저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA - 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 &quot;전염병을 신흥의 통합적인 생물학&quot;에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).

<html> 모든 절차는 파스퇴르 연구소의위원회와 지역 동물 실험에 대한 윤리위원회 (윤리위원회 IDF-파리 1, 파리, 프랑스,​​ 계약 번호 : 2012-0015)에 의해 승인하고, 해당 지침과 규정에 따라 수행. 1. 재료 및 시약 <ol><li> 이전 21 설명 된대로 3~5일 출현과 후면 후 감염된 쥐에 먹이 여성 아노 펠 레스 stephensi 모기 (Sda500 변형)를 사용합니다. </li><li> 사용 기생충 구성 적 열 충격 단백질 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현 변형체 berghei ANKA 클론. 이 기생충의 라이프 사이클에 걸쳐 22 밝은 형광을 산출한다. </li><li> 사용 여성 C57BL / 6JRj 마우스 (7 주령). 참고 : 설명 프로토콜에 사용 된 모든 시약은 재료 / 장비의 수 T에 나열되어 있습니다. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. 방사선 감쇠 모기 침샘에서 포자 소체 격리 <ol><li> 전염성 혈액 식사 후 18~25일 사이에 수집하고 이전 21 설명 된 바와 같이 얼음에 15 ML 튜브로 모기를 초기 마취. 조심스럽게 튜브를 반전하여 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 얼음에 곤충을 유지하고 γ- 또는 X-조사의 12 krad 용량에 모기를 노출합니다. </li><li> 조사 된 모기의 침샘에서 감쇠 포자 소체를 격리는 이전 21 설명했다. 포자 소체를 해제하도록 호감을 부드럽게 얼음에 배속 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 (15 μl의 주위에) 작은 볼륨에 감염된 침샘을 수집합니다. 참고들의 강력 발현에 의해 입증 비판적 소량의 고농도 기생충 현탁액의 주입, 미리 선택된 잘 감염된 모기의 높은 번호로부터 침샘의 충분한 수를 채취하는 것이 중요녹색 형광. </li><li> 덩어리 모기 파편을 제거하기 위해 낮은 밀착성 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 구성된 35 μm의 셀 스트레이너 캡을 통해 포자 소체 현탁액 필터. </li><li> 이전 21 바와 같이 절연 포자 소체의 총 수를 계산하고 83000 포자 소체 / μL를 얻는 냉간 1X DPBS로 기생충 현탁액의 농도를 조절한다. 다음 단계를 계속하는 동안 얼음에 기생충을 저장합니다. </li><li> 음성 대조군으로 사용하고 단계 2.2 및 2.3에 설명 된대로 샘플을 처리한다 감염되지 않은 모기의 침샘에 해당하는 번호를 수집합니다. 서스펜션의 침샘 추출물의 비슷한 농도를 얻기 위해 전술 한 바와 같이 샘플을 희석. 주 : 포자 소체 2 시간의 최대 얼음에 저장 될 수있다. 그러나 이상적으로 그들은 침샘을 분쇄 한 후 시간 이내에 주입된다. </li></ol> 진피 라에 포자 소체 3. 주입귀 YER <ol><li> 케타민의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 마우스가 의식 불명의 상태에 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하는 5-8 분을 기다립니다. 모두 후방 발에 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 평가합니다. 주 : 마취 투여 량 미만에서 20 분 동안 지속되므로, 다음과 같이 신속하게 수행되어야한다. </li><li> 이전에 실체 (그림 1A) 아래에 위치 명확한 테이프로 복부 측면을 고정하여 마우스의 귀 날개를 안정. 조심스럽게 혈관의 손상을 방지하기 위해 귀를 누릅니다. </li><li> 재현 탁 기생충 (10)의 0.6 μL와 10 μL 주사기 / 35 게이지 비스듬한 바늘을 넣습니다. </li><li> 와, 조심스럽게 표피 아래, 귀 (그림 1A)의 등쪽면에 바늘을 삽입하여 4 주입 사이트 (사이트 당 0.15 μL)의 포자 소체 서스펜션을 제공베벨까지, 모든 혈관을 피하기 위해주의하면서. 몇 초를 제거하기 전에 주입 물의 역류를 방지하기 위해 바늘이 진피에 남아있을 수 있습니다. 절차 (도 1b 및도 1c)의 단부에 각각 주사 부위 구진 특성을 관찰한다. </li><li> 주입 후, 조심스럽게 테이프에서 귀를 제거합니다. </li><li> 단계 3.2-3.4의 기생충에 따라 동일한 용량과 반대측 귀 주입한다. </li><li> 단독 주입 및 진피 모기 재료의 증착에 의해 매개되는 염증 반응을 평가하기 위해 1X DPBS 0.6 μL 또는 비감염 모기에서 1X DPBS + 침샘 추출물 0.6 μL 중 2 부가 마우스 주입. </li><li> 새장에 다시 배치하기 전에 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다. 주 : 피부 적절한 포자 소체 증착 형광 현미경 (도 2a 및도 2b로 모니터링 할 수있다previsously 23 설명 참조)는, 마우스가 준비되고있다. </li></ol> 4. 피부와 배수 림프절의 해부 <ol><li> 표준 매체 (SM)를 준비 다음과 같이 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) + 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 400 U 보충 -1 - 라진 에탄 산 (HEPES) / ㎖ 콜라게나 제 50 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 (DNase의) . </li><li> DLN 샘플 잘 당 + 70 μm의 셀 스트레이너 4.5 ml의 SM (플레이트 A) 및 피부 샘플 웰 당 4.5 ML의 SM (플레이트 B)와 얼음이 6도 평면 바닥 조직 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 포자 소체 접종 다음 원하는 시점에서 깊이 복강 주사 케타민 (125 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏)의 혼합물 종래 경추 탈구하여 마우스를 마취. 마우스가 임상 죽음의 흔적을 보여줍니다 확인하고 즉시 절개를 시작합니다. 참고 : 골수 세포 모집의 반응 속도는 INJ 후 서로 다른 시간에 검사 할 수ection (즉, 2 시간, 4 시간 이전 14 설명 된 바와 같이 24 시간). </li><li> 오염의 가능성을 줄이기 위해 귀 접종하고 70 % 에탄올로 대응 목 부위를 소독. </li><li> 멸균 가위와 집게를 사용하여 무균 주변의 지방을 수집하지 않고 근위 귀의 DLN을 해부하다. jugulo-carotidian 고랑의 첫 번째 절개를 수행하고 운영 필드에서 머리카락을 제거합니다. 주변 조직에 비해 잿빛 나타나는 DLN을 노출이 집게로 절개 스트레치. </li><li> 그것의 제거를 용이하게하기 위해 집게와 DLN의 상단에 조심스럽게 결합 조직을 꼬집어. 