Mitochondrien sind stark auf das Kerngenom angewiesen, obwohl sie ihre eigene DNA haben. Daher ist ein stark regulierter Importmechanismus erforderlich. Diese Methode hilft, den Prozess zu studieren und wie er sich an äußere Reize anpassen kann.
Dies ist die einzige verfügbare biochemische Technik, um den Proteinimport in die verschiedenen Unterkompartimente der Mitochondrien quantitativ zu bewerten. Die Lebensfähigkeit von Mitochondrien ist an verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt, so dass das Verständnis, wie der Proteinimport reguliert wird, zu neuartigen therapeutischen Ansätzen beitragen kann, die auf Mitochondrien abzielen. Während der Isolierung ist besondere Sorgfalt erforderlich, um die Lebensfähigkeit und Integrität der Mitochondrien zu gewährleisten.
Gründliches Zerkleinern des Gewebes und schonendes Wiederverwenden aller nachfolgenden Pellets ist notwendig. Das Verfahren wird Ashley Oliveira, eine Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Um mit der Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur zu beginnen, entfernen Sie Fett und Bindegewebe aus den Muskeln und zerkleinern Sie das Gewebe auf einem vorgekühlten Uhrglas, bis es sich um eine homogene Aufschlämmung handelt.
Legen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Kunststoffzentrifugationsrohr und notieren Sie das genaue Gewicht. Dann verdünnen Sie das gehackte Gewebe zehnfach mit Puffer 1, der ATP enthält. Verwenden Sie einen Acht-Millimeter-Twin-Blade-Homogenisator, um die Muskelprobe bei einer Leistungsabgabe von 9,8 Hertz für 10 Sekunden zu homogenisieren und sicherzustellen, dass keine sichtbaren Muskelbrocken übrig bleiben.
Nachdem Die Probe bei 9.000x G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius gedreht wurde, wird das Pellet vorsichtig in etwa 95 Mikrolitern des Rückgewinnungsmediums resuspendiert. Zentrifugieren Sie die Probe, bevor Sie den Überstand verwerfen, und resuspen sie das Pellet vorsichtig mit etwa 180 Mikrolitern Resuspensionsmedium unter Verwendung einer P-200-Pipette. Bereiten Sie für die In-vitro-Translation eine ausreichende Translationsreaktionsmischung vor, um 20 Mikroliter pro Mitochondrienprobe für das Importexperiment und für eine Translationsspur bereitzustellen.
Die Reaktion zur Inkubation bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten platzieren. 15 Minuten nach Beginn der Translationsreaktion 90 Mikrogramm Mitochondrien in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen aliquotieren und bei 30 Grad Celsius für 10 Minuten vorinkubieren. Kombinieren Sie in einem frischen Satz steriler 1,5-Milliliter-Röhrchen 75 Mikrogramm Mitochondrien mit 18 Mikrolitern der Translationsreaktion und inkubieren Sie das Röhrchen bei 30 Grad Celsius für die gewünschte Zeit.
Bewahren Sie das restliche Volumen der Translationsreaktion auf Eis auf. Um die Importreaktion nach der entsprechenden Inkubationszeit zu beenden, entfernen Sie das Röhrchen von 30 Grad Celsius, um es auf Eis zu legen, und übertragen Sie dann die Importreaktion vorsichtig mit dem Saccharosekissen auf das Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben mit Saccharosekissen bei 17.000x G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P-1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören. Um in die äußere Membran zu importieren, führen Sie die Reaktion mit Tom40 durch und resuspenieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern frisch zubereitetem 0,1-molarem Natriumcarbonat und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation wird die Probe bei 14.000x G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Bereiten Sie als Nächstes die Proben für die SDS-PAGE-Elektrophorese vor, wie im Manuskript beschrieben. Bereiten Sie die Steuertranslationsspur vor, indem Sie drei Mikroliter der verbleibenden Translationsreaktion mit 37 Mikrolitern Lysepuffer und fünf Mikrolitern Probenfarbstoff mischen. Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius und drehen Sie sie vorsichtig mit niedriger Geschwindigkeit herunter, um zu vermeiden, dass Mitochondrien pelletiert werden.
Nach dem Auftragen der Proben auf SDS-Polyacrylamid-Gel kochen Sie das Gel in 5% Trichloressigsäure oder TCA fünf Minuten lang in einem Abzug unter ständigem Rühren. Dann legen Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser für eine Minute bei 50 Umdrehungen pro Minute auf eine rotierende Platte. Waschen Sie das Gel in 10-Millimolar Tris auf einer rotierenden Platte für fünf Minuten bei 50 Umdrehungen pro Minute.
