Wir danken den Studienteilnehmern Miami WIHS für ihre Bereitschaft, an dieser Arbeit teilzunehmen. Die Daten in diesem Manuskript wurden von der Vermittlungs-HIV-Studie Miami gesammelt Frauen (WIHS). Der Inhalt dieser Veröffentlichung sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht die offizielle Position der National Institutes of Health (NIH) darstellen. Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten unterstützt und Vermittlungs-HIV-Infektion Studie Frauen (WIHS) [Gewährungsnummer U01 AI103397], Nationales Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, National Institutes of Health [Grant-Nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences und das Nationale Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten, National Institute of Health [Gewährungsnummer UL1TR000460 und 1KL2TR000461] und National Institute of Child Health und Human Development, National Institute of Health [Gewährungsnummer K23HD074489].

Study Aktivitäten fand an der Universität von Miami HIV Research Unit in Zusammenarbeit mit dem HIV-Vermittlungs-Studie Miami Frauen (WIHS) und dem Miami Zentrum für AIDS-Forschung (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) Genehmigung wurde vor erhalten zur Rekrutierung und jegliche Beurteilung oder Untersuchung im Zusammenhang mit Verfahren. 1. Endozervikale Pinsel Probenentnahme HINWEIS: Die Teilnehmer unterzog sich einer vaginalen Untersuchung durch geschultes MD oder Gynäkologen und Sammlung von intraepitheliale Lymphozyten wurden durchgeführt durch das Einfügen Zytobürste unter Speculum Prüfung durchgeführt. <ol><li> Teilnehmer Merkmale <ol><li> Rekrutieren Frauen Teilnehmer, die 18 bis 45 Jahre alt sind, sexuell aktiv, nicht schwanger und nicht auf Verhütungsmittel Medikamente oder mit einem Intrauterinpessar. </li><li> Vor vaginale Untersuchung unterziehen haben die Teilnehmer 10 ml Blut ziehen in grünTop-Heparin Vacutainer für Pbmc (PBMC) Isolierung. dienen als Kontrolle für endocervical intraepitheliale Analyse 9. </li></ol></li><li> Sammlung der endozervikale Proben <ol><li> Legen Sie eine sterile Speculum von geeigneter Größe in die Vagina ohne Schmierung. Verwenden Sie ein warmes Wasser Einführen des Spekulums zu erleichtern und steriler Gaze den Schleim zu reinigen. Die Position des Speculum ermöglicht eine vollständige Visualisierung des Os und ectocervix. </li><li> Legen Sie endocervical Pinsel in die Endozervikalkanal, bis nur noch die Borsten am nächsten an der Hand sichtbar sind. Drehen Sie die Bürste im Uhrzeigersinn um 360 °. Übertragen Sie die Bürste in einem 15 ml-Röhrchen, die 5 ml IMDM-Medium. </li><li> Unmittelbar nach der Entnahme wird das Reagenzglas Zytobürste auf Eis enthält. Um eine hohe Lebensfähigkeit der gesammelten intraepitheliale Zellen zu erhalten, liefern die Zytobürste ins Labor und Prozess innerhalb von 1 h. </li></ol></li></ol><ol><li> Vortex-Röhrchen mit endocervical Zytobürste Anwendung 4 kurz (10 sec) Schlägen. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen, mit Zytobürste, 10 min bei 250 x g. </li><li> Vorsichtig die Cytobrush aus dem Rohr zu entfernen (nicht das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören) und 1 ml IMDM Medium hinzuzufügen und das Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Legen Sie die Zytobürste auf der 100 mm Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube. </li><li> Waschen Sie die Zytobürste mit 20 ml IMDM. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 250 x g. </li><li> Den Überstand abgießen und pelletierten Zellen resuspendieren in 1 ml IMDM und verbinden sich mit dem bereits wieder suspendierten Pellets in 2.3 beschrieben. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler 10 oder die Zellen zählen Zählkammer durch die Kombination von 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension mit 10 &amp; mgr; l Trypanblaufarbstoff. Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zehnmal um die Zellen zu mischen und färben. Last 10 &amp; mgr; ldes Gemisches in der Öffnung der einen der beiden Kammern Hämozytometer. Zählen Sie alle Zellen in den fünf Rasterflächen. Halten Sie eine separate Zählung der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:% Lebensfähige Zellen = Nicht lebensfähige Zellen x 100 / Gesamtzellzahl Zellen. Bestimmen die nachfolgenden Zellkonzentration pro ml (und die Gesamtzahl der Zellen) unter Verwendung der folgenden Berechnungen. Insgesamt Zellen pro ml = Gesamt Zellen gezählt x (Verdünnungsfaktor / Anzahl der gezählten Quadrat) x 10.000 Zellen / ml. </li><li> Gefriert isoliert endozervikale Zellen mittels Einfrieren-Medium, enthaltend 10% DMSO und 90% FBS. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie <ol><li> Re-suspendieren 1-3 x 10 5 Zellen endocervical in 100 ul FACS - Puffer (PBS , enthaltend 1% Rinderserumalbumin </li><li> 1 &amp; mgr; l / 10 6 , LIVE / DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit und Antikörper für Oberflächenmarker in den in Tabelle 1 beschrieben Konzentrationen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 4 ° C, vor Licht geschützt. </li><li> 1 ml FACS-Puffer und die Zellen und Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 350 xg </li><li> Re-suspendieren Zellpellet in 300 &amp; mgr; l 1% Paraformaldehyd. </li><li> Bereiten Kompensationssteuerungen für die Färbung verwendet, um Perlen und Antikörper durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer und ein Tropfen der Perlen und die gleiche Konzentration der für die Probenfärbung verwendeten Antikörper. </li><li> Erwerben gefärbten Perlen und Proben auf einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit 405 nm, 488 nm und 635 nm Laser. </li></ol> 4. Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen Isolation <ol><li> Magnetic - Bead - Isolation <ol><li> Re-suspend endocervical Zellpellet (≤10 7 insgesamt Zellen) beschrieben in 2,6, in 40 &amp; mgr; l Puffer, die in der TCR gamma delta Mikrobead Kit in der Tabelle der Materialien und Reagenzien verwiesen. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen Kit für zweistufigen Färbeprotokolls: Erstens, Witzh anti-TCR gamma delta Hapten-Antikörper und der zweite, mit anti-Hapten-Mikrobeads-FITC </li><li> Nach einer Inkubation von 15 min bei 4-8 ° C, wasche die Zellen durch Zugabe von 1 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min. Den Überstand umfüllen durch das Rohr Umkehren und tippen Sie trocken mit Hilfe von einem Stück Papier. </li><li> Re-suspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l Puffer zur Verfügung gestellt und bereiten die magnetische Säule, indem sie in geeigneten Magnetscheider Platzierung gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Bewerben Zellsuspension auf die Säule und sammeln unmarkierten Zellen, die durchlaufen und waschen Säule 3x mit entsprechenden Menge an Puffer (500 ul). Führen Waschschritte durch Zugabe von Puffer dreimal, jedes Mal, wenn die Spalte Behälter leer ist. Sammeln gesamten Ausflusses. Dies ist die unmarkierten, negativen Zellfraktion </li><li> Entfernen Sie die Säule bilden die Magnetscheider und Pipette 1 ml Puffer auf die Säule und sofort spülen Fraktion mit dem magnetisch-Labeled-Zellen, indem Sie den Kolben mit der Säule geliefert Anwendung. HINWEIS: Isolierte gamma delta T-Zellen sind bereits für durchflusszytometrische Analyse fluoreszenz gefärbt, da magnetisch markierten Anti-Hapten-Mikrokügelchen mit Fluoreszenzfarbstoff FITC konjugiert sind. </li></ol></li><li> Zellsortierung <ol><li> Für Zellsortierung, Etikett Endozervikalzellen mit Lebensfähigkeit sterben und Antikörper-Panel, wie in Kapitel 3 beschrieben. </li><li> Richten Sie elektronische Tore auf dem Live - CD45 + CD3 + und Gamma - Delta - positive Zellen und Zellsortierung durchführen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genital+tract+immune+milieu:+an+important+determinant+of+HIV+susceptibility+and+secondary+transmission.">The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission.</a> J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).</li><li>Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+early+infection+to+prevent+HIV-1+mucosal+transmission.">Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.</a> Nature. 464, 217-223 (2010).</li><li>Hayday, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma][delta]+cells:+a+right+time+and+a+right+place+for+a+conserved+third+way+of+protection.">gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection.</a> Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).</li><li>Autran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+gamma/delta++lymphocyte+subsets+during+HIV+infection.">T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection.</a> Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).</li><li>Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+Cells+in+HIV+Disease:+Past,+Present,+and+Future.">gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future.</a> Front Immunol. 5, 687 (2014).</li><li>Hayday, A. C., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+immunity.">Barrier immunity.</a> Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).</li><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes.">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).</li><li>Strbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Intra-Epithelial+Endocervical+Gamma+Delta+(GD)+1+T+Cells+in+HIV-Infected+Women.">Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women.</a> AJRI. 75, 134-145 (2016).</li><li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+measurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).</li><li>Alcaide, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Vaginosis+Is+Associated+with+Loss+of+Gamma+Delta+T+Cells+in+the+Female+Reproductive+Tract+in+Women+in+the+Miami+Women+Interagency+HIV+Study+(WIHS):+A+Cross+Sectional+Study.">Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study.</a> PloS one. 11, e0153045 (2016).</li><li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+genital+tract+cytokine+signatures+of+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+in+women+at+high+risk+of+HIV+infection:+a+cross-sectional+study.">Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study.</a> Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)-1,+IL-6,+and+IL-8+predict+mucosal+toxicity+of+vaginal+microbicidal+contraceptives.">Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives.</a> Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> JoVE. , (2014).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials:+an+international+multi-site+study.">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675 (2014).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li></ol>

Autoren haben keine gewerblichen oder anderen Verein, der einen Interessenkonflikt (zB Pharma Aktienbesitz, Beratung, Beirat Mitgliedschaft, relevante Patente oder Forschungsförderung) darstellen könnten.