림프 조직 (그림 3a 및 3b) 밑에 집게를 배치하여 DLN의 압축을 풉니 다. 잘 포함하는 4.5 ml의 SM + 70 μm의 셀 스트레이너 (플레이트 A)에 DLN를 놓습니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위와 집게 (그림 4A)를 사용하여 전체 접종 귀를 수확. Separ곤란과 두 개의 집게 (- 4E 그림 4B)로 끝나는 컷 떨어져 간격으로 귀 지느러미와 복부 측면을 먹었다. 두 조직이 완전히 매체에 몰입 확인하고 잘 포함하는 4.5 ml의 SM (플레이트 B)로 배치합니다. 참고 실험의 신뢰도를 향상시키고 관심 셀의 수를 증가시키기 위하여, 풀 2 샘플 당 동일한 마우스 귀에서 2 dLNs 주입. </li><li> 귀 및 1X DPBS 또는 침샘 추출물 중 하나를 접종 마우스의 dLNs 병렬 수확 및 처리. 음의 단일 얼룩 보상 컨트롤 순진 마우스에서 수확이 추가 귀 림프절 샘플을 포함합니다. </li></ol> 림프절 5. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 15 분 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 림프절 (플레이트 A)를 품어. 콜라게나 제와 DNase의 ACTI을 중화 잘 당 10 mM의 최종 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가vities. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용 림프절 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 ㎕의 1X DPBS + 2 % 소 태아 혈청 (FBS) + 2mM의 EDTA 회 셀 스트레이너 헹군다. 15 ML 튜브에 잘의 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> + 2 % FBS + 2mM의 EDTA 500 μl의 1X DPBS로 잘 두 번을 씻어 15 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol> 귀의 피부 6. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 귀 전단지 (플레이트 B)를 품어. 참고 : 배양 20 분 후, 조직 소화를 촉진하고 나머지 40 분 동안 인큐베이터에 다시 샘플을 넣어 작은 조각으로 가위로 귀 전단지를 잘라. 단일 세포 배양 시간의 끝에서 배지에서 관찰 될 수있다. </li><li> 10 mM의 최종 추가<html> 물론 당 EDTA는 콜라게나 제와 DNase의 활동을 무력화합니다. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 새가 아니라 1 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 셀 스트레이너를 포함에 귀 조직 파편과 매체의 전체 볼륨을 전송합니다. 쉽게 귀 조직 단편을 수집 팁의 단부로부터 2 ~ 3 mm를 잘라. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용하여 귀 조직 단편 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 두 번 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 50 ㎖ 튜브에 잘 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> 잘 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS와 + 2 mM의 EDTA를 씻어 50 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 다른 단계는 피부에서 총 세포를 분리하고 DLN 조직은 그림 5에 요약되어있다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 7. 백작과 생존 수집 세포의 <ol><li> 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 피부와 DLN 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 사용하여 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 피부 DLN으로부터 분리 된 세포의 총 수를 계산하기 위해 각각의 샘플의 작은 양을 수집한다. 0.04 %에게 세포 생존을 결정하는 트리 판 블루를 추가합니다. </li></ol> 8. 비 차단 항원 특이 적 결합 <ol><li> 라벨이없는 CD16 / CD32 된 Fc 블록 항체의 10 ㎍ / ML을 추가합니다. (더 이상 갈 수있다) 4 ° C에서 20 분을 품어. </li><li> 차가운 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 2 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA 300 μl의 1X DPBS로 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 샘플을 유지한다. </li></ol> 9. 염색 피부와 림프절 골수성 세포 <ol><li> 이전에 차단 스키를 품어n 및 DLN 라이브 / 죽은 추적기 (즉, 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 또는 DAPI), 항 CD45 및 안티 CD11b를 특정 항체와 세포입니다. 주 : 관심의 골수 세포 개체군 특히 진귀한 농축하기 위해, CD45 + 세포 및 림프구는 각각 피부로부터 정제 될 수 있거나 또는 자기 비드 촉진 셀 소팅에 의해 DLN 120408. DLN 분리 대부분의 셀 이후 + CD45, 항 CD45의 사용이 필수적이다 아니다. 다른 마커는 양 또는 음의 게이팅 전략으로 관심 골수 세포 개체군을 식별하기 위해 포함될 수있다. 이 프로토콜에서, DLN에 모집 골수 세포 CD8α + 세포를 제외하여 농축 하였다 (전체 T 세포 구획 항 CD3 특이 적 항체를 사용하여 타겟팅 될 수있다). </li><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 450 XG에 500 μl의 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA, 원심 분리기 샘플 5 분을 추가하고 공중으로 폐기rnatant. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 함께 샘플을 재현 탁. 35 μm의 세포 여과기를 통하여 FACS 튜브 내의 전체 볼륨을 전송. 100 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 가진 필터를 씻어. </li><li> 유동 세포 계수기에서 염색 된 세포를 실행합니다. 게이트가 하나의 세포에게 살 (DAPI - FSC-W) 죽은 세포와 이중선을 제외 할. DLN (그림 6B)에 대한 CD11b를가 + 이벤트 - 피부 (도 6a)와 (CD45의 +) CD8α에 대한 플롯 CD45 + CD11b를가 + 이벤트. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 ...

