분 동안 지속되므로, 다음과 같이 신속하게 수행되어야한다. </li><li> 이전에 실체 (그림 1A) 아래에 위치 명확한 테이프로 복부 측면을 고정하여 마우스의 귀 날개를 안정. 조심스럽게 혈관의 손상을 방지하기 위해 귀를 누릅니다. </li><li> 재현 탁 기생충 (10)의 0.6 μL와 10 μL 주사기 / 35 게이지 비스듬한 바늘을 넣습니다. </li><li> 와, 조심스럽게 표피 아래, 귀 (그림 1A)의 등쪽면에 바늘을 삽입하여 4 주입 사이트 (사이트 당 0.15 μL)의 포자 소체 서스펜션을 제공베벨까지, 모든 혈관을 피하기 위해주의하면서. 몇 초를 제거하기 전에 주입 물의 역류를 방지하기 위해 바늘이 진피에 남아있을 수 있습니다. 절차 (도 1b 및도 1c)의 단부에 각각 주사 부위 구진 특성을 관찰한다. </li><li> 주입 후, 조심스럽게 테이프에서 귀를 제거합니다. </li><li> 단계 3.2-3.4의 기생충에 따라 동일한 용량과 반대측 귀 주입한다. </li><li> 단독 주입 및 진피 모기 재료의 증착에 의해 매개되는 염증 반응을 평가하기 위해 1X DPBS 0.6 μL 또는 비감염 모기에서 1X DPBS + 침샘 추출물 0.6 μL 중 2 부가 마우스 주입. </li><li> 새장에 다시 배치하기 전에 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다. 주 : 피부 적절한 포자 소체 증착 형광 현미경 (도 2a 및도 2b로 모니터링 할 수있다previsously 23 설명 참조)는, 마우스가 준비되고있다. </li></ol> 4. 피부와 배수 림프절의 해부 <ol><li> 표준 매체 (SM)를 준비 다음과 같이 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) + 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 400 U 보충 -1 - 라진 에탄 산 (HEPES) / ㎖ 콜라게나 제 50 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 (DNase의) . </li><li> DLN 샘플 잘 당 + 70 μm의 셀 스트레이너 4.5 ml의 SM (플레이트 A) 및 피부 샘플 웰 당 4.5 ML의 SM (플레이트 B)와 얼음이 6도 평면 바닥 조직 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 포자 소체 접종 다음 원하는 시점에서 깊이 복강 주사 케타민 (125 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏)의 혼합물 종래 경추 탈구하여 마우스를 마취. 마우스가 임상 죽음의 흔적을 보여줍니다 확인하고 즉시 절개를 시작합니다. 참고 : 골수 세포 모집의 반응 속도는 INJ 후 서로 다른 시간에 검사 할 수ection (즉, 2 시간, 4 시간 이전 14 설명 된 바와 같이 24 시간). </li><li> 오염의 가능성을 줄이기 위해 귀 접종하고 70 % 에탄올로 대응 목 부위를 소독. </li><li> 멸균 가위와 집게를 사용하여 무균 주변의 지방을 수집하지 않고 근위 귀의 DLN을 해부하다. jugulo-carotidian 고랑의 첫 번째 절개를 수행하고 운영 필드에서 머리카락을 제거합니다. 주변 조직에 비해 잿빛 나타나는 DLN을 노출이 집게로 절개 스트레치. </li><li> 그것의 제거를 용이하게하기 위해 집게와 DLN의 상단에 조심스럽게 결합 조직을 꼬집어. 림프 조직 (그림 3a 및 3b) 밑에 집게를 배치하여 DLN의 압축을 풉니 다. 잘 포함하는 4.5 ml의 SM + 70 μm의 셀 스트레이너 (플레이트 A)에 DLN를 놓습니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위와 집게 (그림 4A)를 사용하여 전체 접종 귀를 수확. Separ곤란과 두 개의 집게 (- 4E 그림 4B)로 끝나는 컷 떨어져 간격으로 귀 지느러미와 복부 측면을 먹었다. 두 조직이 완전히 매체에 몰입 확인하고 잘 포함하는 4.5 ml의 SM (플레이트 B)로 배치합니다. 참고 실험의 신뢰도를 향상시키고 관심 셀의 수를 증가시키기 위하여, 풀 2 샘플 당 동일한 마우스 귀에서 2 dLNs 주입. </li><li> 귀 및 1X DPBS 또는 침샘 추출물 중 하나를 접종 마우스의 dLNs 병렬 수확 및 처리. 음의 단일 얼룩 보상 컨트롤 순진 마우스에서 수확이 추가 귀 림프절 샘플을 포함합니다. </li></ol> 림프절 5. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 15 분 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 림프절 (플레이트 A)를 품어. 콜라게나 제와 DNase의 ACTI을 중화 잘 당 10 mM의 최종 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가vities. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용 림프절 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 ㎕의 1X DPBS + 2 % 소 태아 혈청 (FBS) + 2mM의 EDTA 회 셀 스트레이너 헹군다. 15 ML 튜브에 잘의 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> + 2 % FBS + 2mM의 EDTA 500 μl의 1X DPBS로 잘 두 번을 씻어 15 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol> 귀의 피부 6. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 귀 전단지 (플레이트 B)를 품어. 참고 : 배양 20 분 후, 조직 소화를 촉진하고 나머지 40 분 동안 인큐베이터에 다시 샘플을 넣어 작은 조각으로 가위로 귀 전단지를 잘라. 단일 세포 배양 시간의 끝에서 배지에서 관찰 될 수있다. </li><li> 10 mM의 최종 추가<html> 물론 당 EDTA는 콜라게나 제와 DNase의 활동을 무력화합니다. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 새가 아니라 1 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 셀 스트레이너를 포함에 귀 조직 파편과 매체의 전체 볼륨을 전송합니다. 쉽게 귀 조직 단편을 수집 팁의 단부로부터 2 ~ 3 mm를 잘라. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용하여 귀 조직 단편 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 두 번 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 50 ㎖ 튜브에 잘 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> 잘 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS와 + 2 mM의 EDTA를 씻어 50 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 다른 단계는 피부에서 총 세포를 분리하고 DLN 조직은 그림 5에 요약되어있다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 7. 백작과 생존 수집 세포의 <ol><li> 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 피부와 DLN 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 사용하여 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 피부 DLN으로부터 분리 된 세포의 총 수를 계산하기 위해 각각의 샘플의 작은 양을 수집한다. 0.04 %에게 세포 생존을 결정하는 트리 판 블루를 추가합니다. </li></ol> 8. 비 차단 항원 특이 적 결합 <ol><li> 라벨이없는 CD16 / CD32 된 Fc 블록 항체의 10 ㎍ / ML을 추가합니다. (더 이상 갈 수있다) 4 ° C에서 20 분을 품어. </li><li> 차가운 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 2 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA 300 μl의 1X DPBS로 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 샘플을 유지한다. </li></ol> 9. 염색 피부와 림프절 골수성 세포 <ol><li> 이전에 차단 스키를 품어n 및 DLN 라이브 / 죽은 추적기 (즉, 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 또는 DAPI), 항 CD45 및 안티 CD11b를 특정 항체와 세포입니다. 주 : 관심의 골수 세포 개체군 특히 진귀한 농축하기 위해, CD45 + 세포 및 림프구는 각각 피부로부터 정제 될 수 있거나 또는 자기 비드 촉진 셀 소팅에 의해 DLN 120408. DLN 분리 대부분의 셀 이후 + CD45, 항 CD45의 사용이 필수적이다 아니다. 다른 마커는 양 또는 음의 게이팅 전략으로 관심 골수 세포 개체군을 식별하기 위해 포함될 수있다. 이 프로토콜에서, DLN에 모집 골수 세포 CD8α + 세포를 제외하여 농축 하였다 (전체 T 세포 구획 항 CD3 특이 적 항체를 사용하여 타겟팅 될 수있다). </li><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 450 XG에 500 μl의 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA, 원심 분리기 샘플 5 분을 추가하고 공중으로 폐기rnatant. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 함께 샘플을 재현 탁. 35 μm의 세포 여과기를 통하여 FACS 튜브 내의 전체 볼륨을 전송. 100 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 가진 필터를 씻어. </li><li> 유동 세포 계수기에서 염색 된 세포를 실행합니다. 게이트가 하나의 세포에게 살 (DAPI - FSC-W) 죽은 세포와 이중선을 제외 할. DLN (그림 6B)에 대한 CD11b를가 + 이벤트 - 피부 (도 6a)와 (CD45의 +) CD8α에 대한 플롯 CD45 + CD11b를가 + 이벤트. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 ...

