Wir danken Andrea Parmeggiani (L2C und DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) sowie Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen, Christophe Duperray für die Hilfe bei der FACS-Analyse, die Montpellier RIO Imaging Facility (MRT) für die Bereitstellung von eine angemessene Umgebung für FACS und konfokale Mikroskopie. BNM wurde durch ein Graduiertenstipendium von der LABEX Numev (convention ANR-10-LABX-20) unterstützt. AB von einem Bachelor-Stipendium der Universität Warschau und der Europäischen Union unterstützt wurde (n POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV ist ein wissenschaftlicher Mitarbeiter vom Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS).

Tag 1 1. Markieren des mesenchymalen Stammzelle (MSC) Mitochondria (Optional) <ol><li> Zwei Tage vor der Mitochondrien Präparation, Samen humane MSCs in einer 100 mm Kulturschale in 10 ml &amp; agr; MEM / 10% FBS, um bis 4 haben x 10 5 MSCs in Kultur am Tag 1. </li><li> Spülen Sie MSCs mit PBS (4 ml) und 4 ml &amp; agr; MEM / FBS 1% (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Fügen Sie die erforderliche Menge an Mitochondrien Vitalfarbstoff und inkubieren Zellen für 30 Minuten im 37 ° C-Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Mitochondrien Farbstofflösung, spülen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml vorgewärmtem (37 ° C) &amp; agr; MEM / FBS 1% und fügen Sie zurück 4 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%. Inkubiere Zellen bei 37 ° C. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium (10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%) nach 30 min und ein weiteres Mal, zwei Stunden später. </li></ol> Tag 1 2. Markierung der Glioblastom Stammzellen (GSC) (optional, siehe Diskussion Sektion) <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-mit-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Zellkulturmedium , </td><td> Zusammensetzung </td></tr><tr><td rowspan="5"> GSC Basalmedium </td><td> DMEM / F-12, ergänzt mit </td></tr><tr><td> Insulin 20 mg / ml </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung 1x </td></tr><tr><td> Glucose 3 g / L </td></tr><tr><td> L-Glutamin 2 mM </td></tr><tr><td rowspan="9"> GSC Proliferationsmedium </td><td> In den Basismedium: </td></tr><tr><td> B27 Ergänzung 1x </td></tr><tr><td> EGF 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF 10 ng / ml </td></tr><tr><td> Fungine 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Fungizone 0,25 mg / ml </td></tr><tr><td> Heparin 2 mg / ml </td></tr><tr><td> Ciprofloxacin 2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin 2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td rowspan="4"> MSC Proliferationsmedium </td><td> &amp; #945; MEM, ergänzt mit </td></tr><tr><td> L-Glutamin 2 mM </td></tr><tr><td> 10% FBS </td></tr><tr><td> bFGF 2 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kulturmedien. <ol><li> Distanzieren GSCs (Gb4 Zelllinie 32 (10 x 10 6 Zellen) als Neurosphären auf Poly-HEMA beschichteten Zellkulturflaschen gezüchtet (siehe Schritte 3,1-3,12). </li><li> Seed GSCs in einer 48-Well - Platte bei 10 5 Zellen / Vertiefung in GSC Proliferationsmedium (500 &amp; mgr; l) (siehe Tabelle 1). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Die erforderliche Menge an Zellvitalfarbstoff und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> In 500 ul GSC Basalmedium (Tabelle 1) pro Vertiefung der 48-Well - Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5 auf 2.6. </li><li> In 500 ul GSC Basismedium und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren. </li><li> In 500 ul GSC Proliferationsmedium pro Vertiefung der 48-Well-Platte und Inkubation in dem 37 ° C Inkubator. Anmerkung: Die Menge an GSCs angegeben (10 x 10 6 Zellen) ermöglicht , die verschiedenen Dosis-Wirkungs-Experimente und FACS Kontrollen durchzuführen. Sobald die Versuchsbedingungen mehr exakt diese Menge definiert ist, kann verkleinert werden. </li></ol> Tag 2 3. Seeding von Glioblastom Stammzellen <ol><li> Sammeln Sie die GSC Neurosphären (10 x 10 6 Zellen) durch Zentrifugation bei 270 g für 5 min bei 20 ° C in einem 50 - ml - Tube. </li><li> Wasche die Zellen mit 5 ml HBSS, und die Zentrifuge bei 270 × g für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren. </li><li> resuspendieren vorsichtig die GSC-Pellet in 100 ul Trypsin-EDTA (0,25%) (je 10 x 10 <sbis&gt; 6 Zellen) </li><li> 3 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l CaCl 2 (20 mM) und 2 &amp; mgr; l DNase I (10 mg / ml). </li><li> Distanzieren die Neurosphären durch sanftes Auf- und Abpipettieren (30-50x) mit einer P200 Pipette. Vermeiden Sie Blasen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass alle GSCs gelöst sind. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Trypsin-Inhibitor (5%) und 10 ml HBSS. </li><li> Zentrifuge GSCs bei 270 xg für 7 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und 10 ml GSC Basis - Medium (Tabelle 1). </li><li> Graf GSCs mit einer Thoma-Zählkammer und dann zentrifugiert werden die Zellen bei 270 g für 7 min bei 20 ° C. </li><li> Fügen Sie das entsprechende Volumen von GSC Proliferationsmedium (Tabelle 1) , um die zelluläre Konzentration von 10 6 GSCs / ml zu erreichen. </li><li> Seed 10 5 GSCs (100 &amp; mgr; l der Zellsuspension) pro Well einer 96-Well - Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platten bei 270 g für 7 min bei 20 ° C GSCs zu erhalten bei den Bottom von Brunnen. </li><li> Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C bis Abschnitt 5. </li></ol> Tag 2 4. MSC Mitochondria Isolation <ol><li> Stellen Sie die microtube Zentrifugentemperatur auf 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen &quot;A&quot; und &quot;C&quot; enthält die Reagenzien für den Mitochondrien Extraktion (200 ul Reagens A und 400 ul Reagenz C, enthalten beide die EDTA-freie Protease-Inhibitoren). Bereiten Sie zwei weitere Rohre, die mit &quot;MSC&quot; und &quot;Mito&quot;. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis. Auch bereiten Röhren für den Mitochondrien Reihenverdünnungen. </li><li> Wasch MSCs mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C) PBS. </li><li> Wash MSCs mit 2 ml Trypsin (kein EDTA) für 10 Sekunden und 1 ml Trypsin (kein EDTA). Inkubiere Zellen für 5-10 min bei 37 ° C. </li><li> Recover die MSCs durch Zugabe von 10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%, in einen 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und fügen10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10% zum Zellpellet. </li><li> Zählen Sie die MSCs mit einem Malassez Zählkammer. </li><li> Zentrifuge MSCs (4-5 x 10 &amp; sup5 ; ) bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen, fügen Sie 1 m eiskalter &amp; agr; MEM / FBS 10% auf dem Zellpellet und übertragen Sie die Zellen auf die &quot;MSC&quot; -markierten Rohr (hergestellt in Schritt 4.2). Halten Sie das Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen die MSCs bei 900 xg für 5 min bei 4 ° C enthält. </li><li> Entfernen Sie alle Reste des Mediums aus der Tube. </li><li> In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz A (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden und lassen Röhrchen auf Eis genau 2 min. </li><li> Hinzufügen, 2,5 ul Mitochondria Isolation Reagent B. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 10 sec, und dann Röhrchen auf Eis belassen. Wiederholen Sie alle 30 Sekunden für 5 min. </li><li> In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz C (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Mischen Sie durch das Rohr Kippen (roughly 30-mal, nicht vortexen). Zentrifugiere die Röhrchen bei 700 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand (mit der MSC Mitochondrien) in die &quot;Mito&quot; Rohr (hergestellt in Schritt 4.2). </li><li> Zentrifuge bei 3000 xg, 15 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien. </li><li> Spülen Sie die Mitochondrien-Pellet mit 200 &amp; mgr; l des Reagenz C. Dann Zentrifuge bei 12.000 xg, 5 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten. </li></ol> 5. Übertragung von isolierten MSC Mitochondria zu GSCs (MitoCeption) <ol><li> Zugabe von 200 ul der vorgekühlten (0 ° C) GSC Proliferationsmedium in die Mitochondrien - Pellet von MSCs isoliert (4 x 10 5). </li><li> Verdünnen Sie die Mitochondrien Vorbereitung (in GSC Proliferationsmedium) konsequent 20 ul mitochondriale Suspension zu den GSCs hinzuzufügen. </li><li> Füge das Volumen von isolierten Mitochondrien in die Vertiefungen der 96-well Platte die GSCs (aus Schritt 3.15), in der gewünschten Konzentration (0,1 bis 10 &amp; mgr; g) enthielt. Fügen Sie den Mitochondrien langsam, nahe dem