Um das Protein auszufällen, waschen Sie das Gel in einem ausreichenden Volumen von einmolarer Salicyantsäure, um das Gel 30 Minuten lang auf einer rotierenden Platte zu bedecken. Um das Gel zu dehydrieren, legen Sie ein großes Blatt Löschpapier auf das poröse Bett des Geltrockners und ein Blatt eines Papiertuchs in den Bereich, in dem das Gel aufgetragen wird. Schneiden Sie dann 11 Zentimeter mal 9 Zentimeter Löschpapier und legen Sie das Papier auf das Papiertuch.
Verwenden Sie ein zweites Stück 11 Zentimeter mal 9 Zentimeter Löschpapier, um das Gel aus dem Behälter zu schöpfen und das Gel flach auf das erste Stück zu legen. Legen Sie ein etwas größeres Stück Plastik auf das Gel und stellen Sie sicher, dass es keine Falten oder Blasen unter der Verpackung gibt. Legen Sie dann die Kunststoffabdeckung des Geltrockners über die Oberseite der Verpackung.
Schalten Sie das Vakuum ein. Stellen Sie sicher, dass die Kunststoffabdeckung eine Dichtung gebildet hat, indem Sie die Ecke der Kunststoffabdeckung anheben und warten, bis die Abdeckung wieder verschlossen ist. Schließen Sie den Geltrockner für 90 Minuten, beginnend bei 30 Grad Celsius, um allmählich 80 Grad Celsius zu erreichen, und kehren Sie am Ende des Laufs auf 30 Grad Celsius zurück.
Wickeln Sie das Gel in die Plastikfolie, die im Trocknungsprozess verwendet wird. Nach der Dehydrierung verfestigt sich das Gel und fühlt sich hauchdünn an. Legen Sie das dehydrierte Gel in eine Kassette mit einem Phosphorfilm darauf.
Belichten Sie den Film für 24 Stunden, bevor Sie das Gel mit Autoradiographie mit einem geeigneten Imager visualisieren, der in der Lage ist, Phosphorbildgebung zu erzeugen. Die repräsentative Analyse zeigt die normalen Importraten für Malatdehydrogenase (MDH) in den subsarkolemalen und intermyofibrillaren Mitochondrien und das Translationsprodukt des Vorläufers MDH. Die Zugabe von Valinomycin hemmte den MDH-Proteinimport in die Matrix der SS- und IMF-Mitochondrien.
In ähnlicher Weise hemmte das Detergenzien Triton X den MDH-Import in beide Subfraktionen aufgrund der Solubilisierung der inneren Membran. Die Schätzung des Proteinimports wurde für zunehmende Zeitdauern durchgeführt, und die daraus resultierenden Daten zeigten, dass der Import ein zeitabhängiger Prozess ist und SS- und IWF-Mitochondrien unterschiedliche Raten oder Kapazitäten für den Import haben. Wenn Ratten einer elektrischen Stimulation unterzogen wurden, war der Tom-40-Import in die äußere Membran im Muskel von chronisch stimulierten Tieren im Vergleich zu Kontrollen höher.
Ornithin-Transcarbamylase oder OCT-Import in die mitochondriale Matrix war zu jedem Zeitpunkt der Inkubation erhöht, was zu einem 1,4-fachen Anstieg der Mitochondrien aus chronisch stimulierten Muskeln führte. Der Proteinimport wurde positiv mit einem Index des mitochondrialen Gehalts korreliert und anhand der COX-Aktivität bewertet. Bei der Untersuchung der mitochondrial vermittelten Apoptose zeigten Bax- und Bak-Doppel-Knockout-Tiere einen reduzierten Proteinimport in die mitochondriale Matrix.
Sechs Wochen freiwilliger Radlauf retteten den Importdefekt bei Doppel-Knockout-Tieren. Es ist wichtig, Variablen wie die Dauer der Importreaktion und welches Protein importiert werden soll, zu berücksichtigen. Zytosolische Fraktionen können in die Reaktion eingebaut werden, um zu verstehen, wie zytosolische Faktoren die Importrate beeinflussen können.
Alternativ können Proteine vor der Inkubation modifiziert werden, um zu verstehen, wie Proteine selektiv importiert werden können. Diese Technik kann helfen, die komplexen Ätiologien der mitochondrialen Myopathien zu verstehen, die in verschiedenen Krankheitszuständen auftreten können.
