This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Hinweis: Die Fotomasken-Designs für unsere Mikrofluidik-Vorrichtung Fertigung wurden gezeichnet von einem Computer Aided Design (CAD) Software. Die Entwürfe wurden dann verwendet, um Chrom Photomasken herzustellen Kommerzielle Dienst. Die PDMS - Geräte wurden unter Verwendung von weichen Lithographietechniken hergestellt. 11 1. Herstellung von Urformen von Lithography <ol><li> Vor dem photolithographischen Prozeß 12, verwenden , um die 4-Zoll - Siliziumwafer als Substrat und entwässern um die Wafer in einem konventionellen Ofen bei 120 ° C für 10 min. </li><li> Reinigen Sie die dehydriert Silizium-Wafern durch Sauerstoffplasmabehandlung bei 100 Watt für 30 Sekunden in einem Plasma-Reiniger. </li><li> Vorwärmen zwei Kochplatten bei 65 ° C und 95 ° C, jeweils für die nachfolgenden Backvorgang. </li><li> Mantel 5 g negativer Photoresist (PR) auf den gereinigten Siliziumwafer durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 50) für 30 Sekunden die Mikrokanalschicht zu erzeugen. </li><li> Legen Sie die PRbeschichteten Wafers auf eine vorgeheizte Heizplatte bei 65 ° C für 12 min und übertragen sie für 33 min bei 95 ° C auf einen anderen vorgewärmte Heizplatte (100 &amp; mgr; m dicken Muster) einen weichen Bake-Verfahren durchzuführen. </li><li> Nach dem Backen, legen Sie die PR beschichteten Silizium-Wafer auf dem Halter eines halbautomatischen Mask Aligner und richten Sie sie auf eine 25.400 dpi Auflösung Transparenz Photomaske. </li><li> Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafers mit UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 500 mJ / cm 2 , um die PR - Muster auf dem Silizium - Wafer zu schaffen. </li><li> Entfernen Sie den Wafer von dem Ausrichter und legen Sie es auf einer Heizplatte für die Zeit nach dem Backen bei 95 ° C für 12 min. </li><li> Weichen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler (Propylenglykolmonomethylether Acetat, PGMEA) -Lösung nicht vernetzten PR für 12 min zu waschen und sanft mit Stickstoffgas trocken die Ausrichtungsmarken zu belichten. </li><li> Wiederum Mantel 5 g negativen Photoresists auf den Wafern durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 700 Umdrehungen pro Minute (SU-8 100) für 30 Sekunden und 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 10) 30 s für 300 &amp;# 181; m dicke Muster und 27 &amp; mgr; m dicken Muster jeweils die Mikrowell-Schicht zu machen. </li><li> Platzieren Sie den PR beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 4 min und bei 95 ° C für 8 min (27 &amp; mgr; m tief capture-well layer); und bei 65 ° C für 40 min und bei 95 ° C für 110 min (bei 300 &amp; mgr; m tief Kultur-well layer). </li><li> Nach dem Abkühlen legen Sie die PR-beschichteten Silizium-Wafer auf dem Mask Aligner mit UV-Licht ausgestattet. </li><li> Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafer mit dem UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 250 mJ / cm 2 (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 700 mJ / cm 2 (300 &amp; mgr; m dicken Muster). </li><li> Backen Sie die Wafer bei 95 ° C für 5 min (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 30 min (300 &amp; mgr; m dicken Muster) sind. </li><li> Waschen Sie die nicht vernetzten PR durch die PGMEA für 6 min (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 25 min (300 &amp; mgr; m dicken Muster) ab, bzw., und dann trocknen Sie sie mit Stickstoffgas. </li><li> Messen Sie die Höhe der Muster-Funktionen aufder Wafer mit einem Scanning-Laser-Profilometer, indem der Wafer auf dem XY-Tisch eines abtastenden Laser-Profilometer platzieren. <ol><li> Stellen Sie die Brennebene deutlich das Muster zeigen, auf dem Wafer verfügt mit dem &quot;Kameraansicht&quot; Beobachtungsmodus unter einem 20X Objektiv. </li><li> Schalten Sie den Beobachtungsmodus von &quot;Kameraansicht&quot; auf &quot;Laser-Ansicht&quot;, und stellen Sie die oberen und unteren Positionen der Merkmale. </li><li> Stellen Sie den Messmodus, Bereich, Qualität und z-Pitch bis transparent (oben), 1 Zeile (1.024 x 1), mit hoher Genauigkeit und 0,5 &amp; mgr; m sind, und drücken Sie dann die Start unten, um die