This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche, herausgegeben von der Bundesrepublik Deutschland durchgeführt. Hinweis: Da das Netzhautgewebe während längerer Teile dieses Verfahren frei von Sauerstoff sein, alle Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden soll. Mäuse sollte mindestens 3 Stunden vor der Dissektion dunkel angepasst werden. Um Licht Anpassung der Netzhaut, die Vorbereitung zu vermeiden und Schneiden sollte unter dim rotes Licht durchgeführt werden. 1. Herstellung von Druckmedien und anderen Chemikalien <ol><li> Bereiten Sie Ames &#39;Medium 6. Netzhautgewebe in Ames &#39;Medium zu jeder Zeit nach der Sektion, einzutauchen. <ol><li> Man löst 2,2 g Ames &#39;Medium und 298 mg HEPES in 250 ml destilliertem Wasser. Die Konzentration von HEPES wird 5 mm betragen. Vorsichtig umrühren, bis alle Partikel gelöst sind. </li><li> Blase Ames &#39;Medium bei Raumtemperatur mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% AutoKohlendioxid) für mindestens 5 min. Versorgungs Carbogen mit einer Glaspasteurpipette zu der Lösung. Schließen Sie das Pasteur-Pipette über entsprechende Schlauch an den Ausgang des Gasregler. </li><li> Hinzufügen, 475 mg Natrium-Bicarbonat zur Lösung. Die Zugabe von Bikarbonat nach Sprudeln verhindert die Ausfällung von Calciumcarbonat. </li></ol></li><li> Bereiten Sie niedrige Geliertemperatur Agarose. Agarose ist erforderlich für die während Vibratom Schnitte von Netzhautgewebe eingebettet ist . <ol><li> Man löst 180 mg Agarose in 9 ml Ames &#39;Medium und 1 ml destilliertem Wasser. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um langsam die Agarose-Lösung erhitzen, bis sich alle Feststoffe gelöst sind. Hitze in 5-10 sec-Schritten Überlauf zu vermeiden. Lösung sollte klar und transparent sein. </li><li> Aufbewahren bei 37 ° C Agarose in einem Wasserbad für die Dauer des Verfahrens gelöst. </li></ol></li></ol> 2. Einrichten des Vibratom HINWEIS: Alle Schnitte wurde mit der durchgeführtVibratom in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt. Die angegebenen Einstellungen beziehen sich auf diese Art von Vibratom nur. Weitere Einzelheiten zu Vibratom Schnitte von Nervengewebe entnehmen Sie bitte 7 zu verweisen. <ol><li> Setzen Sie Vibratom Injektor Klinge in Klingenhalter. </li><li> Messen Sie vertikale Auslenkung der Klinge mit der &quot;VibroCheck&quot; Gerät. Verwenden, um die Einstellschraube an dem Klingenhalter die Klinge zu kippen, bis es auf der Schnittebene parallel ist. Die genaue Positionierung der Klinge notwendig Jalousieeffekte auf der Schnittfläche zu verhindern und um einen flachen Abschnitt zu erzeugen, die von lebenden Zellen auf seiner Oberfläche enthält. </li><li> Stellen Sie Vibratom auf die folgenden Einstellungen: Amplitude, 1,00; Geschwindigkeit, 0,20; Dicke, 180-200 &amp; mgr; m. </li></ol> 3. Dissektion der Maus Retina <ol><li> adult C57BL / 6-Maus durch Verdampfung von etwa 1 ml Isofluran in einem luftdichten Behälter anästhesieren. Wenn Anästhesie abgeschlossen ist, einschläfern Tier durch Genickbruch. DasMaus sollte nicht älter als 3 Monate sein, da sonst die Qualität der Scheiben verschlechtern wird. </li><li> Entfernen Augapfels durch eine gekrümmte Pinzette unter dem Auge platziert. Ziehen Sie das Auge Ball anheben wird den Sehnerv aus. Schneiden Sie den Sehnerv mit einer Feder Schere und übertragen die Augapfels auf eine 35-mm-Petrischale mit 2 ml Ames &#39;Medium. </li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf der Bühne eines Stereomikroskops. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen Wert, der eine optimale visuelle Kontrolle der folgenden Verfahren erlaubt (Schritte 3,4-3,9). </li><li> Durchstechen der Hornhaut am Übergang zu der Sklera mit spitzen Pinzette oder einer 20 G-Nadel. Während dieses Schrittes stabilisieren das Auge Ball mit einer anderen Zange. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut mit dem Stechgerät zu beschädigen. </li><li> Setzen Sie die Feder Schere in das kleine Loch gemacht in Schritt 3.3 und schneiden Sie die Hornhaut einen Kreis um. Auch hier fest mit einer Pinzette die Augapfels während des Schneidens. Halten Sie den Schnitt sehr nahe an der Oberfläche, um nicht zu cut in der Netzhaut. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Hornhaut, Linse und Glaskörper mit einer Pinzette. Der Glaskörper umfasst nur eine dünne transparente Schicht auf der Rückseite des Auges. Jedoch ist es für Vibratom sectioning dass der Glaskörper vollständig entfernt wird. </li><li> In der Petrischale, positionieren Sie die Augenmuschel in einer Weise, dass man durch das Loch nach unten schaut auf die Netzhaut. Der Rand der Öffnung sollte nur von Skleragewebe bestehen. Wenn die Kreisschnitt (Schritt 3.4) wurde zu nahe des Okulars zum Äquator durchgeführt wird, wird Netzhautgewebe auch vorhanden Nähe der Einschnitt sein. Seien Sie vorsichtig, dann nicht auf die Netzhaut zu beschädigen in Schritt 3.8. </li><li> Besorgen Sie sich die Lederhaut mit einer Pinzette vorsichtig in das Gewebe auseinander reißen. Es ist wichtig, nicht die Netzhaut während dieses Schritts zu bersten. Falls erforderlich, entfernen Sie die Netzhaut von der Ora serrata durch den skleralen Teil des Gewebes mit der Zange Verstetigung und sorgfältig auf die Netzhaut mit den anderen Zangen Abziehen. Halten Sie die Zange geschlossen; nie die Wieder Grifftina mit einer Pinzette, da das Gewebe ist sehr weich und wird sofort Platz geben. HINWEIS: Bei diesem Schritt wird die Netzhaut und der Rest des Okulars wird erst am Sehnervenkopf angeschlossen werden. </li><li> Schneiden Sie die Befestigungsstelle am Sehnervenkopf mit den Feder Schere. Die Netzhaut sollte nun frei als ein einziges Stück Gewebe Medium &#39;in Ames zu schweben. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut in 4 - 6 kleine Rechtecke von ca. 23 mm mit einer gekrümmten Skalpellklinge mit von der Netzhaut mit der Zange an den Rändern halten, sie in die richtige Position zu manipulieren. Vermeiden Sie das Netzhautgewebe innerhalb der Rechtecke Kneifen. Nehmen Sie Stücke aus den zentralen Teilen der Netzhaut, nicht weit Peripherie. </li><li> Übertragen retinalen Stücke mit einem großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette zu einer 35 mm Kunststoff-Petrischale, deren Boden wurde durch ein Gitter mit Gittergröße von weniger als 1 mm ersetzt. Befestigen Sie die Petrischale im oberen Drittel eines Bechers oder Erlenmeyerkolben und versenken retinalen Stücke in Ames &#39;Medium bubbled mit Carbogen. </li></ol> 4. Einbettung von Retinal Stück in Agarose <ol><li> Sorgfältig übertragen 2 - 3 Retina-Stücke in eine 35 mm Kunststoff-Petrischale zusammen mit einigen der Ames &#39;Medium. Es ist sehr bequem, einen großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette für die Übertragung zu verwenden. In diesem Schritt wichtig die genaue Ausrichtung der retinalen Stücke nicht. </li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich von der restlichen Ames &#39;Medium mit einem Glas Pasteur Pipette. Sobald die Flüssigkeit entfernt wurde, mit dem Schritt 4.3 fort. Sie nicht das Netzhautgewebe trocknen lassen. </li><li> Unmittelbar bedecken retinalen Stücke mit 2 