Bewertung der weiblichen Genitaltrakts unteren Anfälligkeit Schleimhaut ist ein wesentlicher Bestandteil von klinischen Studien Risiko einer HIV-Erfassung und Übertragung Adressierung. Typischerweise wird FGT Anfälligkeit für eine HIV - Infektion durch Messung löslichen Immunmodulatoren in Genitalsekreten (Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide) bewertet 12, 13. Allerdings sind diese Biomarker nur indikativ für vaginale Entzündung, werden von physiologischen und pathologischen Ereignisse beeinflusst, und nicht immer direkte Schädigung der Schleimhaut darstellen. Um unser Verständnis, wie Schleimhaut Faktoren erhöhen das Risiko für die Erfassung und Übertragung von HIV, zellulären Marker der Schädigung der Schleimhaut zu verbessern müssen entwickelt werden. GD intraepitheliale T-Zellen sind in der FGT, intercalate zwischen Epithelzellen und sind gedacht, um beitragen sowie zu einer ersten Verteidigungslinie gegen Umweltprobleme zur Homöostase. GD-T-Zellen haben die poten<html> TiAl eine zusätzliche Biomarker zu bilden Schleimhaut Verwundbarkeit im FGT zu beurteilen. In diesem Protokoll wird gezeigt, wie intraepitheliale Lymphozyten aus humanem endocervical Cytobrush Probe herzustellen und leicht zu beherrschen. Der kritischste Punkt dieses Verfahrens ist, die Lebensfähigkeit der Zellen durch eine schnelle Verarbeitung der Probe sowie indem die Zellen auf Eis während des gesamten Verfahrens aufrecht zu erhalten. Die Zellausbeute wird auf Zytobürste Sammeltechnik abhängen, Handhabung Geschick sowie den Infektionsstatus (HIV-Infektion oder anderen viralen Infektionen, bakterielle oder Pilzinfektionen). Unsere Gruppe und andere haben verschiedene Studien beschreiben verschiedene Lymphozyten - Populationen im menschlichen Genitaltrakt 9, 14, 15 veröffentlicht. In unseren Händen, kann man endocervical Zytobürste Probe liefern 0,5-5 x 10 6 Zellen mit 80-90% Lebensfähigkeit. Im Vergleich mit der üblicherweise verwendeten Isolationsverfahrenclass = &quot;xref&quot;&gt; 14, 15, durch unser Verfahren wird die Lebensfähigkeit und Zellausbeute erhöht. Dieses Verfahren stellt ein leistungsfähiges und ein effizientes Werkzeug endocervical intraepitheliale gamma delta T-Lymphozyten zu studieren und Einblick in andere Immunzellen liefern könnte, die zu diesem Fach während einer Infektion und / oder Entzündung wandern. Die in vivo zellulären Zusammensetzung von Schleimhautgewebe ist häufig schwierig , eine umfassende und quantitative Art und Weise zu untersuchen. Techniken wie die Immunhistochemie und Durchflusszytometrie werden durch die Verfügbarkeit von Antigen-spezifischen monoclonalen Antikörpern und durch die geringe Anzahl von parallelen Messungen begrenzt, der auf jeder einzelnen Zelle durchgeführt werden kann. Traditionelle Assays mit hohem Durchsatz, wie Gen-Expressionsarrays, wenn auf ganze Gewebe durchgeführt werden, liefern Informationen über durchschnittliche Genexpression Ebene und kann nur indirekt auf quantitative Veränderungen in der zellulären Subpopulationen korreliert werden.Diese Beschränkungen werden besonders schwer zu überwinden, wenn Minderheiten zu studieren, oder die Zellpopulation, die exklusive Marker fehlen. Durch die Kombination von &quot;fluorescence activated cell sorting&quot; (FACS) und &quot;single-cell-PCR-Gen-expression analysis&quot; kann man ein Hochdurchsatz-Analyse der Transkriptions intraepitheliale GD T-Zellen in Endocervix zuführen. Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit der modernen Durchflusszytometer einzelnen Einzelzellen sortiert werden mit Genauigkeit und Präzision, zusammen mit der Verwendung von mikrofluidischen Technologien hoher Empfindlichkeit gemultiplexten PCR aus winzigen Mengen von mRNA vorzuformen, um dadurch parallele Analyse der Expression von bis zu 96 Gene ermöglichen für jede einzelne Zelle 16.