Boden des Bohrlochs, um die gesamte Oberfläche mindestens einmal abdeckt. </li><li> MSC Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage Zur Steuerung, fügen Sie die gleichen Mengen der Mitochondrien-Präparat (0,1 bis 10 ug) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte GSC Proliferationsmedium, das nur (keine GSCs) (Teil 6.2 für Vitalfarbstoff Leckageerkennung sehen). </li><li> Zentrifuge die 96-well Platte die Mitochondrien Empfänger GSCs mit der MSC Mitochondrien (Schritt 5.3) und der Steuerplatte (Schritt 5.4) bei 1.500 xg für 15 min bei 4 ° C enthält. </li><li> Legen Sie die Kulturplatten in der 37 ° C Zellinkubators unmittelbar nach dem Zentrifugieren. Hinweis: Die Mitochondrien Übertragungsprotokoll beruht auf der Zentrifugation der Mitochondrien-Suspension auf die kultivierten Zellen am ausreichende Zentrifugationskraft, mit einer Reihe von Zentrifugationen, die in Abhängigkeit von der syst eingestellt werden kann,em von Mitochondrien Donor / Empfängerzellen. </li></ol> Tag 3 6. Analyse der Mitochondria Übertragung durch FACS und konfokale Bildgebung <ol><li> Herstellung von GSC Proben für die FACS - Analyse Hinweis: Wenn MSC Mitochondrien mit einem vitalen Farbstoff markiert wurden vorher (Abschnitt 1) ​​kann die Effizienz durch FACS überwacht werden, 24 Stunden nach der Mitochondrien Übertragung. <ol><li> Zentrifuge die 96-well Platte mit den MitoCepted GSCs bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> 100 l Trypsin (kein EDTA) in jede Vertiefung geben. 3 min bei 37 ° C inkubieren. Pipettieren nach oben und unten die Neurosphären in der 24-Stunden-Zeitraum gebildet zu distanzieren. </li><li> 100 l GSC Basalmedium. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren GSCs in 300 ul GSC Basismedium und Transfer zum FACS angepasst Rohre. </li><li> Führen Sie die FACS einalysis. </li></ol></li><li> Steuerung für Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage aus dem isolierten Mitochondrien (FACS) Hinweis: Der Zweck dieses Schrittes ist es, das Hintergrund FACS-Signal zu bestimmen, die nicht eine echte MSC Mitochondrien Übertragung widerspiegeln würde, sondern vielmehr das bloße Leckage von Vitalfarbstoff aus der MSC markierten Mitochondrien für MitoCeption verwendet (Schritt 5.3). <ol><li> Seed GSC-Zellen wie in den Schritten 3,1-3,15 beschrieben. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen nur Mitochondrien enthält (aus Schritt 5,4 bis 5,6) bei 1.500 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Saugen Sie das Kulturmedium aus dem GSC 96-Well-Platte (Schritt 6.2.2) und ersetzen Sie es nur durch das Medium mit Mitochondrien inkubiert (Stand aus Schritt 6.2.3). </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen, die GSCs bei 37 ° C für 2 Stunden enthält. </li><li> Gehen Sie wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.7 für FACS-Analyse. </li></ol></li><li> Herstellung von GSC samples für die konfokale Bildgebung Hinweis: Wenn die Übertragung der MSC Mitochondrien GSCs ist durch Fluoreszenz-Bildgebung untersucht werden, wobei beide MSCs und GSCs müssen vorher markiert werden, die jeweils mit den Mitochondrien (Schritt 1) ​​und Zelle (Schritt 2) Vitalfarbstoffe. <ol><li> Bereiten Sie GSCs wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.5. </li><li> Resuspendieren GSCs in 2 ml GSC Proliferationsmedium, das 2% FBS und Samen in 35 mm Kulturschalen (Glasboden). </li><li> Führen Sie die konfokale Abbildung auf den GSCs mit den übertragenen Fluoreszenz MSC Mitochondrien 24 Stunden später. </li></ol></li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Transfer+by+Photothermal+Nanoblade+Restores+Metabolite+Profile+in+Mammalian+Cells.">Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells.</a> Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+human+mitochondrial+transfer:+a+novel+concept+based+on+the+endosymbiotic+theory.">Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).</li><li>Caicedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCeption+as+a+new+tool+to+assess+the+effects+of+mesenchymal+stem/stromal+cell+mitochondria+on+cancer+cell+metabolism+and+function.">MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function.</a> Sci Rep. 5, 9073 (2015).</li><li>Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Mitochondrial+Transformation+into+Human+Cells.">Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells.</a> Sci Rep. 6, 26057 (2016).</li><li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Osswald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+cells+interconnect+to+a+functional+and+resistant+network.">Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network.</a> Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).</li><li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+mediates+homing+of+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells+to+glioma+stem+cells.">TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells.</a> Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).</li><li>Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homing+of+human+cord+blood+stem+cells+to+sites+of+inflammation:+unfolding+mysteries+of+a+novel+therapeutic+paradigm+for+glioblastoma+multiforme.">The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme.</a> Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).</li><li>Guichet, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+neuronal+differentiation+of+glioblastoma+stem-like+cells+induced+by+neurogenic+transcription+factors.">Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors.</a> Glia. 61 (2), 225-239 (2013).</li><li>Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+Sanger+strategy+for+human+mitochondrial+genome+sequencing.">A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing.</a> BMC Genomics. 14, 881 (2013).</li></ol>

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), mit dem CJ und ML.V. angeschlossen sind, hat eine Patentanmeldung auf der MitoCeption Technik (EP14306154.7) eingereicht.

Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass Zellen, die Mitochondrien austauschen können, und dass diese Mitochondrien haben tiefgreifende Auswirkungen auf die Zielzellstoffwechsel und Funktionen. Daher ist es wichtig, die Werkzeuge, zu beherrschen, um quantitativ die Mitochondrien aus den Spenderzellen zu diesen Zielzellen übertragen, um eine genaue Untersuchung ihrer biologischen Wirkungen zu ermöglichen. Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich Mitochondrien zu übertragen ...

Mitochondrien sind Organellen in eukaryotischen Zellen zu finden, wo sie eine zentrale Rolle bei der Nährstoffaufnahme sowie in der Energie- und Stoffproduktion spielen. Diese Organellen enthalten Kreis mitochondriale DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, die Proteine der Elektronentransportkette Komplexe, tRNAs und rRNAs 1 kodiert. Die Funktionalität dieser Organellen ist entscheidend für die Homöostase Zelle und mehreren Pathologien haben mit Mitochondrien - Dysfunktion 1, 2, 3 verbunden. Die Mitochondrien - Status hat , beispielsweise auf eine Entzündung, Infektionskrankheiten und Krebs in Verbindung gebracht worden, in diesem letzteren Fall mit Folgen für Metastasierung und Therapieresistenz 4, 5, 6, 7. Mitochondria zeigen die bemerkenswerte Fähigkeit von<html> Immer zwischen &quot;Spender&quot; und &quot;Ziel&quot; Zellen übertragen. Dies führt zu Änderungen im Energiestoffwechsel der Zielzellen sowie in andere funktionelle Modifikationen wie die Reparatur von Gewebe und Beständigkeit gegenüber chemotherapeutischen Mitteln, wie kürzlich von verschiedenen Laboratorien 8 gezeigt, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Die humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zeigen diese Fähigkeit Mitochondrien zu einer Vielzahl von Zielzellen zu übertragen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, Lungen alveolaren Epithelzellen, renale tubuläre Zellen und Krebszellen, Änderungen der funktionellen Eigenschaften dieser Zellen führt 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. Mitochondria Austausch erscheint nun als weit verbreiteter Mechanismus, der eine Reihe von verschiedenen Zelltypen ermöglicht, miteinander und ändern ihre biologischen Eigenschaften zu kommunizieren. Diese Mitochondrien Austausch kann Tunneling - Nanoröhrchen (TNT) Bildung kommen durch, an denen Connexin 43 enthaltenden gap junctions 8 oder M-Sec / TNFaip2 und die Exocyst Komplex 19. Alternativ wurde die Mitochondrien Übertragung auch durch Arrestin domain-containing protein 1-vermittelten Mikrovesikel (ARMMs) 20 vermittelt gezeigt werden. Interessanterweise wurde die Wirksamkeit der Mitochondrien Übertragung auf die Expressionsrate