Diese Forschung wurde durch die Zuschüsse F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) und K23DC014517 (Johnson, PI) des National Institute on Deafness and other Communication Disorders der National Institutes of Health unterstützt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der New York University School of Medicine durchgeführt.
1. Zerlegen Sie den Kehlkopf der Ratte
<ol><li>Euthanasierung der Ratte gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. Rasieren Sie den ventralen Hals vom Unterkiefer bis zum Manubrium und tupfen Sie ihn mit Alkohol ab, um eine Fellkontamination in den Gewebeproben zu verhindern.</li>
	<li>Unter einem Sezierfernrohr mit 10-facher Vergrößerung wird der gesamte Kehlkopf ausgeschnitten, indem mit einem Skalpell ein Mittellinien-Halsschnitt erstellt wird, bis die Luftröhre freigelegt wird.</li>
	<li>Trennen Sie die ventralen extrinsischen Kehlkopfmuskeln an der Mittellinie, um den Kehlkopf mit einer Pinzette und einer Schere oder einem Skalpell freizulegen.</li>
	<li>Trennen Sie die Luftröhre kaudal zum dritten Trachealring und machen Sie einen Rostralschnitt zum Zungenbein, um den gesamten Kehlkopf mit einer Sezierschere zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie das extrinsische Kehlkopfgewebe (Speiseröhre, Schilddrüse und extrinsische Kehlkopfmuskeln) mit Mikrodesektionswerkzeugen (Pinzette, Stifte und Mikroscheren) unter Vergrößerung aus dem Kehlkopf.</li>
	<li>Mit Mikroscheren den Kehlkopf dorsal zwischen den Arytenoiden halbieren, wobei die Mittellinie zwischen den hinteren Cricoarytenoidmuskeln als Orientierungspunkt verwendet wird. Pin seitenwände des Kehlkopfes, um die Stimmlippen freizulegen, und halbieren Sie dann ventral durch die Mittellinie des Schilddrüsenknorpels zwischen der vorderen Kommissur der Stimmlippen mit Mikroscheren (Abbildung 1). HINWEIS: Dieser Schritt kann optional sein. es kann übersprungen werden, um den Kehlkopf ganz zu halten. Die Bisektion von Kehlköpfen ermöglicht mehrere Immunfärbungstechniken, indem die rechte und linke Seite desselben Kehlkopfes getrennt verwendet wird.</li>
	<li>Spülen Sie jeden Hemi-Larynx in phosphatgepufferter Lösung (PBS) für ~ 10 s und trocknen Sie ihn vorsichtig mit einem Task-Wischer, um die Eiskristallbildung während des Einfrierens zu reduzieren.</li>
</ol>2. Larynxgewebe fixieren und/oder schockgefrieren
HINWEIS: Die Fixierung ist möglicherweise nicht für alle Immunfärbungsprotokolle ideal. Oft werden Kehlkopfgewebe unmittelbar nach der Dissektion frisch schockgefroren. Überspringen Sie Schritt 2.1, um Kehlkopfgewebe ohne Fixierung einzufrieren.
<ol><li>Zur Fixierung von Hemi-Laryngen legen Sie Gewebe in ein mit 4% Formaldehyd gefülltes Zentrifugenröhrchen in PBS für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 70 U / min. Gewebe in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und 3x für 20 min in PBS abspülen. Dann in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und bei 4 °C in eine 20% ige Saccharose/5%ige Glycerinlösung (~18 h oder bis das Gewebe sinkt) tauchen. VORSICHT: Formaldehyd ist gefährlich und sollte zusammen mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung in einem Abzug verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie alle Hemi-Laryngen in eine gleichmäßige Position in eine Kryoform, die mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) gefüllt ist. Für einen Hemilarynx platzieren Sie das Gewebe mit der medialen Oberfläche der Stimmlippe, die der Unterseite der Kryomold zugewandt ist, und dem Längsaspekt der Stimmlippe parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung. Für ganze Laryngen platzieren Sie das Gewebe mit den hinteren Cricoarytenoiden, die der Unterseite der Kryomold und dem Längsaspekt der Stimmlippe zugewandt sind, parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung. HINWEIS: Eine konsistente Kehlkopforientierung innerhalb der OCT-Verbindung ist entscheidend für die Kryosektion der Stimmlippe der Ratte. Sobald der Hemilarynx eingebettet und eingefroren ist, muss er aufgetaut werden, um seine Orientierung zu ändern, wodurch das Risiko von Gewebeschäden durch mehrere Tau-Gefrier-Zyklen entsteht.</li>
	<li>Schockfrostgewebe mit Isopentan (2-Methylbutan), gekühlt in einem Stahlbecherglas, umgeben von flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Das Isopentan erreicht eine optimale Temperatur für das Einfrieren des Gewebes, wenn sich weiße Ausscheidungen an den Seiten und am Boden des Becherglases bilden13. Isopentan wird verwendet, weil es eine höhere Wärmeleitfähigkeit als flüssiger Stickstoff aufweist, was ein Reißen des Gewebeblocks beim schnellen Einfrieren verhindert. Für eine detailliertere Beschreibung des Einfrierens von Gewebe bei OTC siehe Kumar et al.13.</li>