Wir entwickelten Methodik der Verwendung von endozervikalen Bürstenproben intraepitheliale GD-T-Zellen zu bewerten. Der Endozervikalkanal wird durch eine einzige Schicht von Epithel ausgekleidet. Intraepitheliale Lymphozyten repräsentieren Front - Lymphozyten in der Epithelschicht Wohnsitz, die sich schnell Immunreaktionen auslösen können pathogene Mikroben 7 nach der Begegnung, 8. die immunologischen Ereignisse des endozervikalen intraepitheliale Kompartiment zu verstehen, ist für das Design von wirksamen Strategien wichtig zur Verhinderung von Infektionen, einschließlich HIV. Unser Verfahren kann für frisch gesammeltem humanen endozervikalen Proben sowie gefrorene endozervikalen Zellen angewendet werden, um die Rolle von intraepithelialen GD T-Zellen bei Frauen mit HIV-Infektion erforschen oder einem Risiko für eine HIV-Infektion. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, neue immunologische Ereignisse in endocervical intraepitheliale Raum zu entdecken und zu evaluate GD T-Zell-Antworten als Marker mit einer HIV-Infektion bei Frauen Anfälligkeit der Schleimhaut. Die erheblichen Lücken im Wissen um FGT Immunität sind teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der erfolgreichen Erfassung und Verarbeitung Schleimhautproben. Darüber hinaus ist die komplexe Heterogenität der Schleimhautimmunzellen und deren Vernetzung untereinander, sind große Herausforderungen zu klinisch relevanten Messungen zu identifizieren, die den Zustand und die Fähigkeit des Immunsystems widerspiegeln. Wir entwickelten eine Methode, hochgereinigtes intraepitheliale GD-T-Zellen zu erhalten, die weiter analysiert werden können hoch Multiplex, Single-Cell-Technologien, die für die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen von FRT Immunität von entscheidender Bedeutung sein kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytobrush Plus GT&#160;</td>
			<td style="width:147px;">(CareFusion, San Diego, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">IMDM,Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">496178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS, Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen, Gibco</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen, Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies,</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fortessa flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:147px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:119px;">130-050-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS column</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;">103-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS separator</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">4124</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of human endocervical gamma delta t cells

Die weiblichen Fortpflanzungstrakt (FRT) Schleimhaut-Immunsystem dient als erste Verteidigungslinie. Bessere Kenntnis der Genitalschleimhaut ist daher wesentlich für das Verständnis der Pathogenität von verschiedenen Krankheitserregern wie HIV. Gamma delta (GD) T-Zellen sind der Prototyp &quot;unkonventionelle&quot; T-Zellen und eine relativ kleine Teilmenge von T-Zellen durch ihre Expression von heterodimeren T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die aus gamma und delta-Ketten definiert darstellen. Das unterscheidet sie von den klassischen und viel besser CD4 + T - Helferzellen und CD8 + zytotoxischen T - Zellen bekannt , die durch Alpha-Beta - TZR definiert sind. GD-T-Zellen zeigen häufig gewebespezifische Lokalisation und in Epithel angereichert. GD T-Zellen dirigieren Immunreaktionen bei der Entzündung, Tumorüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen. Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbar zu isolieren und die menschliche endocervical intraepitheliale GD T-Lymphozyten zu analysieren. Wir have verwendet endocervical Zytobürste Proben von Frauen in der Frauen-Vermittlungs-HIV-Infektion Study (WIHS) teilnehmen. Das Wissen über GD-T-Zellen-Wechselwirkungen bei Bedingungen, in denen es eine Beleidigung für die vaginale Schleimhaut ist, könnte zu einer klinischen Studie angewendet werden, bei denen der Schleimhaut Anfälligkeit gerichtet ist, einschließlich der Entwicklung von vaginalen microbicides.In hinaus sind Kenntnisse über Schleimhaut GD T-Zell-Reaktionen hat Potenzial für die Anwendung der GD T-Zell-basierte Immuntherapie bei der Behandlung von Infektionskrankheiten.