Messung zu beginnen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von PDMS-Geräte für Einzelzell-Isolierung <ol><li> Vor PDMS Gießen, silanisieren die Urformen mit Trichlorsilan eine hydrophobe Oberfläche zu schaffen, die es leichter zu schälen die PDMS Repliken von den Urformen macht. <ol><li> Legen Sie die Urformen und einen Gewichtungs Schiffchen mit200 &amp; mgr; l von Trichlorsilan in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 15 min. </li><li> Stoppen Sie das Vakuum und dann die Stammformen im Exsikkator verlassen für mindestens 1 Stunde die Urformen bei Raumtemperatur silanisieren. </li><li> Entfernen Sie die Urformen aus dem Exsikkator und platzieren Sie jede Master-Form in einer 10 cm Petrischale. </li></ol></li><li> Mischen Sie eine Gesamtmenge von 17,6 g PDMS-Polymer-Kit eine Basis und einen Härter in einem Verhältnis von 10: 1 enthält, und dann gießen Sie die PDMS auf die Urform in der Petrischale. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 1 h Luftblasen in den PDMS zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Petrischale aus dem Exsikkator und legen Sie sie in einem herkömmlichen Ofen bei 65 ° C für 3-6 Stunden die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen des ausgehärteten PDMS Replikate aus den Stammformen und Punch zwei Löcher als Einlass und einen Auslass an den beiden Enden des Mikrokanals auf der capture-Well Array PDMS Replik durch eine Stanze mit einem Innendurchmesser von 0.75 mm für den fluidischen Kanal (2A). </li><li> Verwenden Sie Klebeband um die Oberfläche der PDMS-Repliken zu reinigen, und dann die PDMS-Repliken in einem Plasma-Reiniger für kurze Sauerstoffplasmabehandlung (100 Watt für 14 sec). </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Repliken aus der Sauerstoffplasma-Maschine. </li><li> Richten Sie eine Top (mit den Capture-Mikrotitervertiefungen) und eine untere PDMS (mit den Kultur Mikrotiterstreifen) Replik von Hand unter einem Stereomikroskop und bringt sie in Kontakt. </li><li> Platzieren der ausgerichteten PDMS Replikate in einem Ofen bei 65 ° C für 24 h dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS Repliken zu erreichen, um die endgültige Vorrichtung zu bilden. </li><li> Genießen Sie die PDMS-Gerät in einem deionisierten (DI) -Wasser gefüllten Behälter und stellen Sie den Behälter in einem Exsikkator unter Vakuum (-85 kPa) für 15 Minuten Luft aus dem Mikrokanal des PDMS-Gerät zu entfernen. </li><li> Legen Sie das DI-Wasser gefüllten PDMS-Gerät in einer Gewebekultur Haube und verwenden UV-Licht (Wellenlänge des Lichts: 254 nm) der Vorrichtung zu sterilisieren 30 min. </li><li> Ersetzen den DI-Wasser in der PDMS-Gerät mit einer 5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C-Zellen zu verhindern, auf die Oberfläche PDMS kleben. Hinweis: Die BSA-Beschichtung kritisch ist die Übertragungseffizienz von isolierten Zellen von der Aufnahme-gut zu kultur gut zu verbessern. </li><li> Ersetzen Sie die 5% BSA-Lösung in der PDMS-Gerät mit sterilisiertem 1x PBS-Lösung. </li></ol> 3. Herstellung von Einzelzellsuspension <ol><li> Kultur neurale Stammzelle KT98 und menschliche Karzinomzell A549 und MDA-MB-435 wir in Petrischale in konventionellen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) Zellen für die PDMS Vorrichtungszelle Experiment vorzubereiten . </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die verbrauchte Kulturmedium (DMEM Basismedium versorgt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika) aus der Kulturschale mit Zellen auf 70 gewachsen - 80% Konfluenz. </li><li> Waschen Sie sich leicht die Zellen mit sterilisiertem PBS dreimal. &lt;/ Li&gt; <li> Entfernen und entsorgen Sie die PBS und 2 ml eines rekombinanten Enzymmischung mit proteolytischen, kollagenolytischer und DNase Aktivitäten (bitte die Materialliste für die detaillierte Informationen). </li><li> Inkubieren der Kulturschale bei Raumtemperatur für 5 min und dann auf die Kulturschale Abgriffzelle Ablösung zu erleichtern. </li><li> 4 ml sterilisiertem PBS Zellen zu dispergieren, und dann übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 1 ml sterilisiertem PBS und zählen Sie die Live - Zellzahl 13 den