Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein APART Stipendium der österreichischen Akademie der Wissenschaften (CTH), Projekt der Technologieagentur der Tschechischen Republik keine. TA04010877 (CTH, VH und Richter), und der Tschechische Science Foundation (GACR) Projekt keine GA16-01246S (zum Richter). Wir danken W. Tecumseh Fitch für seinen Vorschlag zur Prothese Fixativ Creme benutzen und Ing. P. Liska von der Tschechischen Armee Forest Service für seine Hilfe bei der Beschaffung der ausgeschnittenen Hirsche Larynges.

Die Tierpräparate in diesem Papier analysiert wurden im Einklang mit den ethischen Standardanforderungen der Palacký-Universität in Olomouc, Tschechische Republik behandelt. Sie stammen von Rotwild Leben wild in den Wäldern, die von der Tschechischen Armee Forest Service während einer regulären Jagdsaison gejagt wurden.
1. Vorbereitung der Hemi-Kehlkopf-Probe
Hinweis: Nur entsprechend vorbereitete Proben sollte verwendet werden, wie in4 angegeben. Schnelles Einfrieren des Kehlkopfes25 sofort nach Exzision und Lagerung bei-80 ° C minimiert das Potenzial der Gewebe Zerstörung und Veränderung der biomechanischen Eigenschaften und ermöglicht die Durchführung der Experimente zu jeder beliebigen Zeit.
<ol><li>
Auftauen des Kehlkopfes
	<ol>
<li>Stecken Sie den gefrorenen Kehlkopf in zwei Autoklaven Taschen oder andere PP-Beutel mit wasserdichten Abdichtung. Die Taschen zu versiegeln und steckte sie in ein Wasserbad bis 30 ° C erhitzt, bis der Kehlkopf vollständig abgetaut ist. Die Dauer reicht von ein paar Stunden mehr als einen Tag, je nach Größe des Kehlkopfes und Gefriertemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigung des Kehlkopfes
	<ol>
<li>Nach der Kehlkopf aufgetaut ist, entfernen Sie es aus der Tasche und reinigen Sie es gründlich mit Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).</li>
		<li>Sorgfältig entfernen Überflüssiges Gewebe soweit anwendbar (d. h. externen Nackenmuskulatur, Zungenbeins etc.) ohne die Kehlkopf Hauptstrukturen zu beschädigen, und kürzen Sie die Luftröhre bis zu einer Länge ausreichend für die Montage des Kehlkopfes auf einem Luft-Zuleitung (in der Regel ca. 4-5 cm).</li>
		<li>Überprüfen Sie das Kehlkopf Gewebe für mögliche Anomalien, Gewebe, wie Wunden, organische Verformungen oder Risse, die möglicherweise aus den Gefrierprozess, der den Kehlkopf ungeeignet für das Experiment machen könnten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exposition der Schilddrüse und Ringknorpel Knorpel
	<ol>
<li>Entfernen Sie Teile des externen Kehlkopf Muskelgewebes rund um die Schilddrüse und Ringknorpel Knorpel mit einem Skalpell, so setzen die Knorpel in der Vorbereitung für die Mitte-sagittalen Schnitt erstellen die Hemi-Kehlkopf. Diese Vorbereitungsphase ist in Abbildung 1A und 1 bdargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitte-sagittalen Schnitt durch die Schilddrüse Knorpel
	<ol>
<li>Machen Sie einen ersten vertikalen Schnitt durch den vorderen Teil der Schilddrüse Knorpel.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig den Schnitt etwas mehr auf die Seite, die entfernt werden, damit nicht der Stimmlippe beschädigt, der erhalten bleiben soll. Verwenden Sie nach Möglichkeit ein Skalpell zum Schneiden. Wenn der Knorpel erstarrt ist, verwenden Sie eine kleine Säge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schneiden des Ringknorpel Knorpels
	<ol>
<li>Führen Sie den Schnitt senkrecht (inferior) aus zwischen die Arytenoid Knorpel und dann durch den Ringknorpel Knorpel auf eine etwa horizontalen Ebene der minderwertigen Schilddrüse Kerbe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung von einer Stimmlippe, erstellen einen L-förmigen Schnitt im Kehlkopf
	<ol>
<li>Stellen Sie einen horizontalen Schnitt schlechter als Ende des zuvor erstellten vertikalen Schnitt in der Ringknorpel Knorpel ab und führen den neuen Schnitt in Richtung der minderwertigen Schilddrüse Kerbe. Vorangegangene Falten Sie die Seite des Kehlkopfes, die entfernt werden soll.</li>
		<li>Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch das weiche Gewebe an der Innenseite der Schilddrüse Knorpel - seien Sie vorsichtig beim Schnitt zwischen der vorderen Befestigung der Stimmlippen zu der Schilddrüse Knorpel, wodurch Schäden an der Stimmlippe führt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verfeinerung des Schnittes durch die Schilddrüse Knorpel
	<ol>
<li>Verwenden Sie ein Skalpell, eine Säge oder eine Datei, um eine gerade geraden Schnitt in der Schilddrüse Knorpel gelten, und wie nah wie möglich an den vorderen Teil der bisher geprüften Stimmlippe.</li>
		<li>Auch einen kleinen Teil der hinteren Schilddrüse Knorpel entfernen, um Platz für das Einfügen der Zinke für adducting die Arytenoid schaffen Knorpel und damit die Vocal Falten (siehe unten). Diese Vorbereitungsphase ist in Abbildung 1 und 1 Ddargestellt. Hinweis: Abhängig von der Fragestellung kann volle Exposition des ganzen Stimmlippe benötigt, um seine Sichtbarkeit von oben zu aktivieren. In einem solchen Fall sollte der Strukturen über die (wahre) Stimmlippe (d. h. die ventrikuläre oder vestibuläre Falte, soweit anwendbar, da die Anatomie der Probe) entfernt werden. In einigen Exemplaren die inneren Weichteile Kehlkopf oberhalb der Stimmlippen verliert seine Verbindung mit der Schilddrüse Knorpel und stört die Stimmlippe während Vibrationen verursachen unechte (meist unregelmäßig) oszillierenden Muster. In einem solchen Fall ist die sorgfältige Entfernung des Gewebes unvermeidlich.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig1.jpg"> Abbildung 1 : Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung und Montage. (A) und (B) gereinigt Kehlkopf Exemplar, medialen und hinteren Ansicht bis zur Entfernung der linken Stimmlippe; (C) und (D) vorbereiteten Hemi-Kehlkopf mit L-förmigen Schnitt (links Stimmlippe entfernt), medialen und hinteren Ansicht. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55303/55303fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

