Unterstützt von Career Development Award von der Forschung zur Erblindung zu verhindern, NIH Zuschüsse EY19312 und EY19543 (VJK), sowie durch nicht zweckgebundenen Zuschuss von Forschung zur Erblindung und EY02687 (Klinik für Augenheilkunde und Visual Sciences an der Washington University) zu verhindern.

1. Herstellung von Elektroden <ol><li> Bereiten Glaselektroden. Wiegen Sie 120 mg Agar und mischen Sie es in 10 ml destilliertem Wasser (letzte Konzentration Agar 1,2%). Schmelzen Sie die Agar-Lösung im heißen Wasserbad. Füllen Sie Glaskapillaren (wir benutzen Word-Presision Instruments TW100-4 Kapillaren mit folgenden Abmessungen: Länge = 100 mm, Da / Di = 1/0.75 mm und innere Volumen = 44 mL) mit dem Agar-Lösung mit Kunststoff-Spritze. Verfestigen des Agar bei Raumtemperatur für 10 min. Somit können bis zu ca. 200 Kapillaren gefüllt (der Rest der Mischung kann Agar bei -4 ° C und wieder verwendet mehrfach gespeichert werden). </li><li> Schneiden Sie die Kapillaren in zwei Hälften mit einem Diamant-Messer. </li><li> Weichen Sie die daraus resultierenden Glaselektroden in Maus-Elektrode-Lösung für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Speichern der Elektroden bei 4 ° C und sie über den Zeitraum von 3-4 Monaten. </li></ol> 2. Einrichtung des Tests <ol><li> Dunkel-Anpassung der Maus über Nacht. Verwenden Wildtyp (zum Beispiel C57Bl / 6) Mäuse für Stab-driven transretinal Aufnahmen und T α - / - Mäuse ohne Stab Signalisierung 8 für Kegel transretinal Aufnahmen. </li><li> Bereiten Sie 1 L Perfusionslösung, 100-ml-Elektrode-Lösung und 20 mL Inkubation Lösung (siehe unten) und Filtern der Perfusionslösung Trog eines Millipore 0,45 um oder 0,22 um-Filter (optional). </li><li> Kalibrieren der Lichtquelle (505 nm LED oder Halogenlampe optischen Stimulator) mit Hilfe eines Photometers in der Ebene der Netzhaut zu liegen. Im Fall der LED-Lichtquelle, einen optischen Diffusor verwenden, um Licht Einheitlichkeit zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie die Perfusionskammer für Experiment (Kammer-Konstruktionen können abweichen). Unsere Kammer von 3 mm Plexiglas, mit einem Boden von dem Deckel einer kleinen Petrischale aus Kunststoff hergestellt ist und eine aktive Perfusion Volumen von ~ 400 ul (L = 25 mm, B = 8 mm, H ≈ 2 mm). Füllen der unteren Elektrode Raum der Kammer mit der Elektrode, enthaltend 2 mM L-Glutamat und 10 mM BaCl 2. Die Verwendung von Kunststoff-Schlauch und einer Glaskapillare, eine Verbindung zwischen der Lösung in die untere Elektrode Raum (aus Kunststoff Schlauchverbinder an dem Kammerboden) und dem Elektrodenhalter. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen in der Elektrode, der Verbindungsschlauch, oder der Elektrodenhalter (säubern die Lösung mit Kunststoff-Spritze falls erforderlich). </li><li> Montieren der Aufnahmekammer auf der Bühne des Mikroskops (optional: das Mikroskop über eine Anti-Vibrations-Platte zu befestigen, und abgeschirmt in einem Faraday-Käfig um mechanische und elektromagnetische Rauschen zu minimieren). Verbinden der unteren Elektrode Halter mit dem positiven Pol der headstage Differenzverstärkers (zB Warner Instruments DP-311-Verstärker). Center und richten Sie die Kammer unteren Elektrode Eröffnung mit dem Stimulus Lichtfleck. Verbinden Sie die Perfusion Linie auf die Aufnahme Kammer und drehen Sie die Durchblutung an. </li><li> Blase die Perfusionslösung mit 95% O 2/5% CO 2 inkubiert, während es in 40 ° C watER Bad. CO 2 wird der pH der Lösung auf 7,2. Die Lösung fließt aus der Flasche zu der Aufnahmekammer durch die Schwerkraft, die durch einen keramischen Widerstand Wiederaufheizen auf 36-37 ° C Um Wärmeverluste zu verringern, sollte die Heizung möglichst nahe an der Aufnahme Kammer wie möglich, idealerweise auf der Bühne des Mikroskops liegen. </li><li> Mit einem Durchflussregler die Strömungsrate bis etwa 1 ml / min. </li><li> Verbinden der oberen Elektrode mit dem zweiten (negativen) Pol der headstage unter Verwendung eines zweiten Elektrodenhalter. Binden die Thermoelementsonde an die obere Elektrode mit einem O-Ring. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode und Thermoelement Spitzen nahe beieinander, so dass die Temperaturanzeige so nah an der Mitte der Netzhaut wie möglich getroffen wird. Tauchen der Spitze der oberen Elektrode in der Perfusion und gibt sie in der Mitte der Kammer. Lassen Sie 10-15 Minuten, um grundlegende Stabilisierung. </li><li> Einstellen der Gleichspannung für die Heizung, so dass die Temperatur der Lösung 36 ist -37 ° C </li></ol> 3. Isolieren Sie die Maus-Retina <ol><li> Unter schwaches rotes Licht, einschläfern die Dunkelheit angepasste Maus mit CO 2 und Genickbruch. Optional: Erstellen Sie eine Referenzmarke auf jeder Maus Augapfel durch Ausbrennen der meisten dorsalen Punkt der Lederhaut mit einem Brenneisen Stift oder beheizten Sezieren Stift. Alle nachfolgenden Verfahren werden unter Infrarot-Licht mit Infrarot-Bildwandler Passform zu einem Binokular durchgeführt. </li><li> Präparieren Sie die Augen mit einer gebogenen Schere durch leichten Druck und Dehnung der Haut an den Seiten jedes Auge. Hemisect beide Augäpfel unter IR-Beleuchtung mit Mikroschere oder einer Rasierklinge. </li><li> Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. Entfernen Sie so viel wie möglich des Glaskörpers. </li><li> Schälen Sie den ersten Netzhaut vom Pigmentepithel Schicht und, wenn nötig, reinigen Sie es mit einer Pinzette, um verbleibende Granulat von Pigmentepithel zu entfernen. Wir sind in der Regel mit ganzen Netzhaut sowohl für die Stäbchen und Zapfen transretinal