Standard Trypanblau Ausschlussverfahren. Hinweis: Dieser Aufwirbelung Schritt zur Herstellung von gut distanzierte Einzelzellsuspension kritisch ist es, die Einzelzellisolierung Effizienz zu verbessern. </li></ol> 4. Single-Zell-Isolierung und Geklonte Kultur <ol><li> Last 50 ul Zellsuspension in einer Konzentration von 2,2 bis 2,5 x10 <sup&gt; 6 Zellen / ml in den Mikrokanal des PDMS - Gerät über die Austrittsöffnung des Gerätes mit einer Handpipette. Hinweis: Die Zellsuspension Lade Pipette werden muss angehalten und an der ersten Stoppposition gehalten zu vermeiden Luftblasen in den Mikrokanal eingeführt wird. </li><li> Laden Sie weitere 50 ul Zellsuspension durch das Einlassloch gleichmäßig den gesamten Mikrokanal mit Zellen füllen. </li><li> Verschließen Sie die Austrittsöffnung mit einem Stopfen (3 mm lang, 1 mm Durchmesser geschnitten Nylon Angelschnur) um den Fluss zu vermeiden, induziert durch hydrostatischen Druck aus den Tröpfchen auf Eintritts- und Austrittslöcher. Hinweis: Die Stecker UV in einer Gewebekultur Haube sterilisiert waren vor der Verwendung. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml sterile Spritze mit Kulturmedium nach oben, werfen Luftblasen aus es und setzte es auf eine Spritzenpumpe auf. </li><li> Schließen Sie das Medium geladen Spritze mit dem Einlassloch des PDMS-Gerät über einen 23 G stumpfe Nadel und einem Poly-tetrafluorethen (PTFE) Schläuche. </li><li> Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose Loch und alleow eine 2-Minuten Zeitintervall, damit die Zellen in die Single-Cell-Capture-Brunnen durch die Schwerkraft zu regeln. </li><li> Waschen der nicht erfaßten Zellen mit 300 &amp; mgr; l Kulturmedium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 600 ul / min entfernt von der Spritzenpumpe angetrieben. </li><li> Warten für 2 min um das Gerät zu stabilisieren, und Abdichten der Eintritts- und Austrittsöffnungen mit Stopfen einen geschlossenen Kultursystem zu bilden. </li><li> Drehen Sie das Gerät mit der Hand die aufgenommenen Einzelzellen auf die Kultur Mikrotitervertiefungen zu übertragen. </li><li> Legen Sie die PDMS-Gerät in einem 100-mm-Gewebekulturschale, und dann werden 10 ml sterilisiertem PBS um das Gerät Kulturmedium Verdampfen aus dem Mikrokanal zu vermeiden. </li><li> Bewegen der Kulturschale mit einem herkömmlichen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) für klonale Kultur der einzelnen Zellen. </li></ol> 5. Kulturmedium Replenishment <ol><li> Nach 1 d der Kultur, ersetzen Sie das Kulturmedium in der PDMS-Gerät mit frischem Medium Zelle pr zu verbessernoliferation. </li><li> Platzieren zwei Tröpfchen von Kulturmedium auf der Oberseite des PDMS-Gerät in der Nähe der Eintritts- und Austrittsöffnungen Bereiche Einführen von Luftblasen in den Mikrokanal zu vermeiden, während der nächste Schritt durchgeführt wird. </li><li> Stanzen zwei Löcher von der Oberseite der PDMS Vorrichtung in der Nähe der beiden Enden des Mikrokanals als Einlass und einem Auslass für den Mikrokanal. Hinweis: Verwenden Sie nicht durch die ganze zwei Schichten des PDMS Gerät Punch; statt, Punsch nur durch die oberste Schicht des PDMS. </li><li> Schließen Sie eine 1-ml-Plastikspritze mit frischem Medium mit dem Einlass über eine 23 G stumpfe Nadel und PTFE-Schlauch. </li><li> Strom 120 &amp; mgr; l frisches Medium in das Gerät für 5 min das alte Medium zu ersetzen. </li><li> Legen Sie zwei Stecker den Ein- und Austrittslöcher abzudichten, und schicken Sie das Gerät an die Zellkultur-Inkubator. </li><li> Aktualisieren das Kulturmedium alle 2 d während der Dauer der Kultur durch die Verschlussstopfen zu entfernen, gefolgt von den Schritten von 5,4 bis 5,5 zu wiederholen. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikrowell-basierten Gerätesysteme 6,14 wurden für die Einzelzell - Manipulation und Analyse, wie beispielsweise großflächige Einzelzelle verwendet und 6 einzigen hämatopoetischen Stammzellproliferation Trapping 15. Obwohl gut Größe, Anzahl und Form können für spezifische Anwendungen angepasst werden, die Einzelzellisolierung Effizienz wird immer gefährdet , wenn die Größe des Bohrlochs erhöht. 9,15 Um diese Einschränkung zu überwinde...

