Die Autoren danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger und K. Svoboda aus dem Genetisch-Encoded Neuronal Indicator und Effector (GENIE) Projekt am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute für ihre großzügige Spende von AAV1-GCaMP6f Zur Universität von Pennsylvania Vector Core. Sie danken auch der A. Olson und Neuroscience Microscopy Core an der Stanford University, unterstützt von NIH NS069375 Grant für ihre konfokalen Mikroskopie Dienstleistungen.

<ol>
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Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. 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Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. 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Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben die Politik der Zeitschrift gelesen und haben folgende konkurrierende Interessen: SG, SO und VC sind bezahlte Mitarbeiter bei Inscopix.

Das Verständnis der neuronalen Kreislaufaktivität während des wachen Verhaltens ist ein wichtiges Niveau der neurowissenschaftlichen Untersuchung, die benötigt wird, um die Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit wirksam zu sezieren. Die Kortex ist eine besonders wichtige Region, um im Kontext des wachen Verhaltens zu studieren, da sie in vielen lebenswichtigen sensorischen, kognitiven und exekutiven Funktionen eine wichtige Rolle spielt. 28 , 29 . Es wird angenommen, dass die kortikale Säule die grundlegende funktionelle Einheit in der Kortex ist und die Populationsaktivität von kortikalen Zellen auf der Grundlage ihrer physikalischen Lage innerhalb der Säule bekannt ist. Zum Beispiel projizieren exzitatorische Neuronen in Schichten 2/3 im somatosensorischen Kortex vorwiegend in andere neokortikale Regionen und modulieren andere kortikale Netzwerke 30 , während Zellen in tieferen Schichten primär zu subkortikalen Regionen wie dem Thalamus 31 projizieren. Aufzeichnung der Aktivität von hundertS von vordefinierten kortikalen Zellen gleichzeitig und zuverlässig über die Zeit über verschiedene Lamina in frei verhaltenden Themen würde unser Verständnis des kortikalen Informationsflusses erheblich vorantreiben, was eine feinere funktionelle Dissektion von kortikalen Säulen ermöglicht, die durch Echtzeit-Verhaltensinformationen und aufgabenrelevante Zeit- Waage. Das Sammeln dieses Niveaus der neuronalen Schaltungsdaten wird durch die Verwendung einer effizienten und stromlinienförmigen miniaturisierten Mikroskopieplattform ermöglicht, um eine großformatige Ca 2+ -Bildgebung in frei verhaltenden Probanden (oder kopffesten Themen wie gewünscht) durchzuführen. Verwendet mit genetisch codierten Calciumindikatoren, um zelltypspezifisches Targeting zu ermöglichen und ein mehrschichtiges Sichtfeld, das von einer chronisch implantierten Prismensonde bereitgestellt wird, zu untersuchen, untersuchte dieses Protokoll einen Fall unter vielen möglichen Anwendungen: Beobachten von laminaren Unterschieden in der somatosensorischen kortikalen Verarbeitung bei Mäusen Physisch mit einem neuartigen Objekt beschäftigt (Abbildung 5 ).Dies ist die erste prozedurale Darstellung dieser Art von zelltypspezifischen, in vivo- Ansatz, um mehrere kortikale Schichten in wachen, frei verhaltenden Tieren zu untersuchen und erweitert das Spektrum der experimentellen Methoden, um Laminarstrukturen im aktiven Gehirn zu verstehen. Das periskopische Sichtfeld, das durch die Prismensonde in dieser Technik ermöglicht wird, kann auf andere Hirnstrukturen angewendet werden, wenn die Erhaltung des Gewebes, das direkt zu einem interessierenden Bereich dorsal ist, erwünscht ist; Zum Beispiel konnte CA3-Bildgebung ohne Unterbrechung der Hippocampus-Funktion erreicht werden. Der prisma-basierte Ansatz zur Abbildung der Ca 2+ -Aktivität erfordert die physikalische Insertion und permanente Implantation eines Mikroprismas in die Kortikalis, was der Entstehung einer kortikalen Läsion entspricht, bei der die Linsensonde eingesetzt wird. Dies kann zu Störungen der lokalen neuronalen Schaltungen führen, einschließlich der Trennung von apikalen Dendriten und Prozessen. TSeine Prozedur wird auch eine anfängliche Aktivierung von Gliazellen in der Region verursachen, obwohl dies erwartet wird, dass sie auf das Gewebe etwa 150 &amp; mgr; m von der Prismenfläche lokalisiert werden, und um nach dem Gehirn zu verhärten 22 . Es ist sehr wichtig zu prüfen, ob diese Technik die normale Schaltkreisanatomie und / oder das Verhalten der Tiere bei der Planung von Experimenten beeinflussen wird. Behavioral Control Groups sollten immer durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass es keine signifikanten Veränderungen in Baseline-Verhaltensweisen, die zu verletzenden experimentellen Ergebnissen führen könnte. Mit dieser miniaturisierten, mobilen Ca 2+ Imaging-Technik mit neuropharmakologischer Manipulation können verschiedene kognitive, soziale, motorische oder intrinsische Verhaltensparadigmen kombiniert und mit anderen physiologischen Metriken kombiniert werden, um Studien zu vertiefen und zu bereichern, die auf das Verständnis der funktionellen Rollen von neuronalen Schaltungen in Verhalten und Signal ausgerichtet sind Verarbeitung 32 . Unterdrückung oder AktivierungDie durch Medikamente moduliert werden, können die damit verbundenen Verhaltensweisen beeinflussen, die mit dieser Technologie leicht untersucht werden können 33 . Die Verzweigung in verschiedene Zelltypen durch die Änderung der Ausrichtung des Kalziumindikators ist eine weitere leistungsfähige und nützliche Anwendung und ermöglicht viele kreative Kombinationen von experimentellen Werkzeugen, um verschiedene neuronale Schaltungsfragen zu lösen.

Die Kortex ist ein wesentlicher Spieler in vielen komplexen mentalen und Verhaltensfunktionen, von der Aufmerksamkeit, der sensorischen Wahrnehmung und der top-down kognitiven Kontrolle 1 , 2 , 3 bis hin zu Motivations-, Belohnungs- und Suchtwegen 4 , 5 . Das Verständnis der Rechenprozesse, die seiner Funktion zugrunde liegen, ist ein wichtiges Ziel, ein besseres klinisches Verständnis vieler geistiger und Verhaltensstörungen zu erreichen. Viele gegenwärtige Theorien der psychiatrischen Erkrankung konzentrieren sich um die Idee, dass kortikale neuronale Kreislaufdysfunktion oder Diskoordination kognitiven und Verhaltensanomalien unterliegen können, die das Kennzeichen von Bedingungen wie Schizophrenie 6 , Autismus 7 oder Zwangsstörungen sind. So erhalten die Populationsniveau neuronale Aktivitätsdaten von coRtische Schaltungen innerhalb des richtigen Kontextes gleichzeitiger Verhaltensinformationen sind von großer Bedeutung und können idealerweise auf spezifische Zelltypen für eine feinere neuronale Schaltungsdissektion ausgerichtet sein. Miniaturisierte Mikroskope in Verbindung mit implantierbaren Gradientenbrechungsindex (GRIN) Mikrolinsen ermöglichen den optischen Zugang zu neuronalen Ensembles unter frei beweglichen Zuständen aus einer Vielfalt möglicher Hirnareale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 einschließlich der Kortex 14 , 15 , 16 . Die Verwendung eines mobilen Mikroskopiesystems, das mit genetisch codierten Calciumindikatoren gekoppelt ist, ermöglicht eine konsistente Abbildung der gleichen zellulären Population, die Hunderte von Neuronen über Tage bis Wochen in vielen Hirnregionen 9 umfasst und kannGenetisch auf spezifische Zelltypen mit viralen Vektor oder transgenen Techniken gerichtet. Da die Kortex bekannt ist, verschiedene Funktionen zu unterstützen und sich in Abhängigkeit von der Lage der Zellen innerhalb der kortikalen Lamina 17 , 18 , 19 mit verschiedenen Hirnregionen zu verbinden, sind wir daran interessiert, eine gleichzeitige mehrschichtige neuronale Aktivität bei wachverhaltenden Probanden zu erhalten. Hier zeigen wir, wie man Hunderte von fluoreszenzbeschrifteten Neuronen in frei verhaltenden Mäusen über Tage bildt, wobei das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 mit einer implantierten Prismensonde gepaart wird, die eine mehrschichtige Sicht auf die Kortikalis bietet (Abbildung 1 ). Die hier verwendete Prismensonde besteht aus zwei getrennten GRIN-Objektiven: einem Prisma und einer zylindrischen Relaislinse ( Bild 1 ). Das Licht aus dem Mikroskop erregt die fluoreszenzbeschriftetZellen, die sich entlang der Abbildungsfläche der Prismensonde befinden, nachdem sie von der Hypotenuse des Prismenabschnitts der Sonde reflektiert wurden. Das emittierte Licht aus den Zellen reflektiert auch die Hypotenuse des Prismas, wird durch das Ziel des Mikroskops gesammelt und erreicht den Sensor im Mikroskop. Die in diesem Verfahren verwendete Prismensonde eignet sich für den einfachen Gebrauch mit Standard-Stereotax-Ausrüstung. Das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 detektiert aktionspotential-evozierte Ca 2+ -Transienten in neuronalen Populationen mit Einzelzell-Auflösung, nachdem diese Zellen spezifisch mit Ca 2+ -sensitiven genetisch codierten Fluoreszenzindikatoren markiert wurden. In diesem Protokoll injizieren wir den in einem viralen Vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) codierten Ca 2+ -Anderindikator, implantieren eine Prismensonde, installieren das Mikroskop und erhalten dann mehrere Tage somatosensorische (s1 hintere Gliedmaßen) neuronale Aktivitätsdaten Von einem Tier aussetzenD zu neuartigen Objektoberflächen während der freien Exploration (Abbildung 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In-vivo -Schaltung und zelluläre Ebene funktionale Bildgebung ist ein kritisches Werkzeug für das Verständnis des Gehirns in Aktion. Die hochauflösende Bildgebung von Mauskortikalen Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einzigartige Einblicke in die kortikale Struktur, Funktion und Plastizität. Allerdings sind diese Studien auf Kopf feste Tiere begrenzt, stark reduziert die Verhaltenskomplexität zur Verfügung für die Studie. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung einer chronischen Fluoreszenzmikroskopie mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten bei frei verhaltenden Mäusen. Wir verwendeten ein integriertes miniaturisiertes Fluoreszenzmikroskop, gepaart mit einer implantierten Prismensonde, um gleichzeitig die Kalziumdynamik von Hunderten von Neuronen über mehrere Schichten des somatosensorischen Kortex zu visualisieren und aufzuzeichnen, wie die Maus in einer neuartigen Objekt-Explorationsaufgabe über mehrere Tage hinweg. Diese Technik kann an andere Hirnregionen in verschiedenen Tierarten für andere Verhaltensweisen angepasst werdenAradigms

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen effektiven und effizienten Weg, um eine mehrschichtige Ca 2+ -Bildgebung von Hunderten von kortikalen Neuronen in frei verhaltenden Mäusen unter Verwendung von Prismensonden durchzuführen (Abbildung 1 ). Bisherige Ansätze zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung wurden in erster Linie auf kopffeste Tiere 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 beschränkt. Um diese Datenebene in einem frei verhaltenen Kontext zu erwerben, wurde eine miniaturisierte Mikroskopplattform für Verhaltensflexibilität eingesetzt; Ein genetisch codierter Calciumindikator (GCaMP6f) wurde verwendet, um eine spezifische Zellpopulation (CAMKII + Zellen in der Kortex) zu zielen; Und eine Prismensonde wurde gewählt, um ein chronisches, mehrschichtiges Gesichtsfeld zu schaffen. <p class="jove_content" fo:keep-dieIn-Seite = &quot;1&quot;&gt; Wir haben den Arbeitsablauf zur Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung vorgestellt. Ein viraler Vektor, der für einen geeigneten Calciumindikator kodiert, wurde in den Kortex injiziert ( Fig. 2 , Schritt 1), bevor er eine Prismensonde chronisch implantiert, um einen optischen Zugang zu den markierten Zellen zu ermöglichen ( Fig. 2 , Schritt 2). Eine Basisplatte, die als sicheres, temporäres Dock für die Positionierung des Mikroskops während der Bildgebungssitzungen dient, wurde dann über dem Kopf des Tieres installiert (Abbildung 2 , Schritt 3), was die Visualisierung der kortikalen Aktivität über mehrere Zellschichten in einem wachen, das sich experimentell verhält, ermöglicht Setup ( Abbildung 2 , Schritt 4). Um sicherzustellen, dass die gewünschte zelluläre Population angestrebt wurde, ist in Abbildung 3 ein postmortiver koronaler Hirnabschnitt von einer repräsentativen Maus dargestellt, wobei der Prisma-Sonden-Trakt und das im Vergleich zum GCaMP6f-Labor markierte SichtfeldEeligen Neuronen in den Schichten 2/3 und 5 der somatosensorischen Kortex. Während des wachen Verhaltens mit dem System wurde die Aktivität der somatosensorischen kortikalen Neuronen aufgezeichnet, als die Maus drei verschiedenen Umgebungen ausgesetzt war - Open Field (Tag 1), Objekt-Vertrautmachung (Tag 2-4) und neuartiges Objekt (Tag 5) ( Abbildung 4 ). Am Tag 1 wurde die Maus in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände gelegt. Am Tag 2-4 wurde die Maus in die Arena mit den gleichen zwei texturally verschiedenen Objekten (ein Gel-Pad und ein Holz-Block) platziert. Am 5. Tag wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt ersetzt. Das Tier wurde über 5 Tage für 20 min pro Tag abgebildet. Nach der Zellextraktion unter Verwendung der Ca 2+ Bilddatenanalyse-Software wurden räumliche Filter, die den Zellorten entsprechen, auf der mittleren Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufzeichnungsdaten überlagert( Fig. 5) . Eine weiße gestrichelte Linie trennt die Schichten 2/3 und 5 Zellen. Entsprechende Ca 2+ Spuren aus 5 Zellen aus jeder der Schichten zeigen das Zündmuster der Zellen in zwei