Aufnahmen. Allerdings, wenn Sie wollen, speziell aus dem dorsalen Teil der Netzhaut, die Maus mehr M / L-Zapfen 9 hat aufzuzeichnen, vor dem Schälen die Netzhaut entfernen Sie den ventralen Teil des Augenmuschel mit einer Rasierklinge oder Mikroschere mit dem Brenneisen Marke als Referenz. </li><li> Legen Sie die zweite hemiseziert Augapfel in einer kleinen Petrischale mit Inkubationslösung und inkubieren Sie die Zubereitung in einem lichtdichten Gehäuse mit reinem Sauerstoff bis zur Verwendung gesättigt. In der Regel unter diesen Bedingungen die zweite Maus Augenmuschel kann für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gelagert werden und für Aufnahmen. </li><li> Mit einem Glas oder Kunststoff Pipette übertragen die isolierte Netzhaut zu einem Rückgang der Perfusionslösung (ca. 300 ul) auf dem Deckel einer Petrischale. Fügen Sie 5-6 kleine Tropfen der Elektrode Lösung mit BaCl 2 vor, inkubieren der Netzhaut mit BaCl 2. Setzen Sie ein quadratisches Stück (ca. 5x5 mm) der Rückseite Ecke gefettet (wir verwenden Dow Corning 111 Ventil Schmier-und Dichtmittel) Millipore-Filterpapier (0,45 um HArg Typ) mit vorgefertigten Loch in ihrer Mitte (von 2 bis 2,5 mm Durchmesser) auf die gleiche Lösung Tropfen. Mit einer Pinzette die Netzhaut Position auf dem Filterpapier (Photorezeptor Seite nach oben) und drücken Sie den Rändern an der Peripherie zu Flachbild-mounten. Die Netzhaut sollte über der Öffnung in dem Filterpapier zentriert werden. </li><li> Mit einer Pinzette Das Filterpapier mit der Retina zum Perfusionskammer und legen Sie es über dem Stimulus-Spot ausgerichtet unteren Elektrode Raum. Leicht drücken Sie die gefetteten Kanten des Filterpapiers zu verbinden es mit der Kammer. </li><li> Legen Sie die obere Elektrode über die Netzhaut Zentrum (leicht berühren Photorezeptorschicht). Die Zentrierung des oberen Elektrode auf der Netzhaut erhöht die Signalamplitude (bis zu ~ 20-40% gegenüber rl es näher an der Retina Rand im Vergleich). Obwohl eine solche Elektrode Lage leicht verzerrt den effektiven Licht Reizintensität Erreichen eines kleinen Sektor der Netzhaut (~ 12-15% der Gesamtfläche), ist es immer noch die optimale Art und Weise der Abgabe des elektronischenzertrat. Das Präparat ist jetzt bereit für transretinal Aufnahmen. </li></ol> 4. Transretinal Recordings <ol><li> Abhängig von Ihrer Mauslinie, Rekord Stab oder M / L-Kegel-driven-Test Flash-Reaktionen zwischen schwach und stark Intensität der kalibrierten 505 nm Licht von LED-Lichtquelle oder optische Stimulator zur Verfügung gestellt. Im Falle unserer LED-Lichtquelle, wird der Blitz-Intensität durch eine Kombination von computerisierte Steuerung von LED-Eingangsspannung, schaltbare Widerstände, und eine Reihe von Neutralfilter (wir verwenden E-Farbe Nr. 211 0,9 ND-Filter von Film Rosco Laboratories gesteuert ) zwischen der LED und der Netzhaut platziert. Die Dauer der LED Probeblitz (20 ms) durch einen Computer gesteuert. Wenn unter Verwendung einer Halogenlampe optischen Stimulator kann Probeblitz Intensität und Wellenlänge durch einen Satz von Neutralfilter und Schmalband-Interferenz-Filter, jeweils gesteuert werden. Testen Blitzdauer kann durch Computer-gesteuerte Jalousien gesteuert werden. </li><li> Optional: zur Aufrechterhaltung eines effizientenUnterdrückung der Glia-Komponente der Photoreaktion mit BaCl 2 im Laufe des Tages, ändern Sie die untere Elektrode Lösung gelegentlich (z. B. vor der Prüfung jedes einzelnen Retina) durch Spülen Sie es mit einem Kunststoff-Spritze mit frischer Lösung gefüllt. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Lösungen <ol><li> Mausretina Perfusionslösung: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na Succinat, 0,5 mM Na Glutamat, 0,02 mM EDTA, und 10 mM Glucose. Darüber hinaus wird die Lösung mit 2 mM L-Glutamat und 10 pM DL-A-4, um Komponenten höherer Ordnung der Photoreaktion 10,11 Block ergänzt, und mit 0,1% MEM-Vitaminen und Aminosäuren MEM Lösungen (Sigma) bis zu Netzhaut zu verbessern Lebensfähigkeit. </li><li> Maus-Elektrode Lösung: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). Die Lösung in dem unteren Elementctrode Raum enthält auch 2 mM L-Glutamat in die synaptische Übertragung 10 und, zusätzlich zu blockieren, 10 mM BaCl 2 zu unterdrücken die Gliazellen Komponente des Photoantwort 3,12. </li><li> Retina Inkubationslösung: Man löst 272 mg L-15-Medium (Sigma) und 20 mg BSA in 20 ml deionisiertem Wasser. Endgültige L-15 und BSA-Konzentrationen sind 13,6 mg / ml und 1 mg / ml. Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl. </li></ol><img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung der Maus Netzhaut für transretinal ERG-Aufnahmen. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> Abbildung 2. Foto des Perfusionskammer und Aufzeichnungs-Elektroden mit ihren Haltern. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; Abbildung 3. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für transretinal ERG-Aufnahmen. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> . Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse: aufgezeichnet Familie Maus Stab-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt Spuren stellen Durchschnittswerte von 5-6 Antworten auf dim Lichtintensitäten und 2-3 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> Abbildung 5 Repräsentative Ergebnisse:. Aufgezeichnete Familie der Maus Kegel-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt werden Spuren AVERAGES von 5-10 Reaktionen bei schwachen Licht-Intensitäten und 3-5 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten.