(2) Hemi-Kehlkopf-Experiment
<ol><li>
Hemi-Larynx-setup
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine Luftzufuhr Rohr erwärmt und befeuchtete Luft in den Kehlkopf liefert.</li>
		<li>Konstrukt zwei senkrecht angeordneten transparente Platten als Ersatz für die entfernten Kehlkopf Teile.</li>
		<li>Verwendung Dreizack 4 zur Erhöhung der Stabilität des Kehlkopfes und die Schaffung einer richtigen pre-phonatory Kehlkopf-Konfiguration durch adducting der verbleibenden Stimmlippe, die vertikale Glasplatte (siehe Abb. 2A). Hinweis: Theoretisch könnte die Stimmlippen auch durch Nähte und Gewichte auf eine Riemenscheibe-Hebel System 26 adduziert werden. Allerdings wurde, ein solches Vorgehen nach bestem Wissen von diesen Autoren, noch nicht für eine Hemilarynx Zubereitung versucht.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig2.jpg">
Abbildung 2 : Hemi-Kehlkopf Setup. (A) Tragkonstruktionen: Luft-Zuleitung, L-förmigen Glas Platte Anordnung, Adduktion Zinken. (B) Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung mit Adduktion Zinken montiert. (C) und (D) Nahaufnahmen von Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung, gesehen von der Seite und von oben, beziehungsweise. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55303/55303fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>
Montage der Hemi-Kehlkopf
	<ol>
<li>Decken Sie der Luft-Zuleitung mit Haftpuder Creme ab und montieren Sie den Kehlkopf, mit der restliche Teil der Luftröhre. Die Fixativ Creme arbeitet als Klebstoff und schließt mögliche Lücken, wodurch eine luftdichte Abdichtung.</li>
		<li>Befestigen Sie die Luftröhre mit einem Kunststoff-Armband oder eine Schlauchschelle festziehen.</li>
		<li>Auch die Kanten des Schnittes durch die Schilddrüse Knorpel mit Sahne, unter Vermeidung der Verbreitung Fixativ Creme auf die Stimmlippe oder die inneren Weichteile Kehlkopf Fixativ zu decken.</li>
		<li>Befestigen Sie die transparente Platten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stabilisierung der Schilddrüse Knorpel, Adduktion der Stimmlippe mit Zinken
	<ol>
<li>Verwenden Sie die Zacken Addukt Stimmlippe bis auf den Teller und stabilisieren die Schilddrüse Knorpel.</li>
		<li>Nachdem die Fixativ Creme festgelegt hat, gelten Sie den Luftstrom um Stimmlippe Oszillation und Überprüfung auf eventuelle Undichtigkeiten zwischen den Hemi-Kehlkopf und die Glasplatten zu etablieren.</li>
		<li>Eventuell auftretende Lücken durch Zugabe von mehr Fixativ Creme zu versiegeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung teilt die Vorteile der "konventionellen" (voll) ausgeschnittenen Kehlkopf Setup: In solch einen experimentellen Ansatz, physikalischen und physiologischen Randbedingungen und Parameter (z. B. subglottal Druck oder Dehnung der Stimmlippe) können sein ziemlich gut kontrolliert. Das Verhalten des Hemilarynx ist homolog zu, die eine vollständige Kehlkopf mit einem perfekten seitliche Symmetrie, mit der Ausnahme, dass Größen einiger Parameter (zB., Luftdurchsatz, Schalldruck) sind u...

Stimme entsteht in der Regel durch Vibrieren Kehlkopf Gewebe (vor allem die Stimmlippen), die einen stetigen Luftstrom, geliefert von der Lunge in eine Sequenz von Luftstrom Impulse umwandelt. Der Schalldruck-Wellenform (d. h., die primären Ton) entstehende diese Abfolge von Flow Pulse akustisch Vokaltrakts, sie filtert, erregt, und der daraus resultierende Klang strahlt aus dem Mund und (zu einem gewissen Grad) von der Nase1 . Die spektrale Zusammensetzung des erzeugten Klangs wird weitgehend von der Qualität der Stimmlippe Vibration, Kehlkopf Biomechanik und Interaktionen mit den trachealen Airflow2geregelt beeinflusst. Sowohl in einer klinischen und einer Forschungskontext ist Dokumentation und Bewertung der Stimmlippe Vibration daher von vor allem Interesse bei der Sprachproduktion zu studieren.
Beim Menschen direkte Endoskopische Untersuchung des Kehlkopfes beim Klangerzeugung in Vivo ist anspruchsvoll, und es ist praktisch unmöglich, in nicht-menschlichen Säugetieren, aktuelle technologische Mittel gegeben. Deshalb, und um Garantie sorgfältig kontrolliert körperliche und/oder physiologischen experimentellen Randbedingungen, die Nutzung der ausgeschnittenen Larynges3,4 ist in vielen Fällen eine angemessene Vertretung für die Untersuchung von in-vivo Produktion Mechanismen zu äußern.
Stimmlippe Vibration ist ein komplexes dreidimensionales Phänomen5. Während herkömmliche Untersuchungsmethoden wie bieten Kehlkopf Endoskopie (in Vivo) oder ausgeschnittenen Kehlkopf Zubereitungen in der Regel nur eine überlegene Ansicht der schwingenden Stimmlippen6, sie erlauben nicht die vollständige dreidimensionale Analyse der Stimmlippe Bewegung. Insbesondere sind die untere (kaudalen) Ränder der Stimmlippen in die überragende Aussicht während eines großen Teils des Kreislaufs Vibrations unsichtbar. Dies ist aufgrund der Phasenverschiebung zwischen die untere (kaudalen) und superior (cranial) Rand der Stimmlippen, ein Phänomen, das in der Regel während der Stimmlippe Oszillation5gesehen wird. Als direkte empirische Evidenz für die Sicherung der Ergebnisse von mathematischen und physikalischen Modellen knapp ist, wissen über die Geometrie und die Bewegung des unteren Vocal Falten Rand7, und damit die Geometrie des subglottal Kanal8,9 , 10 ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Interaktion zwischen Kehlkopf Luftstrom, Stimmlippe Gewebe und die daraus resultierenden Kräfte und drücke11,-12. Stimmlippe Schwingung, die die üblichen überlegene verborgen ist ein weiterer Aspekt ist die vertikale (Caudo-cranial) Tiefe des Kontakts zwischen den beiden Stimmlippen. Die vertikale Kontakt Tiefe bezieht sich auf die vertikale Dicke der Stimmlippen, ist ein möglicher Indikator für die Stimmlage singen ("Brust" vs. "Fistelstimme" Register)13,14verwendet.
Um die Unzulänglichkeiten der konventionellen (voll) ausgeschnittenen Kehlkopf Vorbereitungen zu überwinden, kann eine sogenannte Hemi-Kehlkopf-Setup verwendet werden, wo die Hälfte des Kehlkopfes wird entfernt, und erleichtert so die Beurteilung der Vibrations Merkmale der verbleibenden Stimmlippe in drei Dimensionen. Überraschenderweise haben seit der Einführung dieser Einrichtung in den 1960er Jahren15 und eine Erstvalidierung des Konzepts in 199316, nicht viele Labors Experimente mit diesem vielversprechenden Versuchsansatz17,18 durchgeführt ,19,20,21,22,23. Eine Erklärung dafür könnte in die Schwierigkeiten bei der Schaffung einer lebensfähigen Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung gefunden werden. Während die konventionellen ausgeschnittenen (voll) Kehlkopf Vorbereitung gut dokumentierte4ist, sind noch keine solche ausführliche Anleitung zum Erstellen einer Hemi-Kehlkopf-Setup zur Verfügung. Es ist daher das Ziel dieses Papiers, eine Tutorial für die Einrichtung einer zuverlässig reproduzierbare Hemi-Kehlkopf-Setup, ergänzt durch experimentelle Ergebnisse aus Rothirsch Exemplare bereitzustellen.
Eine Hemi-Kehlkopf-Setup teilt viele Eigenschaften mit einem "konventionellen" ausgeschnittenen Kehlkopf Setup, wie Messgeräte, High-Speed- oder anderen imaging-Technologie, angemessen dokumentieren die Schwingungen der Kehlkopf Strukturen während der Klangerzeugung, oder richtige Lieferung von beheizten, befeuchtete Luft. Diese allgemeine Setup-Überlegungen sind in ein Buch Kapitel4 und ein technischer Bericht aus dem nationalen Zentrum für Gesang und Sprache24detailliert beschrieben. Wiederholung dieser Anleitung wäre würde den Rahmen sprengen diese Handschrift. Hier werden nur die speziellen Richtlinien zur Erzeugung einer Hemi-Kehlkopf-Setup präsentiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Surgical blades</td>
			<td >Surgeon</td>
			<td >Jai Surgical Ltd., New Delhi, India</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saw</td>
			<td >Hand saw (Lux, 150 mm length)</td>
			<td >Lux, Wermelskirchen, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Testo 922</td>
			<td >Testo Ltd., Hampshire, UK</td>
			<td >K-type Probe, Operating temperature -20 to +50 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >vwr.com, VWR International s.r.o., Stribrna Skalice, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive glass plates</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixative cream</td>
			<td >Denture fixative cream</td>
			<td >Blend-a-dent Natural</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prongs and fastening system</td>
			<td >Customized Kanya Al eloxed profiles</td>
			<td >Distributor: VISIMPEX a.s.. Seifertova 33, 750 02 Prerov, the Czech Rep.;</td>
			<td >&#160;Combination of Kanya RVS and PVS fastening systems (http://www.kanya.cz/) + custom made prongs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting tube</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics, 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED Light</td>
			<td >Verbatim 52204 LED Lamp</td>
			<td >Mitsubishi Chemical Holdings Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Camera</td>
			<td >Canon EOS1100D</td>
			<td >Canon Inc.</td>
			<td >18-55 mm lens</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Airpump</td>
			<td >Resun LP100</td>
			<td >Resun</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Strobe light</td>
			<td >ELMED Helio-Strob micro2</td>
			<td >ELMED Dr. Ing. Mense GmbH, Heiligenhaus, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Humidifier</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Subglottic tract</td>
			<td >Custom made adjustable subglottic tract</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td >Hampala, V., Svec, Jan, Schovanek, P., and Mandat, D. Uzitny vzor c. 25585: Model subglotickeho traktu. [Utility model no. 25585: Model of subglottal tract] (In Czech) Soukup, P. 2013-27834(CZ 25505 U1), 1-7. 24-6-2013. Praha, Urad prumysloveho vlastnictvi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemi-laryngeal setup for studying vocal fold vibration in three dimensions