Derzeit Einzelzellen einzeln in einem Kulturraum platziert wird üblicherweise durch Verwendung limitierende Verdünnung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erzielt. Für viele Laboratorien limitierende Verdünnung ist ein zweckmßiges Verfahren, da es nur eine Pipette und Gewebekulturplatten benötigt, die leicht verfügbar sind. In diesem Fall wird eine Zellsuspension zu einer geeigneten Zelldichte seriell verdünnt und dann in Kulturvertiefungen gegeben durch eine manuelle Pipette. Diese abgeteilten Einzelzellen werden dann für die Zellanalyse verwendet werden, wie genetische Heterogenität Screenen 1 und Koloniebildung 2. Jedoch ist dieses Verfahren mit niedrigem Durchsatz und arbeitsintensiv, ohne einen Roboterarm zur Unterstützung verwendet wird , weil die Poisson - Verteilung der Natur des Verfahrens limitierende Verdünnungseinzelzellereignisse bis zu einer maximalen Wahrscheinlichkeit von 37% 3 einschränkt. FACS-Maschinen mit einem integrierten Roboterarm kann die Begrenzung der Poisson-Verteilung zu überwinden, indem genau placing einer Einzelzelle in einer Kultur auch in einer Zeit 4. Die hohe mechanische Scherspannung jedoch (so senkte die Lebensfähigkeit der Zellen) 5 und Maschinenkauf und Betriebskosten haben seine Verwendung in vielen Labors beschränkt. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, mikroskaligen Geräte wurden entwickelt , um sehr effizient einzelne Zellen in Mikrovertiefungen 6 laden. Jedoch bieten die Mikrotitervertiefungen nicht ausreichend Platz für die beladenen Zellen zu proliferieren, aufgrund der Notwendigkeit der Herstellung der Größe jedes der von einer einzigen Zelle schließen Mikrotiterplatten-Einzelzelllade Wahrscheinlichkeit zu maximieren. Als Kulturassays in vielen zellbasierten Anwendungen erforderlich sind (zB Klonogentest 7), größere Kavitäten (90 bis 650 &amp; mgr; m im Durchmesser oder in Seitenlänge) wurden ebenfalls verwendet worden , für längere Zellkulturen zu ermöglichen. Jedoch, wie das Grenzverdünnungsverfahren, sie besitzen auch eine niedrige einzelne Zelle Ladewirkungsgrade im Bereich von 10 -. 30% 89 Zuvor haben wir ein Hochdurchsatz - mikrofluidischen Plattform zu isolieren Einzelzellen in den einzelnen Kavitäten entwickelt und zeigen ihre Anwendung in klonogenen Assay der isolierten Zellen. Die Vorrichtung 10 mit poly-dimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurde, und weist zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays mit verschiedenen Mikrovertiefungsgrößen, was die Effizienz in dem Laden einer einzelnen Zelle in einer Mikrovertiefung, deren Größe wesentlich größer als die Zelle weitgehend verbessern. Bemerkenswert ist, ermöglicht diese &quot;dual-well&quot; -Konzept die Größe des Kulturbereich flexibel, ohne dass die Einzelzellen-Abscheidungseffizienz zu beeinflussen eingestellt werden, so dass es einfach, die Konstruktion der Vorrichtung zur Einstellung verschiedener Zelltypen und Anwendungen anzupassen. Diese hocheffiziente Methode sollte für die langfristige Zellkulturexperimente für die Zell Heterogenität Studien und monoklonale Zelllinie Einrichtung nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Part No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Silicon wafer&amp;nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Conventional oven</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasma Treatment System</td></tr><tr><td>SU-8 50 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2&quot; ~ 6&quot;</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td></tr><tr><td>Scanning laser profilometer</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Space saver vacuum desiccator 190&amp;nbsp;mm white base</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>with 0.75 mm inner-diameter</td></tr><tr><td>Removable tape</td><td>3M Company</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basal medium</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Recombinant enzyme mixture</td><td>Innovative cell technology</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) cell membrane dye</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Used as a cell tracker</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastic syringe (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge blunt needles</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>inner diameter, 0.51&amp;nbsp;mm; outer diameter, 0.82&amp;nbsp;mm</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for high-throughput single-cell isolation and culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Die mikrofluidische Plattform für Einzelzellisolierung und Kultur umfasst einen Mikrokanal (200 &amp; mgr; m in der Höhe) mit zwei Sätzen von Mikrovertiefungsanordnungen (2A). Die zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays werden als capture-Well (25 um Durchmesser und 27 um Tiefe) und Kultur-Well (285 &amp; mgr; m im Durchmesser und 300 &amp; mgr; m in der Tiefe) bezeichnet für die Einzelzell-Isolierung und Kultur sind und jeweils Capture-gut ist in der Mitte einer Kult...