말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화. 변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 - 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 한 것을 도시하고있다. ~ 나머지 75 %는 작은 비율이 피부 세포 (12, 13)의 내부 주 동안 살아 변환하고 남아있을 수 근위 DLN (~ 15 %)과 피부 (~ 50 %) 10, 11, 사이에 분배한다. 또한, 후속 연구는 피내 접종 후 효과적인 보호 면역의 설립은 주로 기생충 특정 CD8 + T 세포가 활성화되어 피부 DLN에서 발생, 만 소폭 비장이나 간 dLNs 14, 15에 있음을 설명했다. 동안대부분의 연구는 보호 면역 반응의 확립에 연루 이펙터 세포의 특성에 집중 한 덜은 선천성 면역계와의 상호 작용, 특히 피부에 주입 약독 기생충의 운명에 대해 공지되어있다. 특히, CD8 + T 세포 기생충 항원 흡수, 처리 및 표시에 관련된 항원 제시 세포의 특성화 PE 항원 취득 피부 DLN 구획 모두에서 발생할 수 있다는 것을 아는 것은 매우 중요하다. 이전 생체 내에 이미징 연구는 포자 소체와 수지상 세포 사이의 초기 상호 작용이 DLN 10,17에서 관찰하는 동안 감염 모기에 물린 16 다음 피부에 밝은 형광리스-GFP 양성 세포의 초기 유입을 설명했다. 더 최근에는 모기에 의해 피부에 접종하여 포자 소체가 피부에 모두 돌기 규제 T 세포의 운동성을 증가시키는 것으로보고되어있다마우스, 항원 제시 세포의 감소 된 수는 18 DLN 관찰하면서. 우리는 더 정확하게 식별하고, 백혈구의 서브 세트에 피부에 모집 RAS (19)의 투여가 면역 피내 주사 다음 기생충과 상호 작용하는 것과 같이 잘 DLN 대응 정량화 목적. 이러한 맥락에서, 우리는 모두 조직에서 골수 세포 (CD45 + CD11b를 +)를 분리하고 세포 계측법 = 다중 매개 변수 흐름에 의해 관심의 개체군을 특징으로한다. 슈만 편모충 주요 피부 감염 (20)의 초기 단계에 설명 된 면역 반응과 일치, 분사를 포자 소체하는 기본 호스트 응답은 염증성 단핵 세포 (CD45 + CD11b를 다음 다형 핵 호중구 (CD45 + CD11b를 + Ly6G + Ly6C의 INT)의 연속 모집으로 구성 + Ly6G - differenti에 기초하여 식별 Ly6C +)Ly6G 및 Ly6C 표면 마커의 알 식입니다. 우리는 마우스 피부에서 골수 세포를 분리하고 DLN 감염된 모기의 침샘에서 추출 RAS의 용량을 면역의 피내 주사를 다음 여기 프로토콜을 설명합니다. 재현 피내 주사 및 조직 처리는 감염된 조직 내에서 세포 인구 침투의 표현형 변화를 정량화하는 중요한 단계이다. 아래에 설명 된 접근 방식은 신뢰성있는 분석은 말라리아 기생충의 피부 DLN 염증 반응을 평가하기 위해 각종 실험 시스템으로 확장 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ketamine: Imalgene&amp;reg; 1,000</td><td>Merial</td><td>-</td><td>50 mg/kg: prior sporozoite injection