말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화. 변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 - 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 한 것을 도시하고있다. ~ 나머지 75 %는 작은 비율이 피부 세포 (12, 13)의 내부 주 동안 살아 변환하고 남아있을 수 근위 DLN (~ 15 %)과 피부 (~ 50 %) 10, 11, 사이에 분배한다. 또한, 후속 연구는 피내 접종 후 효과적인 보호 면역의 설립은 주로 기생충 특정 CD8 + T 세포가 활성화되어 피부 DLN에서 발생, 만 소폭 비장이나 간 dLNs 14, 15에 있음을 설명했다. 동안대부분의 연구는 보호 면역 반응의 확립에 연루 이펙터 세포의 특성에 집중 한 덜은 선천성 면역계와의 상호 작용, 특히 피부에 주입 약독 기생충의 운명에 대해 공지되어있다. 특히, CD8 + T 세포 기생충 항원 흡수, 처리 및 표시에 관련된 항원 제시 세포의 특성화 PE 항원 취득 피부 DLN 구획 모두에서 발생할 수 있다는 것을 아는 것은 매우 중요하다. 이전 생체 내에 이미징 연구는 포자 소체와 수지상 세포 사이의 초기 상호 작용이 DLN 10,17에서 관찰하는 동안 감염 모기에 물린 16 다음 피부에 밝은 형광리스-GFP 양성 세포의 초기 유입을 설명했다. 더 최근에는 모기에 의해 피부에 접종하여 포자 소체가 피부에 모두 돌기 규제 T 세포의 운동성을 증가시키는 것으로보고되어있다마우스, 항원 제시 세포의 감소 된 수는 18 DLN 관찰하면서. 우리는 더 정확하게 식별하고, 백혈구의 서브 세트에 피부에 모집 RAS (19)의 투여가 면역 피내 주사 다음 기생충과 상호 작용하는 것과 같이 잘 DLN 대응 정량화 목적. 이러한 맥락에서, 우리는 모두 조직에서 골수 세포 (CD45 + CD11b를 +)를 분리하고 세포 계측법 = 다중 매개 변수 흐름에 의해 관심의 개체군을 특징으로한다. 슈만 편모충 주요 피부 감염 (20)의 초기 단계에 설명 된 면역 반응과 일치, 분사를 포자 소체하는 기본 호스트 응답은 염증성 단핵 세포 (CD45 + CD11b를 다음 다형 핵 호중구 (CD45 + CD11b를 + Ly6G + Ly6C의 INT)의 연속 모집으로 구성 + Ly6G - differenti에 기초하여 식별 Ly6C +)Ly6G 및 Ly6C 표면 마커의 알 식입니다. 우리는 마우스 피부에서 골수 세포를 분리하고 DLN 감염된 모기의 침샘에서 추출 RAS의 용량을 면역의 피내 주사를 다음 여기 프로토콜을 설명합니다. 재현 피내 주사 및 조직 처리는 감염된 조직 내에서 세포 인구 침투의 표현형 변화를 정량화하는 중요한 단계이다. 아래에 설명 된 접근 방식은 신뢰성있는 분석은 말라리아 기생충의 피부 DLN 염증 반응을 평가하기 위해 각종 실험 시스템으로 확장 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine: Imalgene&#174; 1000</td>
			<td>Merial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine: Rompun&#174; 2%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican&#174; 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U.</td>
			<td>B. Braun Medical&#160;</td>
			<td>9151125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &#8211; Flat Bottom</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352350</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-02S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352098</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35&#181;m Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X + GlutaMAXTM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C5138</td>
			<td>400 U/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5025</td>
			<td>50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E-5134</td>
			<td>10mM or 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain (0,4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Dilution 1:10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>10&#181;g/ml final (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI FluoroPureTM grade</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D21490</td>
			<td>1&#181;g/ml final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559864</td>
			<td>&#160;Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td>&#160;Dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945; (5H10 clone)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MCD0830</td>
			<td>&#160;Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&#160;</td>
			<td>Janvier Laboratories</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.

우리는 최근 P.의 면역 용량의 바늘 주사기 주입을 입증 마우스 피부는 피부와 DLN (19)의 염증성 단핵구 다음 다형 핵 호중구의 연속 채용을 유도에 berghei은 포자 소체. 프로토콜 절 위에 성공적으로 이어 진피 포자 소체의 다수의 다중 분사 다음 두 조직으로부터 살아있는 골수 세포를 분리하기 위해 사용 된 절차에 상세 설명 (도 1 및도 <s...

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K 조회수.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine 외면적인 림프절 외과

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

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