des Rho - GTPase 1 Miro1 21 verbunden ist , ein Schlüsselfaktor zur Erklärung der Unterschiede in den Mitochondrien Transfer Wirksamkeiten zwischen iPSC-MSCs und Erwachsenen BM-MSCs 22. Trotz dieser Vielzahl von Daten über Zell-zu-Zell-Mitochondrien Austausch wird relativ wenig über die metabolischen und biologischen Ergebnisse dieser Mitochondrien Übertragung bekannt. Daher voll es garantiert, dass die entsprechenden Tools einrichten, um vollständig die biologischen Wirkungen dieser Übertragung beurteilen. Im Laufe der Jahre auf mehrere technische Ansätze Mitochondrien von Spender zu Akzeptor-Zellen übertragen wurden vorgeschlagen. Dazu gehören die direkte Injektion von Mitochondrien in Oozyten 23, 24, 25, Zellfusion transmitochondrial cybrids 26, 27 zu erzeugen , und in jüngster Zeit , die Übertragung von isolierten Mitochondrien Lichtwärmeumsetzmaterial Verwendung nanoblades 28. Wir und andere haben bereits gezeigt, die Fähigkeit von isolierten mitochondria durch lebende Zellen internalisiert zu werden, sowohl in vitro als auch in vivo als beobachtet 29, 30, 31, durch Mechanismen vorgeschlagen Makropinozytose 32 einzubeziehen. Wir entwickelten außerdem ein Verfahren, genannt MitoCeption, quantitativ zu isolierten Mitochondrien übertragen (von MSCs) an die Zielzellen, wie mit dem (adhärenten) beispielhaft MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie 31. Dieses Protokoll wurde hier für die Übertragung von isolierten humanen MSC Mitochondrien Glioblastom Stammzellen (GSCs) angepasst ist. Glioblastome sind aggressive bösartige Tumoren des Gehirns, die sich schnell auf die Behandlung resistent werden, vor allem wegen Glioblastom Stammzellen (GSC) , die innerhalb des Tumors 33. Diese GSCs wachsen als Neurosphären in vitro und erzeugen Tumoren in Xenotransplantatmodellen. Krebszellen innerhalb Glioblastom haben dieKapazitäts Zell-zu-Zell Verbindungen herzustellen, wie kürzlich für Astrozyten Gehirntumorzellen gezeigt , die Zwischenverbindung über erweiterte Mikroröhrchen, durch die Mitochondrien (sowie Calcium und Zellkerne) wandern kann, was zu einer Strahlentherapie festen Astrozytom Netzwerke 34. Glioblastom können viele verschiedene Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung rekrutieren, darunter MSCs 35, 36. Wir haben gezeigt, dass MSCs können Zell-Zell-Verbindungen mit GSCs in Co-Kultur machen und übertragen ihre Mitochondrien (Daten nicht gezeigt), die voraussichtlich GSC funktionelle Eigenschaften zu modifizieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie die MitoCeption Technik Mitochondrien, isoliert vorher aus menschlichen MSCs, die menschliche GSCs mit dem Zweck zu übertragen verwendet werden können, deren funktionelle biologische Ergebnis zu bestimmen. Die multi- und hoch tumorigenen Gb4 GSC Linie 37 wurde in dieser Studie verwendet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mitochondria Isolation Kit for Tissue&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10579663</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11520536</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11500446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>H4385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly Heme&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P3932</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aMEM w/o glutamine</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>BE12-169F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 without glutamine,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11540566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I 1882&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Human&#160;bFGF&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>AF-100-15&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>2382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine Inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25200056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors EDTA free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17850-5G-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungine&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-fn-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15290018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Green FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M7512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M22426&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C7025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Blue CMF2HC</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C12881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-24948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Sterile Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2,523,749</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS apparatus</td>