125 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>Xylazine: Rompun&amp;reg; 2%</td><td>Bayer</td><td>-</td><td>5 mg/kg: prior sporozoite injection

12.5 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&amp;reg; 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&amp;nbsp;</td><td>9151125</td><td>-</td></tr><tr><td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &amp;ndash; Flat Bottom</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>-</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>-</td></tr><tr><td>2 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-02S</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td>-</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 &amp;micro;m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>-</td></tr><tr><td>DPBS 1x CaCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt; and MgCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt;-free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM 1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM or 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan blue Stain (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dilution 1:10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &amp;micro;g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; grade</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &amp;micro;g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha; (5H10 clone)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&amp;nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.

우리는 최근 P.의 면역 용량의 바늘 주사기 주입을 입증 마우스 피부는 피부와 DLN (19)의 염증성 단핵구 다음 다형 핵 호중구의 연속 채용을 유도에 berghei은 포자 소체. 프로토콜 절 위에 성공적으로 이어 진피 포자 소체의 다수의 다중 분사 다음 두 조직으로부터 살아있는 골수 세포를 분리하기 위해 사용 된 절차에 상세 설명 (도 1 및도 <s...

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.2K 조회수.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

연구

면역학 및 감염병학

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

<meta charset="utf8"></head><body>피내 칸디다 알비칸스 감염에서 Th17 면역을 유도하기 위한 피부 수지상 세포의 차등 부분 집합의 생체 내 기능

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

생체 내 피내 칸디다 알비칸스 감염에서 Th17 면역을 유도하기 위한 피부 수지상 세포의 차등 부분 집합의 기능

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

요약

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이 비디오의 챕터

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

생체 내 피내 칸디다 알비칸스 감염에서 Th17 면역을 유도하기 위한 피부 수지상 세포의 차등 부분 집합의 기능

생체 내 피내 칸디다 알비칸스 감염에서 Th17 면역을 유도하기 위한 피부 수지상 세포의 차등 부분 집합의 기능