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A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Aufrufe.  National Health Research Institutes, Taiwan. Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture. 

Serie: A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Forschung

Biotechnik

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient disease since CTCs are rare and heterogeneous. CTCs are detached from the primary tumor, enter the blood circulation system, and potentially grow at distant sites, thus metastasizing the tumor. Since CTCs carry similar information to the primary tumor, CTC isolation and subsequent characterization can be critical in monitoring and diagnosing cancer. The enumeration, affinity modification, and clinical immunofluorescence staining of rare CTCs are powerful methods for CTC isolation because they provide the necessary elements with high sensitivity. Microfluidic chips offer a liquid biopsy method that is free of any pain for the patients. In this work, we present a list of protocols for clinical microfluidic chips, a versatile CTC isolating platform, that incorporate a set of functionalities and services required for CTC separation, analysis, and early diagnosis, thus facilitating biomolecular analysis and cancer treatment. The program includes rare tumor cell counting, clinical patient blood preprocessing, which includes red blood cell lysis, and the isolation and recognition of CTCs in situ on microfluidic chips. The program allows the precise enumeration of tumor cells or CTCs. Additionally, the program includes a tool that incorporates CTC isolation with versatile microfluidic chips and immunofluorescence identification in situ on the chips, followed by biomolecular analysis.

The clinical microfluidic chip is an important biomedical analysis technique that simplifies clinical patient blood sample preprocessing and immunofluorescently stains circulating tumor cells (CTCs) in situ on the chip, allowing the rapid detection and identification of a single CTC.

Klinische Mikrofluidik-Chip-Plattform zur Isolierung vielseitig zirkulierender Tumorzellen

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Automated and High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking Using The Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors are hindered by cumbersome procedures and low throughput, impeding the rapid progress of microbial culturomics research. To address these challenges, we had successfully developed the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell), an automated high-throughput platform that utilizes droplet microfluidic technology for microbial monoclonal isolation, cultivation, and screening. This system can generate a large number of single-cell droplets and cultivate, screen, and collect monoclonal colonies in a short time, facilitating an integrated process from microbial isolation to picking. In this protocol, we demonstrated its application using the isolation and cultivation of human gut microbiota as an example and compared the microbial isolation efficiency, monoclonal culture performance, and screening throughput using the solid-plate culture method. The experimental workflow was simple, and reagent consumption was very low. Compared to solid-plate culture methods, the MISS cell could cultivate a greater diversity of gut microbiota species, offering significant potential and value for microbial culturomics research.

This protocol describes how to use the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) to perform microbial monoclonal isolation, cultivation, and picking. The MISS cell achieves an integrated workflow based on droplet microfluidic technology, which offers excellent droplet monodispersity, high parallel cultivation, and high-throughput biomass detection.

Automatisierte mikrobielle monoklonale Kultivierung und Ernte mit hohem Durchsatz mit dem Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors ...