Name: isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements at JoVE.com

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

Die Quadrizeps Muskelbiopsie aus einem narkotisierten Schwein genommen, aus denen Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden. Das Schwein wird danach für ein anderes Experiment verwendet. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Zustimmung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz durchgeführt. 1. Skelettmuskel Homogenisieren und Mitochondriale Isolation <ol><li> Excise 5-10 g Quadrizeps Probe von einem narkotisierten Schwein. Im vorliegenden Test verwenden Schweineskelettmuskel. Dieses Protokoll kann auch von anderen Spezies Mitochondrien zu isolieren , verwendet werden (zB Ratten, Mäuse, Mensch, etc.). HINWEIS: Dieser Schritt ist von einem Facharzt mit Erfahrung in der Chirurgie durchgeführt wird. <ol><li> Sedate Schweine mit intramuskulär Ketamin (20 mg / kg) und Xylazin (2 mg / kg), vor der Narkose mit intra induziertvenöse Midazolam (0,5 mg / kg, sowie Atropin 0,02 mg / kg). Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit kontinuierlicher intravenöser Infusion von Propofol (4-8 mg / kg pro h) und Fentanyl (30 &amp; mgr; g / kg pro h) während der Operation. </li></ol></li><li> Sofort tauchen in ein Becherglas mit 20 ml eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer (Tabelle 1) , um die Gewebeprobe. HINWEIS: Die Puffer während der Homogenisierung verwendet und Zentrifugationen sollte mit Cytosol kompatibel mit einer ionischen und osmotische Stärke eine physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe in das Becherglas auf einer analytischen tarierten Balance. Tarieren mit dem Becher 20 ml Isolationspuffer enthält. </li><li> Das Becherglas auf einem Eiskübel. HINWEIS: alle nächsten Schritte aus, um für die Homogenisierung Verfahren bei der Eiskübel Temperatur und halten alle Puffer auf dem Eis Eimer. </li><li> Mince die Skelettmuskulatur in den Becher (auf Eis halten) in 1-2 mm kleine Stücke für 3-4 min mit feinen scissors. </li><li> Spülen Sie das zerkleinerte Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Suspendieren des Gewebes in 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), die 5 mg Protease / g Gewebe. </li><li> Das Becherglas in einem Eisbad auf den Magnetrührer und unter Rühren für 10 min. </li><li> Verdünne die Suspension in dem Becherglas mit zusätzlichen 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) entfettetes Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Dekantieren alle der Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt und spülen das Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt war (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Resuspendieren des Gewebes in 10 Volumina Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g) mit 0,2% BSA ergänzt mit entfetteter. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator (auf Eis gehalten) mit einem locker sitzende Stößel (10 Schläge). HINWEIS: Homogenize die Gewebe immer in der gleichen Weise (gleiche Anzahl von Schlägen, beispielsweise 10 Hübe). Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Vorzugsweise homogenisieren das Gewebe eines automatisierten Homogenisator. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren. </li><li> Zentrifuge das homogenisierte Gewebe bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x g. HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden in Zentrifugen mit Festwinkelrotoren ausgeführt. </li><li> Überstand verwerfen eine serologische Pipette und das Pellet in BSA-ergänzt eiskaltem Isolationsmedium (10 ml / g Gewebe). </li><li> Zentrifugiere die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 350 x g. </li><li> Reservieren Sie den Überstand eine serologische Pipette und verwerfen das Pellet (Zelltrümmer). </li><li> Filtriere den Überstand in einen Becher (auf Eis gehalten) durch zwei Lagen Gaze (17 Fäden / cm 2) zu entfernen Zelle DEBRist. </li><li> Zentrifuge die filtrierte Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in dem Isolationspuffer (5 ml / g Gewebe), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) BSA und zentrifugiert die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer (Tabelle 1). Zentrifugiere die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer und Zentrifugieren Sie die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in 1,0 ml Waschpuffer. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Mitochondrien-Suspension und halten Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension auf Eis. HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann mit jedem Standard-Methode gemessen werden. </li><li> Grade bevorzu Respirationstest Assays resuspendieren in dem Atmungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 mg / mL mitochondrialen Protein die mitochondriale Suspension. </li></ol> 2. Hochauflösende Respirationstest <ol><li> Pipette 2,1 ml Atmungspuffer (Tabelle 1) 16 in eine hochauflösende Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 h , bis eine stabile Sauerstofffluss Signal der polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird. HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer, um die Sauerstoffkonzentration zu messen und den Sauerstoffverbrauch (Fluss) in jeder Kammer zu berechnen. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt. Darüber hinaus, um genaue und zuverlässige Ergebnisse, instrumental Sauerstoff Hintergrundkorrektur sollte, um sicherzustellen seinnach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. HINWEIS: Genau 2,1 ml Atmungspuffer wird für die Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers 17. HINWEIS: Während der Luftkalibrierung, mit einer Gasphase vorhanden ist, die Medien Sauerstoffkonzentration in der Größenordnung von 15-20 min ins Gleichgewicht wird. Je nach Temperatur, Luftdruck und die Löslichkeit von Medien -Sauerstoff-Konzentration kann berechnet werden. </li><li> die Atmung Medium aus der Oxygraph Kammer Nach Luftkalibrierung, absaugen und 2,1 ml isolierter Mitochondrien-Suspension (0,4 mg / ml mitochondriale Protein) aus Schritt 1.24 zu einer Kammer des Oxygraph hinzuzufügen. HINWEIS: Das Volumen der Atmungspuffer ist abhängig von der Geräteeinstellung und Hersteller. Für hochauflösende Respirometrie, die 2,1 ml der Atmung buffer zur Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens. </li><li> Rühren Sie die mitochondriale Suspension kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer (700 Umdrehungen pro Minute) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung zu Beginn der Studie unter Verwendung von 3-5 min, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss - Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyse 17. </li><li> Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Standardprotokolle verwenden. </li></ol> 3. Komplexe I-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer die isolierte mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren enthält, in den Schritten von 2,1 bis 2,5 undwarten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Oxygraph enthaltenden Kammer getrennt mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung der Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen erhöht mitochondrialen Atmung, bis die Sauerstoffflusssignal, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Das Plateau der Atmung nach ADP hinaus zeigt an, dass ADP-Konzentration hoch und sättigenden war. Je nach der Menge der Mitochondrien während der Atmung verwendet wird, sollte ADP-Konzentration titriert werden,für einen stabilen Zustand 3 Sauerstoffverbrauch (maximale Atmung). Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht (Zustand 3 Atmung) induzieren. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 4. Komplexe II-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem in den Schritten beschriebenen Verfahren 2,1-2,5 und für ein stabiles Signal warten. </li><li> Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Stopfens unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 3-5 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal aufzuzeichnen erreicht. HINWEIS: Rotenon ist ein gefährliches Gift und kann erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. </li><li> Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Oxygraph chBernstein und Rekord mitochondriale Atmung für 3-5 Minuten, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal ansteigt, stabilisiert, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal auslösen wird (Zustand 3 Atmung) erhöhen. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 5. Komplex IV-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM). Unmittelbar danach 2,5 &amp; mgr; l von 0,2 injizierenM TMPD (0,25 mM) und 10 &amp; mgr; l von 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Oxygraph Kammer und Aufzeichnung der Zellatmung, bis das Signal erhöht Sauerstofffluss und stabilisiert (3-5 min). </li><li> injizieren schließlich 10 &amp; mgr; l von 1 M Natriumazid (5 mM) &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert. HINWEIS: Natriumazid ein gefährliches Gift ist und einen erheblichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben kann. </li></ol> 6. Cytochrome C-Test <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Kammer Oxygraph isoliert mitochondriale Suspension mit (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer stopperund notieren Sie die Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung mitochondrialen Atmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). </li><li> Schließlich injizieren 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 &amp; mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li></ol>

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	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll hoher Qualität, intakt und eng gekoppelten Skelettmuskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden, die für funktionelle Studien wie hochauflösenden Respirometrie verwendet werden kann. Um intakt und eng gekoppelten Mitochondrien zu isolieren, gibt es einige kritische Punkte im Rahmen der vorliegenden Protokoll berücksichtigt werden. Nach dem Skelettgewebe Ernte, sollte es sofort in eiskaltem mitochondrialen...