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfind...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> DL-A-4 </td><td></td><td> Tocris Bioscience </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Alle anderen Reagenzien </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glaskapillaren </td><td></td><td> World Precision Instruments </td><td> TW100-4 </td><td> Zur Herstellung von Elektroden </td></tr><tr><td> Filterpapier </td><td> HArg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Photometer </td><td></td><td> UDT Instruments </td><td> S350 </td><td> Für leichte Kalibrierung </td></tr><tr><td> Radiometrische Silicon Sensor </td><td></td&gt; <td> UDT Instruments </td><td> 221 </td><td> Für leichte Kalibrierung </td></tr><tr><td> Antischwingungstisches </td><td></td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Um mechanische Geräusche zu minimieren </td></tr><tr><td> Luftkompressor Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther International </td><td> P 15TC </td><td> An Antischwingungstisches </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Für Maus Auge Dissektion </td></tr><tr><td> Infrarot-Bildwandler </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Gebunden an Stereomikroskop </td></tr><tr><td> Differenzverstärker DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon 1440A Digidata Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel 8-Pol-Filter </td><td></td><td> Krohn-HITE GmbH </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Keramische Widerstand </td><td></td><td> TE Connectivity </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Für Wiedererhitzen des Perfusionslösung </td></tr><tr><td> Thermoelement </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturwächter </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Verbunden mit Thermoelement </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Zum Test Blitze / Bleichen Licht gelten </td></tr><tr><td> Kautergriff Stift </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Zur Markierung der dorsalen Teilder Maus Augapfels </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung und-analyse-Software </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik 1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten 3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation 6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung 8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout (- / - Tα) erhalten werden

Watch this Scientific Journal Video about Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses at JoVE.com

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.6K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Serie: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

Nicht-invasive EEG-Ableitungen von frei beweglichen Ferkel

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Mit Zapfen angereicherte Kulturen von der Netzhaut von Hühnerembryonen zur Untersuchung zellulärer Interaktionen von Stäbchen zu Zapfen

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.