			<td>Gallios&#160;</td>
			<td>&#160;3L 10C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3515885001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle für den Zellstoffwechsel, Energieerzeugung und Kontrolle der Apoptose. Eine unzureichende Funktion der Mitochondrien ist verantwortlich für die verschiedensten Krankheiten gefunden, von neurologischen Krankheiten bis hin zum Krebs. Interessanterweise haben Mitochondrien kürzlich die Fähigkeit zur Anzeige übertragen werden zwischen Zelltypen, insbesondere von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), um Krebszellen in Kokultur Bedingungen mit metabolischen und funktionellen Konsequenzen für den Mitochondrien Empfängerzellen gezeigt worden, das weiterhin den aktuellen Interesse zu verstärken für die biologischen Eigenschaften dieser Organellen. Evaluierung der Effekte der übertragenen MSC Mitochondrien in den Zielzellen ist von vorrangiger Bedeutung, die biologische Ergebnis solcher Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen. Das MitoCeption hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Übertragung der zuvor aus der Spenderzellen zu den Zielzellen isolierten Mitochondrien, MSC Mitochondrien unter Verwendungund Glioblastom Stammzellen (GSC) als Modellsystem. Dieses Protokoll ist zuvor verwendet worden, Mitochondrien, isoliert von MSCs zu übertragen, MDA-MB-231 Krebszellen haftend. Diese Mitochondrien - Transfer - Protokoll wird hier für GSCs angepasst, die die spezifische Besonderheit der wachsenden als Neurosphären in vitro präsentieren. Die Übertragung der isolierten Mitochondrien kann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und konfokaler Bildgebung Mitochondrien Vitalfarbstoffen verfolgt werden. Die Verwendung von Mitochondrien Donor- und Zielzellen mit unterschiedlichen Haplotypen (SNPs) ermöglicht auch Detektion der übertragenen basierend Mitochondrien von der Konzentration ihrer Kreis mitochondriale DNA (mtDNA) in den Zielzellen. Sobald das Protokoll mit diesen Kriterien überprüft wurde, können die Zellen, die übertragenen Mitochondrien beherbergen die Wirkungen der exogenen Mitochondrien auf biologische Eigenschaften zu bestimmen, untersucht werden, wie beispielsweise Zellstoffwechsels, Plastizität, Proliferation und Ansprechen auf die Therapie.

Die Verfahrensschritte die Isolierung von Mitochondrien aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) und deren Übertragung auf die gezielte Glioblastom Stammzellen (GSC) durch MitoCeption skizziert sind in Abbildung 1 dargestellt. GSCs sind Krebsstammzellen als Neurosphären gewachsen ihre Stammzelleigenschaften zu erhalten. Für das Protokoll werden GSCs ausgesät als einzelne Zellen ein paar Stunden vor der Übertragung der Mitochondrien (Schritt 3) zu höheren Mitochondrien ?...

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MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Hier wird ein Protokoll (MitoCeption) dargestellt Mitochondrien zu übertragen, isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), zu Glioblastom Stammzellen (GSC), mit dem Ziel, ihre biologischen Wirkungen auf Stoffwechsel und GSC Funktionen studieren. kann ein ähnliches Protokoll Mitochondrien zwischen anderen Zelltypen zu übertragen, angepasst werden.

MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Aufrufe.  Montpellier University.  Hier wird ein Protokoll (MitoCeption) dargestellt Mitochondrien zu übertragen, isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), zu Glioblastom Stammzellen (GSC), mit dem Ziel, ihre biologischen Wirkungen auf Stoffwechsel und GSC Funktionen studieren. kann ein ähnliches Protokoll Mitochondrien zwischen anderen Zelltypen zu übertragen, angepasst werden. 

Serie: MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Counting Nervenstammzellen

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...