Mitochondriale Bioenergetik und Atemkapazitäten können in permeabilisierten Zellen oder Fasern nicht nur untersucht werden, sondern auch in isolierten Mitochondrien. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll intakten Skelettmuskel Mitochondrien mit differenzieller Zentrifugation für hochauflösende Respirometrie Messungen zu isolieren. Zur Isolierung intakte Mitochondrien für Respirometrie wird das Gewebe homogenisiert und Mitochondrien werden durch ein herkömmliches Verfahren isoliert differentielle Zentrifugation. Die differentielle Zentrifugation Methode basiert auf sequenzielle Zentrifugationen basiert (in einer Reihe von zunehmenden Geschwindigkeit) von Gewebe - Homogenate wurde durch Pallade und Mitarbeiter zuerst eingeführt fast 70 Jahre vor 1. Das Gewebe wird zunächst mit einer Schere zerkleinert und mechanisch in einem Glas-Homogenisator mit einem locker sitzende Stößel homogenisiert. Danach wird das Homogenisat bei niedriger Geschwindigkeit und das resultierende Pellet zentrifugiert, das ununterbrochene Gewebe enthält, zelluläreTrümmer und Kerne wird verworfen. Dann wird der Überstand mehrmals mit hoher Geschwindigkeit und die mitochondriale angereicherte Fraktion wird gesammelt zentrifugiert. Die Vorteile der differentiellen Zentrifugationsverfahren zu isolieren Mitochondrien sind, dass: i) das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb 1-1,5 h (respiratorische Experimenten isoliert werden sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden); ii) es ist preiswert; und iii) es ist sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie Assays. Die Nachteile der differentielle Zentrifugation Methode zur Isolierung Mitochondrien sind, dass i) die Mitochondrien beschädigt werden könnte und abgekoppelt während der Homogenisierung; ii) die Verunreinigung der Mitochondrien mit anderen zellulären Komponenten (könnte die mitochondriale Pellet mit weiteren Zentrifugationsschritte) durch weiteres Waschen gelöst werden; iii) die Möglichkeit , verschiedene mitochondriale Subpopulationen von der Auswahl, zum Beispiel während einer differenziellen Zentrifugationen Schritte, mitochondria mit niedriger Dichte kann 7 ausgeschlossen werden; und iv) die mitochondriale Zell umgebenden fehlt und nur die theoretische maximale Atmung gemessen werden. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung Mitochondrien für Respirometrie Assays ist die Dichtegradientenzentrifugation 2. Bei dieser Technik wird der Gewebeextrakt über eine Lösung von Sucrose oder einem Percoll-Gradienten überlagert (mit höherer Dichte auf dem Boden des Zentrifugenröhrchen) und mit einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, die Mitochondrien verursacht von anderen zellulären Bestandteilen isoliert werden entsprechend ihrer Dichten. Diese Methode wird häufig verwendet, Gehirn Mitochondrien aus Synaptosomen mit sehr geringer Kontamination zu isolieren. Jedoch werden die Rattenleber - Mitochondrien isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit anderen Zellorganellen 3 stark verunreinigt. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens besteht darin, daß die vorliegende Sucrosegradienten in dem Zentrifugationsröhrchen bersten könnte somich Mitochondrien (osmotischer Schock). Je nach der Art des Gewebes; gibt es einige wichtige Faktoren für die Isolierung von intakten Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu betrachten. Die erste Notwendigkeit ist Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weiches Gewebe wie Niere, Gehirn und Leber erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet. Dies steht im Gegensatz zu Hartgewebe wie Herz- und Skelettmuskel, die viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Das zerkleinerte Gewebe wird in der Regel mit Proteinase vor der Homogenisierung behandelt, um das Gewebe zu erweichen. Alle Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugation verwendet werden , sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt sein und haben 4, 5. Einer der Vorteile von isolierten mitochondrialen bioenergetischen studieren ist, dass zelluläre Plasmamembranen brauchen nicht permeabi seinlized mit Detergenzien wie Saponin Digitonin oder 4, 6, die den mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen könnten. Ein weiterer Vorteil der isolierten Mitochondrien ist das Fehlen von anderen cytosolische Faktoren, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Die Nachteile der isolierten Mitochondrien verwenden , sind die mögliche Auswahl bestimmter mitochondrialer Populationen während der Zentrifugationsschritte, Schäden an den Mitochondrien während der Homogenisierung und die Voraussetzung für die hohe Mengen an biologischen Proben , um eine gute Ausbeute an isolierten Mitochondrien 7, 8 zu erhalten. Nach dem Isolierungsverfahren, die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I-, II- und IV-abhängige (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie ermittelt. Für komplexe I-driven Atmung, Glutamatund Malat werden zugegeben, gefolgt von Adenosindiphosphat (ADP), gefolgt. Für komplexe II-driven Atmung wird Succinat zugegeben, gefolgt von ADP gefolgt. Für komplexe IV gesteuerte Atmung, Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) zugegeben , gefolgt von ADP 9, 10, 11, 12. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von Substraten allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. Die Atemkontrolle Verhältnis (RCR) ist ein Index der Kopplung von ATP - Produktion Sauerstoffverbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand 4 13 berechnet, 15. Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll funktionale und intakte Skelett-Muskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und verwenden diese isoliert mitochondria für funktionelle und bioenergetischen Studien wie hochauflösenden Respirometrie.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma,</td><td>G 1626</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>K-lactobionate</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>High-resolution respirometry instrument</td></tr><tr><td>Proteinase, bacterial</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&amp;nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Tissue homogenizer</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemical</td></tr></tbody></table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Komplexe I-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex I abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 1 ist ein repräsentatives Diagramm). Mitochondriale Komplex I Substrate, Glutamat und Malat, werden durch die Zugabe von ADP zugegeben. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate allein....