ml Agarose gelöst (37 ° C). Einsatz der genannten Größe in Schritt 3.10, werden die Stücke nicht in der Agarose einrollen. </li><li> Innerhalb der flüssigen Agarose, drücken Sie vorsichtig retinalen Stücke auf den Boden der Petrischale. Die Ganglienzellschicht sollte nach unten zeigen . Verwenden Sie ein Stereomikroskop zur Beurteilung der exakten Position. Zur Positionierung Griff retinalen piECES mit einem kleinen Spachtel. Positionieren Sie die Netzhaut so schnell und präzise wie möglich, da die Agarose schnell verfestigt. <ol><li> Vereinbaren retinalen Stücke auf den Boden der Glasschale parallel; sonst werden Abschnitte tangential oder schräg sein. Einzelne Stücke sollten einander nicht berühren, aber auch nicht zu weit auseinander liegen. Versuchen Sie, retinale Stück mehr oder weniger auf der gleichen horizontalen Ebene platzieren. </li></ol></li><li> Setzen Petrischale aus Glas mit eingebetteter retinalen Stücke in den Kühlschrank (4-6 ° C) für mindestens 2 min. Dies wird schnell die Agarose zur weiteren Bearbeitung aushärten. Sobald die Agarose wurde mit dem nächsten Schritt fortzufahren polymerisiert. </li></ol> 5. Montage von Retinal Pieces <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die Agaroseblock retinalen Stücke aus der Petrischale enthält. Verwenden Sie einen Spatel oder eine ähnliche Vorrichtung, die Agarose-Block aus dem Glas zu heben. Durch Adhäsionskräfte, kann dies sehr schwierig erweisen. Vermeiden Sie jedoch das BrechenAgaroseblock. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die Agarose-Block auf einem Deckglas und passen Sie seine Größe mit einem Skalpell. Lassen 1 bis 2 mm aus Agarose auf jeder Seite der Netzhautstücken. Die endgültige Größe des Blocks sollte um 1,066 mm (10 mm bezieht sich auf die Höhe des Blocks, 6 mm auf seine Kantenlänge). </li><li> Kleben die Agarose-Block an den Probenhalter des Vibratom eine Sofortkleber. Retinal Stücke sollten im oberen Bereich der 10 mm hohen Block und parallel zu dessen Oberfläche angeordnet sein, während der Boden an der Halterung befestigt ist. </li><li> Decken Sie den Block unmittelbar durch die zuvor sprudelte Ames &#39;Medium in die Pufferwanne des Vibratom Gießen. </li></ol> 6. Herstellung von Horizontal Vibratom Abschnitte <ol><li> Starten Sie sectioning. Zuerst stellen Sie die Dicke des Schneidens manuell bis Fragmente von Netzhautgewebe in der Scheibe erscheinen. Ändern Sie dann auf die Einstellungen in Schritt 2.3. Seit derMaus Netzhaut ist nur etwa 200 &amp; mgr; m dick ist, wird es nicht mehr sein als 2 - 3 Scheiben pro Agaroseblock. </li><li> Entfernen Sie Abschnitte aus dem Pufferwanne mit einem Glasstab und sie auf 2 ml Ames &#39;Medium in einer 35 mm Petrischale. </li><li> Speicherabschnitte unmittelbar in einem Brutschrank bei 37 ° C (5% CO 2/55% O 2). Die Agarose die Abschnitte umgeben wird im Inkubator solide bleiben und verwendet werden können, um die Abschnitte zu behandeln, ohne die Netzhaut schädigen. Bessere Schichtqualität erzielt wird, wenn bei 37 ° C innerhalb der jeweiligen Atmosphäre gegenüber oxygenierten Ames &#39;Medium bei RT lagern. Abschnitte können sofort verwendet werden oder kann mit einer guten physiologischen Ergebnisse zu 4 Stunden im Inkubator gelagert werden. </li><li> nächste retinalen Stücke in Agarose und wiederholen Sie den Abschnitten Einbetten 4 - 6. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Im Gegensatz zu den vertikalen Scheiben wird die dendritische Morphologie von radial ausgerichteten Neuronen wie horizontale Zellen und Amakrinzellen gut erhalten. Im Vergleich zum gesamten Netzhaut Präparate sind diese Zelltypen leicht zugänglich für Mikroelektroden und kann sowohl von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Hier konzentrieren wir uns auf der äußeren Netzhaut; jedoch ein ähnlicher Ansatz wurde insbesondere berichtet für amakrinen Zellen der inneren Retina 10. Die Eigenschaften der horizontalen Scheibe Zubereitung haben mehrere Implikationen für funktionelle Studien. Die Anzahl der synaptischen Kontakte zwischen den lichtempfindlichen Zäpfchen und postsynaptischen horizontalen Zellen war beinahe nicht von der intakten Netzhaut. Synaptische Kontakte waren sehr funktionell, Tonic Freisetzung von Neurotransmitter im Dunkeln zeigt. Die Synapse könnte entweder durch endogene Reize wie Licht / Dunkel-Übergänge oder durch externe bipolare Stimulation aktiviert werden. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ein wichtiger Schritt des Verfahrens ist die Isolierung der Netzhaut selbst, die ohne Beschädigung des Gewebes, so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte. Darüber hinaus wirkt sich das Vorhandensein von Resten des Glaskörpers negativ auf die Qualität der Schichten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die korrekte Positionierung der Netzhautstücken. Obwohl größter Sorgfalt ausfindig gemacht wird, um den Boden der Glasschale die Netzhautstücke parallel, könnte die Ebene der Schnitte noch leicht tangential durch die Netzhaut führen. Je nach Blickwinkel wird die dendritischen Feld von radial ausgerichteten Neuronen mehr oder weniger abgeschnitten. Die Technik, die hier präsentiert wird meist auf horizontal ausgerichteten Neuronen beschränkt. Daher ist es nicht möglich, von Photorezeptoren und intakte Zellen bipolar in einer horizontalen Scheibe aufzuzeichnen, da werden die bipolare Zelle Axone abgeschnitten. Darüber hinaus ist es unmöglich, die Höhe der Schnitt perfekt steuern. Ein einzelner retinaler Stück mIGHT somit an einem unerwünschten Ebene geschnitten werden, beispielsweise zwischen den äußeren und inneren Segmenten der Photorezeptoren. Erhöhen der Anzahl von Netzhautstücken in einem Block aus Agarose erhöht die Chancen einer korrekten Ebene mindestens in einem Stück sectioning. Die horizontale Scheibe Vorbereitung ist gut geeignet, um die einzigartigen Eigenschaften von Band Synapsen von Stäbchen und Zapfen-Photorezeptoren zu studieren. Bisher haben wir ein Tier - Knock-out - System zur Untersuchung der Rolle von präsynaptischen Proteinen Complexin 3 und 4 Complexin auf die synaptische Übertragung zwischen Zapfen - Photorezeptoren und horizontalen Zellen 11 verwendet. Es ist auch möglich , die Eigenschaften der postsynaptischen Neurotransmitter - Rezeptoren zu untersuchen, wie dies zuvor 9 gezeigt. Zukünftige Anwendungen wird die Studie von synaptischen Proteinen auf Basis von transgenen Mauslinien mit elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren umfassen. Es wird auch möglich sein, die biophysikalischen Pro zu untersuchenschaften von gap junctions zwischen horizontalen Zellen. Da Lichtantworten gemessen werden kann, wird die Technik auch die Codierung von endogenem Stimuli an der ersten Synapse des visuellen Systems zu untersuchen, verwendet werden. Es ist möglich, die Vorbereitung in der Dunkelheit durchzuführen Licht Anpassung des Gewebes zu verhindern, da sonst die Lichtreaktionen weitgehend kegel angetrieben wird. Zusammenfassend stellt die horizontale Schnittpräparat einen neuartigen Ansatz , die Zugänglichkeit der einzelnen Synapsen als Voraussetzung zur Erhöhung ihrer funktionellen Eigenschaften in den Säuger - Retina 12 zu studieren.

Visuelle Information wird codiert als dynamisches räumlich-zeitlichen Muster der Photorezeptoraktivierung und die Band Synapse zwischen Photorezeptoren und zweiter Ordnung Neuronen bestimmt die Downstream Übertragung von visuellen Informationen. Die vertikale slice Herstellung der Säugernetzhaut ist ein sehr wertvolles Werkzeug Signalverarbeitung in vertikalen Bahnen zu untersuchen, dh zwischen Photorezeptoren und bipolaren Zellen und zwischen den bipolaren Zellen und einige Arten von amacrine Zelle 1, 2, 3, 4. Allerdings vertikale Schnitte verursacht immer schwerer Abschneiden der dendritischen Felder vieler retinalen Neuronen, zu erheblichen Verlust an synaptischen Kontakten führt. Vor allem in der äußeren Netzhaut werden horizontale Zellen betroffen aufgrund ihrer seitlich ausbreiten erweiterten dendritischen Felder und Axonterminal Systeme 5. In einer vertikalenScheibe Vorbereitung, die synaptischen Eingang von Hunderten von Kegel Photorezeptor-Terminals an den Dendriten einer horizontalen Zelle so zu vereinzelten Kontakten reduziert wird. Dies könnte ausreichen, um die Eigenschaften der einzelnen Synapsen zu studieren, aber es funktioniert bei weitem nicht die Signalverarbeitungsfähigkeiten zugrunde liegen die synchronisierte Aktivierung von Photorezeptor-Band Synapsen darstellen. Wir entwickelten daher eine horizontale Schnittpräparat, die horizontal Zelle Dendriten intakt und funktionsfähig fast alle des Kegels Photorezeptor synaptischen Eingangs verlässt. Die Ebene der Unterteilung läuft an der Oberfläche der Netzhaut parallel, im Idealfall durch die innere Kernschicht zwischen den horizontalen Zellen und amakrinen Zellen zu schneiden. Somit sind horizontale Schnitte der äußeren Netzhaut enthält, erstellt auf der präsynaptischen Ort, Photorezeptoren mit inneren und äußeren Segmente sowie synaptischen Terminals und horizontalen Zellen und bipolare Zellen auf der postsynaptischen Ort. Die Zubereitung ist gut geeignet, to untersuchen koordinierte synaptischen Eingänge in horizontale Zelle Dendriten von allen Zapfen-Photorezeptoren in seinem dendritischen Feld. Es könnte daher als nützlich erweisen, um besser auf die Funktionsweise des Photorezeptors ribbon Synapse verstehen, die für die Übertragung von visuellen Informationen von der Matrix der Fotorezeptoraktivierung in eine postsynaptische Reaktion entscheidend ist.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

Vertikale Schnittpräparate sind in der erwachsenen Säugetier-Netzhaut zu untersuchen Schaltung und Signalübertragung aufgebaut. Die Ebene der in diesen Zubereitungen sectioning senkrecht zu der Netzhautoberfläche, wodurch es ideal für die Untersuchung von radial ausgerichteten Neuronen wie Photorezeptoren und bipolaren Zellen machen. Jedoch sind die großen dendritischen Dorne von horizontalen Zellen, Weitfeld amacrine Zellen und Ganglionzellen meist abgestumpften, in diesen Zellen merklich verringert synaptische Aktivität zu verlassen. Während Ganglionzellen und Vertriebenen Amakrinzellen in einer ganzen montierten Vorbereitung der Netzhaut untersucht werden können, horizontalen Zellen und amacrine in der inneren Kernschicht befindlichen Zellen sind nur schwer zugänglich für Elektroden in ganzen Retinagewebe. Um eine maximale Zugänglichkeit und synaptic Integrität zu erreichen, entwickelten wir eine horizontale Schnittpräparat der Maus Retina und untersucht die Signalübertragung an der Synapse zwischen den Photorezeptoren und horizontalenZellen. Horizontal Sektionieren erlaubt (1) eine einfache und eindeutige visuelle Identifizierung der horizontalen Zellkörper für eine Elektrode Targeting, und (2) Erhaltung der erweiterten horizontalen Zelle dendritischen Feldern, als Voraussetzung für eine intakte und funktionelle cone synaptischen Eingang horizontal Zelle Dendriten. Horizontale Zellen aus horizontalen Schnitten Tonikum synaptische Aktivität im Dunkeln zeigte, und sie reagierten Lichtblitze mit einer Reduktion der nach innen gerichteten Strom und verminderte synaptische Aktivität zu informieren. Immunzytochemische deutet darauf hin, dass fast alle Kegel innerhalb der dendritischen Feld von einer horizontalen Zellsynapsen mit seiner peripheren Dendriten etablieren. Die horizontale Scheibe Zubereitung ist daher gut geeignet, um die physiologischen Eigenschaften von horizontal erweitert Netzhautneuronen sowie sensorischen Signalübertragung und Integration in ausgewählten Synapsen zu studieren.

<html> In horizontalen Schichten der Netzhaut der Maus konnte horizontal Zellkörper leicht nach ihrer einzigartigen Morphologie mit mehreren primären Dendriten von einer polygonal Zellenkörper (1A) austretende identifiziert werden. Horizontal Zellkörper in der Nähe der Oberfläche der Scheibe angeordnet wurden routinemäßig zugänglich für Patch-Clamp-Elektroden. Während der Aufnahmen wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefüllt, ihre komplizierten dendritischen arborization offenbaren, die eng ähnelte die Morphologie von Axons tragenden horizontalen Zellen des intakten Maus - Retina 8 (1B). Die Markierung von Kegel Stielen mit Fluorescein-gekoppelten Erdnußagglutinin zeigte eine enge räumliche Beziehung zwischen Kegel Stielen und horizontalen Zelle Dendriten (1C). Mit wenigen Ausnahmen alle Kegel Stielen innerhalb der dendritischen Felds horizontalen Zelle wurden durch dendritische Prozesse in Kontakt gebracht. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Um zu beweisen, dass die Kontakte zwischen den Kegeln und horizontalen Zellen waren funktionell, Patch-Clamp-Aufnahmen wurden von der horizontalen Zellkörper durchgeführt unter dunkeladaptierten Bedingungen waren aktuelle Antworten. gekennzeichnet durch einen nach innen großen durch moderate begleitet Strom auf synaptische Aktivität (2A) mit hoher Frequenz. die Abweichung von der Basislinie und die exzitatorischen postsynaptischen Ströme wurden durch die konstante Freisetzung von Glutamat im Dunkeln verursacht, Glutamat postsynaptischen AMPA- und Kainat-Typ - aktivierenden 9 - Rezeptoren. Einzelne synaptischen Ereignisse durch eine einphasige Wellenform oder komplexere Strombahnen (2B). Die Anwesenheit von Tonika postsynaptischen Aktivität charakterisiert legt nahe , dass Glutamat an den Synapsen Kontakte zwischen lichtempfindlichen Zäpfchen und horizontalen Zelle Dendriten gezeigt in 1C veröffentlicht wurde. Horizontal Zellen aufgenommen reagiert auf Veränderungen in der Lichtintensität, was darauf hinweist, dass die Signalübertragungskaskade in Zapfen-Photorezeptoren war auch intakt und funktionsfähig in einer horizontalen Schnittpräparat. Durch die Reduzierung der Transmitterfreisetzung wurde der Tonika nach innen gerichteten Strom von dunkeladaptierten horizontalen Zellen gehemmt und synaptische Aktivität erschien während der Anwesenheit eines Vollfeld - Lichtreiz (1300 W / cm 2, 470 40 nm) (Abbildung deutlich vermindert 3A). Ebenso verursacht ein Wechsel zur Schwärzung von einer licht adaptierten Zustand einen nach innen gerichteten Strom und erhöhten synaptischen Aktivität (3B). Zusätzlich kurze elektrische Impulse (1-15 V, 1 msec) wurden durch eine Platin-Iridium bipolaren Stimulationselektrode angelegt alle Zapfen-Photorezeptoren in der Nähe eines horizontalen Zellenkörper zu depolarisieren. Die Stimulation induzierte Freisetzung von Glutamat hervorgerufenen großen Amplitude exzitatorischen postsynaptischen Ströme in der aufgezeichneten horizontalen Zelle (3C). in sBERBLICK diese Ergebnisse zeigen überzeugend, dass die Synapse zwischen lichtempfindlichen Zäpfchen und horizontalen Zellen experimentell entweder durch das endogene Stimulus Licht oder durch kontrollierte Depolarisation der präsynaptischen Elemente manipuliert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55173/55173fig1.jpg" /> Abbildung 1: Morphologie und synaptische Kontakte von horizontalen Zellen in einem horizontalen Schnitt Vorbereitung. Eine horizontale Zelle (Pfeil) in der Nähe der Oberfläche der Scheibe angeordnet wurde mit Dodt Kontrastoptik sichtbar gemacht. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m (A). Für die Bildgebung Experimenten wurde eine horizontale Zelle mit Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 uM) über eine Patch-Elektrode gefüllt, die noch an der Zelle angebracht ist. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m (B). Overlay eines Farbstoff injiziert horizontalen Zelle und der Anordnung von Kegel mit Fluorescein-gekoppelten Erdnußagglutinin zeigt Kontakte mutmaßliche synaptischen markierten Stielen.<html> Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55173/55173fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55173/55173fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55173/55173fig2.jpg" /> Abbildung 2: synaptische Aktivität von einer horizontalen Zellkörper aufgezeichnet. Ganzzell Voltage-Clamp - Aufzeichnung bei einem Haltepotential von -60 mV zeigt Hochfrequenz - Tonikum synaptische Aktivität (A). Bei höheren zeitlichen Auflösung (B), zeigen synaptischen Ereignisse monophasische Wellenformen (Pfeil) oder komplexere Strombahnen (Pfeilspitzen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55173/55173fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55173/55173fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> g3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Aktuelle Antworten von Horizontal Zellkörper evozierte von Licht und Elektrostimulation. Lichtantwort eines dunkeladaptierten horizontalen Zellenkörper bei -60 mV Haltepotential aufgezeichnet. Vollfeldbeleuchtung hemmt die Tonika nach innen gerichteten Strom und reduziert die synaptische Aktivität (A). Ein licht angepasst horizontale Zellkörper unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet zeigt einen nach innen gerichteten Strom nach einem dunklen Blitz durch erhöhte synaptische Aktivität bei Dunkelheit (B) begleitet. Horizontale Linien in A und B repräsentieren den Zeitpunkt des Reizes. Extrazellulärem Stimulation durch kurze elektrische Impulse induziert großer Amplitude exzitatorischen postsynaptischen Ströme aufgrund der synchronisierten Freisetzung von Glutamat aus Zapfen - Photorezeptoren (C). Das Haltepotential: -60 mV. Der Pfeil zeigt den Zeitpunkt des Stimulationsimpulses. Trunkierten Ströme am Anfang der Spur repräsentieren Stimulationsartefakte..com / files / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Aufrufe.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken. 

Serie: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurowissenschaften

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Untersuchung bipolarer und horizontaler neuronaler Zellen in der gespaltenen Netzhaut der Maus

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Autor im Rampenlicht: Verwendung der Split-Retina-Technik für verbesserten Zugang und beschleunigte Experimente 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

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