Vor kurzem haben wir analysiert , endocervical intraepitheliale GD - T - Zellen , und wir waren die ersten, über den Verlust von endocervical Gamma - Delta - T - Zellen in HIV - infizierten Frauen 9, 11 zu melden. Hier beschreiben wir das Protokoll zu isolieren und die Teilmenge von endozervikalen gamma delta T-Zellen zu analysieren. Wie in Figur gezeigt ist, kann 1, GD T - Zellen leicht in die menschlichen endozervikalen Zellproben nachgewiesen werden. Eine einzigartige Population von endocervical Gamma - Delta V1 (GD1) T - Zellen wurde beschrieben multiparametar Zytometrie-basierte Immunophänotypisierung fließen (Abbildung 1). Eine repräsentative Gating - Strategie für HIV uninfizierten endocervical Probe wird in Abbildung 1 dargestellt. Die Analyse wurde durch Einstellen des elektronischen Tor , gefolgt von t auf Forward / Side Scatter (Abbildung 1A) auf die gesamten Endozervikalzellen ausgeführter Ausschluss von Zell Dubletten (1B). Lebensfähige Zellen wurden durch Ausschluss von toten Zellen definiert unter Verwendung von Live / Dead Fixable Yellow Amine Dead Cell Stain (Abbildung 1C). Analyse der CD45 - Expression wurde auf Live - gated - Zellen (1D), durch die Analyse der CD3 - Expression (Figur 1E) gefolgt ausgeführt. Gamma - Delta 1 (GD1) oder Gamma - Delta - 2 (GD2) positive Zellen wurden als Subpopulation von CD3 + Zellen definiert , die GD TCR (TCR Gamma - Delta V1 oder TCR Gamma - Delta V2) zum Ausdruck bringen. Darüber hinaus wurde bestätigt , dass nur CD3 + T - Zellen , da gated CD3 TCR gamma delta express - T - Zellen nicht TCR gamma delta V1 oder V2 delta exprimieren. Die phänotypische Analyse von gated CD3 + GD1 + Zellen zeigte (1G), dass die Mehrheit der GD1 Zellen (~ 74%) sind CD4 - CD8 -. In der vorliegenden Studie, die Durchführbarkeit der Verwendung von endocervical Bürsten Proben gereinigter intraepitheliale GD T - Zellen durch positive magnetische Selektion wurde nachgewiesen (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55038/55038fig1.jpg" /> Abbildung 1: Gamma delta (GD) T - Zell - Subpopulation in Gebärmutterhalsschleimhaut durch Durchflusszytometrie analysiert. Nach Gating - Strategie wurde identifiziert endocervical T - Zell - Populationen verwendet: (A) endocervical Zytobürste Zellen wurden gated nach der Größe und Granularität (FSC, vorwärts Seitenstreuung vs SSC, Seitenstreuung). (B) Cell Dubletten , indem die elektronischen Tore in der FSC-A ausgeschlossen wurden (Bereich) vs SSC-W (Breite). (C) Lebende Zellen sind auf die Lebensfähigkeit Farbstoff-negativen Population gated. (D) wurde elektronisches Tor gesetzt auf Live, CD45 - positive Zellen. (E) Elektronische Tor für positive Zellen CD45 wurde auf CD3 - positiven Zellen eingestellt(F) TCRVD1 (GD1) und TCRVD2 (GD2) Expression wurde auf CD3 + Zellen analysiert. (G) CD4 und CD8 - Expression wurde auf GD1 + -Zellen analysiert. (H) TCRVD1 und TCRVD2 Expression wurde auf gated CD3 - negativen Zellen analysiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55038/55038fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55038/55038fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55038/55038fig2.jpg" /> Abbildung 2: Isolierung von endocervical Gamma - Delta - T - Zellen (GD) durch positive magnetische Trennung. Die Häufigkeit der endocervical GD T-Zellen wurde vor und nach der positiven magnetischen Trennung bestätigt. Endozervikale Zellen wurden zunächst mit Anti-TCR Gamma - Delta - Antikörper und dann mit fluoreszenz gefärbt mit Anti-Hapten Microbeads-FITC markiert. Prozent der TCR GD + T-Zellen wurde vor und nach m berichtetagnetic Trennung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55038/55038fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55038/55038fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical-gamma-delta-t

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K Aufrufe.  Miller School of Medicine, University of Miami. We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Serie: Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...