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Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Aufrufe.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Serie: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Forschung

Biochemie

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medizin

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mitochondriale Isolierung von Nagetieren für qualitativ hochwertige bioenergetische Studien

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Aufdeckung der Rolle von mitochondrialem Calciumphosphat bei Herzinsuffizienz und Bioenergetik

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to investigate metabolic capability. To obtain the measures of mitochondrial respiration, fresh biological samples must be used, and the entire laboratory procedure must be completed within approximately 2 h. Furthermore, multiple pieces of specialized equipment are required to perform these laboratory assays. This creates a challenge for measuring mitochondrial respiration in the tissues of wild animals living far from physiology laboratories as live tissue cannot be preserved for very long after collection in the field. Moreover, transporting live animals over long distances induces stress, which can alter mitochondrial energetics.
This manuscript introduces the Auburn University (AU) MitoMobile, a mobile mitochondrial physiology laboratory that can be taken into the field and used on-site to measure mitochondrial metabolism in tissues collected from wild animals. The basic features of the mobile laboratory and the step-by-step methods for measuring isolated mitochondrial respiration rates are presented. Additionally, the data presented validate the success of outfitting the mobile mitochondrial physiology laboratory and making mitochondrial respiration measurements. The novelty of the mobile laboratory lies in the ability to drive to the field and perform mitochondrial measurements on the tissues of animals captured on site.

We designed and constructed a mobile laboratory to measure respiration rates in isolated mitochondria of wild animals captured at field locations. Here, we describe the design and outfitting of a mobile mitochondrial laboratory and the associated laboratory protocols.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Entwicklung eines mobilen Labors für mitochondriale Physiologie zur Messung der mitochondrialen Energetik im Feld