	<li>Wickeln Sie jede Form in voretikettierte Folie und legen Sie sie in einen einzelnen Gefrierbeutel, um Austrocknung zu verhindern, und lagern Sie sie sofort auf Trockeneis, bis sie zur Lagerung in einem -80 ° C-Gefrierschrank überführt werden.</li>
</ol>3. Kryosektions-Hemilarynx in der Querschnittsebene
<ol><li>Stellen Sie die Kammertemperatur im Kryostaten auf -20 °C ein, was in der Mitte des Temperaturbereichs (15−25 °C) liegt, der im Handbuch des Herstellers für die Muskelgewebeschnitte empfohlen wird.</li>
	<li>Stellen Sie die Dicke des Kryostatenabschnitts auf 10 μm dicke Abschnitte ein. HINWEIS: Für die Muskelfaserquerschnittsanalyse sind 10 μm dicke Abschnitte optimal, um eine vollständige Färbung und eine robuste Bildgebungsintensität der markierten Muskelfasern für die Fasertypisierungsanalyse zu ermöglichen14,15,16. Einige Protokolle können je nach neuromuskulären Zielen eine unterschiedliche Abschnittsdicke erfordern.</li>
	<li>Übertragen Sie Gewebe in die Kryostatenkammer, fügen Sie eine gleichmäßige Schicht OCT-Verbindung auf die Kryostatprobenscheibe (Chuck) hinzu und legen Sie den eingebetteten Gewebeblock auf die OCT-Verbindung auf die Probenscheibe. Um Querschnitte der Stimmlippe für die Thyroarytenoid (TA) Muskelfaseranalyse zu erhalten, befestigen Sie die Probe am Chuck, so dass der ventrale Schilddrüsenknorpel der Kryostatenklinge und der Arytenoidknorpel der Probenscheibe zugewandt ist. HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Landmarken zu diesem Zeitpunkt nicht sichtbar sind, da die OCT-Verbindung beim Einfrieren weiß und undurchsichtig wird. Dieser Mangel an Sichtbarkeit ist der Grund, warum es wichtig ist, die Ausrichtung des Hemilarynx während des Schockfroststadiums zu beachten.</li>
	<li>Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der ventrale Teil des Schilddrüsenknorpels erscheint.</li>
	<li>Dann trimmen und verfolgen Sie 30 μm Abschnitte vom Beginn des Schilddrüsenknorpels bis die Lamina propria, die medialen TA-Muskeln und der laterale TA-Muskel freigelegt sind. HINWEIS: Kehlkopfmarkierungen sollten vom Beginn des Schilddrüsenknorpels alle 100 μm verfolgt und notiert werden, um sicherzustellen, dass der Schnittwinkel nicht schräg ist. Abbildung 2 zeigt die beiden Sätze von Kehlkopf-Landmarken in der Querschnittsebene bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 10 μm.</li>
	<li>Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind. HINWEIS: Festes Gewebe kann je nach IHC-Ziel bis zu einer Woche in PBS gelagert werden, während nicht fixiertes Gewebe sofort verarbeitet werden sollte.</li>
</ol>4. Kryosektions-Hemilarynx in Längsebene
<ol><li>Wenn die Kryostatenkammer wieder auf -20 °C eingestellt ist, ändern Sie die Querschnittsdicke auf 30 μm. HINWEIS: Für die NMJ-Analyse kann eine Gewebedicke zwischen 30−60 μm verwendet werden, um mehrere vollständige NMJs innerhalb der Kehlkopfmuskulatur ohne Fragmentierung der Nervenend- oder motorischen Endplatte zu erfassen11,12,17.</li>
	<li>Um longitudinale Stimmlippenschnitte für die NMJ-Analyse des TA-Muskels zu erhalten, befestigen Sie die Proben am Chuck, so dass die Epiglottis auf die Kryostatenklinge ausgerichtet ist und das Tracheallumen nach unten zur Probenscheibe zeigt.</li>
	<li>Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der Schilddrüsenknorpel erscheint.</li>
	<li>Trimm- und Spurabschnitte von 30 μm vom Einsetzen der Schilddrüse bis zur Lamina propria sowie mediale und laterale Unterteilungen des TA-Muskels werden freigelegt. HINWEIS: Fünf Sätze von Kehlkopfmarkierungen in der Längsebene werden empfohlen, um die Progression der Gewebetiefe in Richtung des Ziel-TA-Muskels zu verfolgen. Abbildung 3 zeigt die Kehlkopfmarkerpunkte in der Längsebene bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 30 μm.</li>
	<li>Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Vorbereitung der Stimmlippen von Ratten für die neuromuskuläre Analyse kann verschiedene Herausforderungen mit sich bringen. Die Kehlkopfmuskulatur ist nicht nur klein und von Knorpel umgeben, was es schwierig macht, den Zielmuskel direkt zu extrahieren, sondern es wurde auch eine hohe Variabilität zwischen Tieren in der Tiefe der anatomischen Kehlkopfmarkierungen festgestellt. Für das Protokoll der Querschnittsebene des Muskels traten vollständige Stimmlippenabschnitte zwischen 21-85 Abschnitten (10 μm pro Abs...

Der Kehlkopf der Ratte ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung struktureller und funktioneller neuromuskulärer Kehlkopfanpassungen an Entwicklung, Alterung, Krankheit und pharmakologische Wirkstoffe1,2,3,4,5. Die Konsistenz histologischer Methoden ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da bei der Muskelvorbereitung und -analyse mehrere Feinheiten beteiligt sind, sowie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Größe, Form und Topographie der in den Kehlkopfknorpeln eingekapselten Muskeln1,6,7,8,9,10,11 . Aufgrund der geringen Größe der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur der Ratte sind systematisches Einbetten, Einfrieren und Kryosektion entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Wenn beispielsweise die Stimmlippe der Ratte in der koronalen Ebene geschnitten wird, befinden sich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) von vier der intrinsischen Kehlkopfmuskeln innerhalb von weniger als 1,8 mm Gewebetiefe11. Daher ist eine präzise Überwachung der Anatomie der Kehlkopfmuskulatur während der Kryosektion unerlässlich, um die interessierenden Abschnitte genau zu identifizieren und eine Übersektion des Gewebes zu verhindern. Eine Übersektion des Zielmuskels kann zu einer ungenauen Identifizierung der Anzahl und Topographie von NMJs11 oder zu einer Gesamtverringerung der Stichprobengröße führen, wenn der Zielmuskel aufgrund von Orientierungsverwechslungen verworfen wird12. Da neuartige Modelle für die Untersuchung des Kehlkopfmuskels und ihrer jeweiligen Anpassungen entwickelt werden, sind Standardarbeitsanweisungen unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse in allen Studien präzise, zuverlässig und reproduzierbar sind.
Ziel dieses Artikels ist es, die Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für eine optimale Längs- und Querschnittsanalyse detailliert zu beschreiben. Detaillierte Methoden, die regelmäßig in unserem Labor angewendet werden, werden beschrieben, um Zielmuskelmarker während der Kryosektion zu identifizieren. Obwohl ähnliche Methoden in mehreren Labors verwendet werden, werden hier mehr Details als in der Literatur bereitgestellt, um eine zuverlässige und genaue Replikation zu gewährleisten, wenn sie von unerfahrenen Forschern implementiert wird. Ziel dieses Tutorials ist es, eine Standardmethodik für die immunhistochemische (IHC) Bewertung der Rattengespinstfalte bereitzustellen, um die Konsistenz zwischen Labors und Untersuchungen zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Der Zweck dieses Tutorials ist es, die Vorbereitung der Rattengespinstfalte für histochemische neuromuskuläre Studien zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Larynxdissektion von Ratten, das Schockgefrieren und die Kryosektion der Stimmlippen. Diese Studie beschreibt, wie man Stimmlippen sowohl in Längs- als auch in Querschnittsebene kryosektioniert. Eine Neuheit dieses Protokolls ist die Kehlkopfverfolgung während der Kryosektion, die eine genaue Identifizierung der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit eines Gewebeverlusts verringert. Die Abbildungen zeigen die fortschreitende Kryosektion in beiden Ebenen. Neunundzwanzig Ratten-Hemi-Laryngen wurden kryosektiert und vom Aufkommen des Schilddrüsenknorpels bis zum Erscheinen des ersten Abschnitts verfolgt, der die volle Stimmlippe enthielt. Die volle Stimmlippe wurde für alle Tiere in beiden Ebenen visualisiert. Es gab eine hohe Variabilität im Abstand vom Auftreten des Schilddrüsenknorpels bis zum Auftreten der vollen Stimmlippe in beiden Ebenen. Das Gewicht korrelierte nicht mit der Tiefe der Kehlkopfmarkierungen, was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität und andere Faktoren im Zusammenhang mit der Gewebepräparation für die hohe Variabilität des Auftretens von Landmarken während des Schneidens verantwortlich sein könnten. Diese Studie beschreibt eine Methodik und präsentiert morphologische Daten zur Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für histochemische neuromuskuläre Untersuchungen. Aufgrund der hohen individuellen Variabilität sollten Kehlkopfmarkierungen während der Kryosektion genau verfolgt werden, um eine Übersektion von Gewebe und Gewebeverlust zu verhindern. Die Verwendung einer konsistenten Methodik, einschließlich einer angemessenen Gewebevorbereitung und des Bewusstseins für Landmarken im Kehlkopf der Ratte, wird zu konsistenten Ergebnissen in allen Studien beitragen und neuen Forschern helfen, die daran interessiert sind, die Stimmlippe der Ratte als Modell zur Untersuchung der neuromuskulären Kehlkopfmechanismen zu verwenden.

Die repräsentativen Ergebnisse waren Teil einer laufenden Untersuchung der Auswirkungen von Stimmübungen auf das kehlkopfe neuromuskuläre System. Neunundzwanzig männliche Fischer 344/braune Wanderratten (12 9 Monate alt, 17 24 Monate alt) wurden gewogen und mit CO2-Inhalation gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie eingeschläfert.
Die Verfahren folgten dem skizzierten Protokoll zur Kennzeichnung von NMJs und Fasergröße der lateralen und medialen TA-Muskeln. Der Abstand zwi...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K Aufrufe.  New York University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Serie: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of EEG data and have been widely used to investigate the neural mechanisms in some brain disorders. The goal of this article is to describe the protocol underlying EEG microstate and omega complexity analyses step by step. The main advantage of these two measures is that they could eliminate the reference-dependent problem inherent to traditional spectrum analysis. In addition, microstate analysis makes good use of high time resolution of resting-state EEG, and the four obtained microstate classes could match the corresponding resting-state networks respectively. The omega complexity characterizes the spatial complexity of the whole brain or specific brain regions, which has obvious advantage compared with traditional complexity measures focusing on the signal complexity in a single channel. These two EEG measures could complement each other to investigate the brain complexity from the temporal and spatial domain respectively.

This article describes the protocol underlying electroencephalography (EEG) microstate analysis and omega complexity analysis, which are two reference-free EEG measures and highly valuable to explore the neural mechanisms of brain disorders.

Microstate und Omega Komplexität Analysen der ruhenden Zustand Elektroenzephalographie

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ex vivo preparation of the levator auris longus (LAL) is used because it is a thin muscle that provides easy visualization of the neuromuscular junction for microelectrode impalement at the motor endplate. This method allows for the recording of spontaneous miniature endplate potentials and currents (mEPPs and mEPCs), nerve-evoked endplate potentials and currents (EPPs and EPCs), as well as the membrane properties of the motor endplate. Results obtained from this method include the quantal content (QC), number of vesicle release sites (n), probability of vesicle release (prel), synaptic facilitation and depression, as well as the muscle membrane time constant (&#964;m) and input resistance. Application of this technique to mouse models of human disease can highlight key pathologies in disease states and help identify novel treatment strategies. By fully voltage-clamping a single synapse, this method provides one of the most detailed analyses of synaptic transmission currently available.

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

The protocol described in this paper uses the mouse levator auris longus (LAL) muscle to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials (current-clamp) and currents (voltage-clamp) at the neuromuscular junction. Use of this technique can provide key insights into mechanisms of synaptic transmission under normal and disease conditions.

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. This work describes the preparation of rat sciatic nerves for ex vivo neurophysiology, including buffer preparation, animal procedures, equipment setup and neurophysiological recording. This work provides an overview of the different types of experiments possible with this method. The outlined method aims to provide 6 h of stimulation and recording on extracted peripheral nerve tissue in tightly controlled conditions for optimal consistency in results. Results obtained using this method are A-fibre compound action potentials (CAP) with peak-to-peak amplitudes in the millivolt range over the entire duration of the experiment. CAP amplitudes and shapes are consistent and reliable, making them useful to test and compare new electrodes to existing models, or the effects of interventions on the tissue, such as the use of chemicals, surgical alterations, or neuromodulatory stimulation techniques. Both conventional commercially available cuff electrodes with platinum-iridium contacts and custom-made conductive elastomer electrodes were tested and gave similar results in terms of nerve stimulus strength-duration response.

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

This protocol describes the preparation of rat whole sciatic nerve tissue for ex vivo electrophysiological stimulation and recording in an environmentally-regulated, two-compartment, perfused saline bath.

Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...