Die Stimme der Menschen und die meisten nicht-menschlichen Säugetieren wird im Kehlkopf durch autarke Schwingung der Stimmlippen erzeugt. Direkte visuelle Dokumentation der Stimmlippe Schwingung ist anspruchsvoll, vor allem bei nicht-menschlichen Säugetieren. Als Alternative bieten ausgeschnittenen Kehlkopf Experimente die Möglichkeit, Stimmlippe Vibration unter kontrollierten physiologischen und physikalischen Bedingungen zu untersuchen. Die Verwendung von einem vollen Kehlkopf bietet jedoch nur eine Draufsicht der Stimmlippen, wesentliche Teile der oszillierenden Strukturen von Beobachtung während ihrer Interaktion mit aerodynamischen Kräfte auszuschließen. Diese Einschränkung überwunden werden durch die Nutzung einer Hemi-Kehlkopf-Setup, wo die Hälfte des Kehlkopfes ist Mitte-sagittal entfernt, bietet eine überlegene und einen seitlichen Blick auf die restlichen Stimmlippe während selbsttragenden Schwingung.
Hier ist eine Anleitung für die anatomische Vorbereitung der Hemi-Larynx Strukturen und ihre Montage auf dem Labortisch gegeben. Beispielhafte Stimmbildung der Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung ist mit High-Speed-video von zwei synchronisierten Kameras (superior und seitliche Ansichten), zeigt dreidimensionale Stimmlippe Bewegung und entsprechende zeitabhängige Kontaktfläche erfassten Daten dokumentiert. Die Dokumentation des Hemi-Kehlkopf-Setups in dieser Publikation erleichtert die Anwendung und zuverlässige Reproduzierbarkeit in der experimentellen Forschung, Bereitstellung von Stimme Wissenschaftler mit dem Potenzial zum besseren Verständnis der Biomechanik der Sprachproduktion.

In Abbildung 1 und Abbildung 2, angeboten bzw. Abbildungen der Hemi-Kehlkopf-Vorbereitung und seine Befestigung an der Zuleitung der Luft, wie im vorherigen Abschnitt verwiesen.
Dokumentation der Stimmlippe Vibration aus zwei Kameraperspektiven
Luftstrom-induzierte autarke Schwingung der Stimm...

Watch this Scientific Journal Video about Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions at JoVE.com

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Vorbereitung der Hemi-Kehlkopf Proben erleichtern eine Multi-dimensionale Ansicht der Stimmlippe Vibration, um verschiedene biophysikalische Aspekte der Sprachproduktion in Menschen und nicht-menschlichen Säugetieren zu untersuchen.

Hemi-Larynx-Setup für das Studium Stimmlippe Vibration in drei Dimensionen

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

hemi-laryngeal-setup-for-studying-vocal-fold-vibration-three

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  Palacky University Olomouc. Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Vorbereitung der Hemi-Kehlkopf Proben erleichtern eine Multi-dimensionale Ansicht der Stimmlippe Vibration, um verschiedene biophysikalische Aspekte der Sprachproduktion in Menschen und nicht-menschlichen Säugetieren zu untersuchen.

Serie: Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Forschung

Biologie

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Vierfach-Schachbrett: Eine Modifikation des dreidimensionalen Schachbretts zur Untersuchung von Arzneimittelkombinationen

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display intelligent behaviors. In both natural and artificial systems, learning is the adaptive updating of system parameters based on new information, and intelligence is a measure of the computational process that facilitates learning. Stentor coeruleus is a unicellular pond-dwelling organism that exhibits habituation, a form of learning in which a behavioral response decreases following a repeated stimulus. Stentor contracts in response to mechanical stimulation, which is an apparent escape response from aquatic predators. However, repeated low-force perturbations induce habituation, demonstrated by a progressive reduction in contraction probability. Here, we introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency, including methods for building the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations. In contrast to the previously described approaches for mechanically stimulating Stentor, this device allows the force of stimulation to be varied under computer control during the course of a single experiment, thus greatly increasing the variety of input sequences that can be applied. Understanding habituation at the level of a single cell will help characterize learning paradigms that are independent of complex circuitry.

Studying Habituation in Stentor coeruleus

We introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency. We also include methods for assembling the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations.

Untersuchung der Gewöhnung bei Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...