Diese Methode ermöglicht ein schnelles In-vivo-Screening bei Mäusen, der Wirkung eines Transgens, und ist speziell für die Durchführung von Funktionsbeobachtungen sowie einer Antwort- und DNA-Motivkartierung geeignet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Vorhersageverwendung von transgenen Tieren über 70 % der Neugeborenen liegt und auf alle Mausstämme, einschließlich transgener Tiere, angewendet werden kann. Nach der Einschläferne der Mäuse, sammeln Sie die Eileiter.
Um die Operation zu beginnen, verwenden Sie eine Schere, um einen großen horizontalen Schnitt in die Bauchhöhle zu machen. Suchen Sie dann das Eileiterzwischenband zwischen der Gebärmutter und dem Eierstock. Als nächstes verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das Mesometrium und die Membran mit den prominenten Blutgefäßen zu entfernen.
Trennen Sie dann das Eileitervom Eierstock und sezieren Sie das Eileitervom Eierstock. Dann ziehen Sie auf dem Eileiter und schneiden Sie von der Gebärmutter. Übertragen Sie alle gesammelten Eileiter bei Raumtemperatur auf M2-Medium.
Achten Sie beim Umgang mit den Eileitern darauf, die geschwollene Ampulla, die mit befruchteten Eiern beladen ist, nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen Hyaluronidase-Arbeitslösung zu einer 10-Zentimeter-Schale hinzu. Dann die beiden Eileiter hineinübertragen, um die Cumuluszellen aus den Eiern zu entfernen.
Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop ein Paar Insulinspritzen, um das Eileiterzuführen zu sichern, während Sie die Ampulla aufreißen und die befruchteten Eier dispergieren. Verwenden Sie dann eine vorbereitete Glaspipette mit Schläuchen und ein Mundstück, um alle Eier zu aspirieren. Mit diesem Werkzeug, übertragen Sie sie zwischen sechs Tropfen M2 Medium, um die umgebenden Cumuluszellen abzuwaschen.
Dann die gewaschenen Eier in einen 10 Millimeter Brunnen geben, in einer vier Brunnenplatte, gefüllt mit vorgeheizt mit M16. Dann übertragen Sie die Schale in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. In Vorbereitung zentrifugieren Sie die vorbereitete lentivirale Vektorsuspension bei 160 g für zwei Minuten, um die oft in lentiviralen Vorräten vorhandenen Trümmer zu pellet.
In einem Sicherheitsschrank der Klasse 2, übertragen Sie die Überräube auf ein neues 0,5 Milliliter Rohr. Als nächstes einen Mikroliter Überstand in eine Injektionspipette laden. Befestigen Sie dann die Injektionspipette an der rechten Seite Mikromanipulator.
Und befestigen Sie die Haltepipette am linken Mikromanipulator. Geben Sie nun acht Mikroliter M2-Medium in der Mitte der Depressionsrutsche ab. Und mit leichtem Parafinöl abdecken, um Verdunstung zu vermeiden.
Dann legen Sie 20 Eier in die flachen Stellen in den Tropfen, ohne Blasen zu erzeugen. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Spitze der Injektionspipette geöffnet ist. Wenn nicht, tippen Sie auf die Injektionspipette mit der Haltepipette, um sie zu öffnen.
Stellen Sie dann den Mikroinjektor für 20 Sekunden Injektionen ein. Nun, mit der Haltepipette und manuellen Druck aspirieren sie ein befruchtetes Ei, das zwei Vorkerne und zwei polare Körper enthält. Dann, mit der InjektionPipette injizieren Sie die Perivitelline Raum des Eis.
Berühren Sie die Plasmamembran nicht. Stellen Sie den Druck so ein, dass der Perivitelline-Raum mit Lösung gefüllt ist. Der Druck sollte 600 Hekto-Pascal nicht überschreiten.
Unmittelbar nach der Injektion der 20 Eier, übertragen Sie die Charge in ein Bad von vorgewärmten M16 Medium. Und brüten Sie sie für mindestens 30 Minuten, bevor Sie sie implantieren. 16 Stunden nach der Paarung normaler Weibchen mit Männchen mit Vasektomien, überprüfen Sie auf KopulationSstecker.
Verwenden Sie diese Weibchen für die Implantation. Als nächstes machen Implantationspipetten mit einem Innendurchmesser von ca. 150 Mikrometern. Und mit flammenpolierten Spitzen, die etwa vier bis fünf Millimeter lang sind.
Laden Sie eine Pipette mit embryogeprüftem, leichtem Parafinöl bis knapp über dem Schulterpunkt. Dann eine kleine Luftblase ansaugen und die Pipette weiter mit M2-Medium beladen. Als nächstes, aspirieren Sie eine zweite Luftblase.
Nun, ziehen Sie die Embryonen in die Pipette hintereinander, minimieren Sie das Volumen des Mediums zwischen den Embryonen. Beenden Sie, indem Sie einen sehr kleinen Tropfen Parafinöl nur einen Embryo breit ansatogen. Die Vorbereitung der Reimplantationspipette ist der Schlüssel und erfordert viel Übung.
Die Eier in der Pipette müssen praktisch mit keinem Medium dazwischen ausgerichtet werden. Als nächstes, nach der Anästhesisierung der Maus und Bestätigung der Anästhesie mit einer Zehenprise Shave aus zwei, zwei Zentimeter Streifen Haar entlang des Rückenmarks auf der Ebene der letzten Rippe. Legen Sie nun die Maus auf ein Heizkissen auf ein steriles Feld und drapieren Sie sie, so dass ein Fenster der freiliegenden Haut bleibt.
Als nächstes, desinitieren Sie die exponierte Haut mit abwechselnden Peelings von Iodoprovidon und 70 Prozent Ethanol. Für die Implantation zuerst einen einen Zentimeter Querschnitt machen und dann die Haut seitlich schieben, bis der orangefarbene Eierstock durch die Körperwand sichtbar ist. Als nächstes einen Fünf-Millimeter-Schnitt mit der feinen Schere machen und das Fettpolster mit einer atraumatischen Bulldoggeklemme aufnehmen.
Sobald das Pad gegriffen ist, ziehen Sie den Eierstock, das Eileiter und die Oberseite der Gebärmutter heraus. Als nächstes, suchen Sie die Ampulla und machen eine Halbsektion mit Vannas Schere, auf dem Eileitersegment, das den Eierstock mit der Ampulla verbindet. Dann führen Sie die Transfer-Embryo-Pipette ein und werfen Sie die Eier aus.
Anhalten an der ersten Luftblase, nachdem die Eier freigegeben wurden. Lassen Sie die erforderlichen Materialien vorbereiten, um das Verfahren auf dem zweiten Eileiter zu wiederholen. Und sobald fertig, schließen Sie die Haut mit Wundclips.
Unmittelbar nach dem Schließen der Haut injizieren Intraperitonealy Schmerzmittel und legen das Tier in die Rückgewinnungskammer mit einem 39 Grad Celsius Heizelement. Überwachen Sie, bis es vollständig wach ist. Transgene Tiere wurden mit der vorgestellten Methode erzeugt.
Ein High Titer lentiviralVektorn wurden mit einem 2,3 Kilo Basisenhancer für Neurogenin-3 produziert, um eGFP zu fahren. Oder als Kontrolle, ein Fragment des Chromosoms sechs, um eGFP zu fahren. Die Integration in Embryonen war recht erfolgreich.
Von den Embryonen wurde die Bauchspeicheldrüse geschnitten und immungefärbt, um nach einer lokalisierten Expression von eGFP zu suchen. Über 90 Prozent der Vektoren, mit dem Neurogenin-3 Enhancer, ausgedrückt eGFP in Neurog3 exprimierenden Zellen. Keiner der integrierten Kontrollvektoren drückte jedoch eGFP in der Bauchspeicheldrüse aus.
Transgene Integrationsstandorte wurden mittels quantitativer PCR unter Verwendung des CDX2-Gens als Kontrolle bewertet. Die durchschnittliche Anzahl der Integrationsstandorte betrug etwa 20, indem das Neurogenin-3-Konstrukt verwendet wurde, oder 10 mit dem Steuerelementkonstrukt. Seltsamerweise war der virale Transduktionstiter, der für das Neurogenin-3-Konstrukt verwendet wurde, etwa das Doppelte des Kontrollvektors.
Schlagen einer Beziehung zwischen dem Transduktionstiter und der Anzahl der Integrationen vor. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine große Anzahl von begründerischen transgenen Embryonen mit Perivitelline-Injektion von lentiviralen Vektoren mit hoher Wirksamkeit erzeugen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik bis zu 50 Gründertiere innerhalb eines einzigen Tages der Mikroinjektion produzieren, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie titer pronukleare DNA-Injektion durchgeführt werden, um transgene Mauslinien zu etablieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lentiviralen Vektoren der Genehmigung Ihres lokalen GVO-Ausschusses unterliegt. Diese Vektoren können extrem gefährlich sein und Vorsichtsmaßnahmen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