verschiedenen Verhaltenskontexten - Objektvertrautheit und neuartige Objektbelichtung. Schicht-2/3-Zellen waren im Vergleich zu Schicht-5-Zellen am Tag, an dem die Maus einem neuartigen Objekt ausgesetzt war, aktiver. Dies zeigt sich auch aus den Rasterplots, die an den Tagen 1, 4 und 5 die schwankende Zündaktivität aller abgebildeten Zellen zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Abbildung 1: In vivo Ca 2+ Bildgebung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen. ( A ) Prismen-Sonden-Spezifikationen und Darstellung der Bilderzeugungsebene. Die reflektierende Beschichtung auf der Innenseite der Hypotenuse ermöglicht die Abbildung von 90 ° aus der Einsteckebene der Prismensonde. Die Linse cuFf integriert sich mit dem Linsenhalter, der das Implantationsverfahren optimiert und eine mögliche Betrachtung der Umgebungsgewebsfluoreszenz während der Implantation ( B ) (i) ermöglicht. Abbildung der Platzierung der Prismensonde Craniotomie und Messerinzision relativ zur Virusinjektionsstelle und (ii) Darstellung der Lage der Prismensonde flache Seite relativ zum Messereinschnitt und der Virusinjektionsstelle. ( C ) Darstellung des in-vivo Ca 2+ -Bildgebungsaufbaus, der den Lichtweg für einen kleinen Bereich innerhalb des vollen Gesichtsfeldes durch eine im Mauskortex implantierte Prismensonde zeigt. ( D ) Beispiel-Sichtfeld bei der Prisma-Sonde. Das Miniaturmikroskop ist an der Linsenhalterung befestigt, die die Prismensonde hält und die Überprüfung der Virusausdruck während der Prisma-Sonde ermöglicht. ( E ) Integration des Mikroskops mit Prismensonde zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung von GCaMP6f-markierten S1-Zellen. F Beispiel SichtfeldBei der Grundplatteninstallation. Klares Blutgefäßmuster ist zum Zeitpunkt der Basisplatte sichtbar mit einigen Zellen im Rohbild sichtbar. Weitere Zellen sind deutlich sichtbar, wenn DF / F im Fenster der Erfassungssoftware eingeschaltet ist. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zeitleiste von Workflow-Ereignissen für Prisma-Sonden-Implantation und Mikroskop-Installation. Die Anzahl der Wochen ist auf der X-Achse und die Workflow-Schritte der Prozeduren entlang der Y-Achse dargestellt. ( A ) Grafische Darstellung der viralen Injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) entlang der gleichen dorso-ventralen Achse, um mehrere Schichten der Maus somatosensorischen Kortex zu markieren. ( B ) 2 Wochen nach Virusinjektionen, ein PrismaproblemE wird an einer Achse implantiert, die parallel zu den Virusinjektionsstellen ist. ( C ) Ungefähr eine Woche nach der Prismensondenimplantation wird das Tier auf den Ausdruck mit dem Mikroskop überprüft und eine Basisplatte wird auf dem Kopf angebracht, wenn eine Population von Zellen sichtbar ist. ( D ) Das Tier ist dann für die chronische Bildgebung bei relevanten Verhaltensaufgaben bereit (Mausclip, modifiziert nach Genehmigung von - UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Abbildung 3: Postmortem Histologische Validierung der Prismensondenposition und GCaMP Expression. ( A ) Koronaler Abschnitt von einem repräsentativen Maus-Gehirn, das den Prismen-Sonden-Trakt zeigt und mit seiner bildgebenden SeiteDie GCaMP6f-exprimierenden Zellen (AAV1.CaMKII.GCaMP6f, ausgedrückt in Neuronen in den Schichten 2/3 und 5). ( B ) Gleiche koronale Hirnsektion nach Färbung für DAPI. Maßstab = 250 μm ( C ) Vergrößerte Ansicht von GCaMP6f-exprimierenden Zellen in somatosensorischem Kortex. Maßstab = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Abbildung 4: Mäuseaktivität während der Habituation, Vertrautmachung und neuartige Objektbelichtungstests wurde mit Video-Software aufgezeichnet. ( A ) Am Tag 1 wurde das Tier in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände (Open Field) gestellt. ( B ) An den Tagen 2-4 wurden die gleichen zwei texturisch unterschiedlichen Objekte (Gel-Pad und Holzblock) in die Arena gelegt (Object FamiLilierung). ( C ) Am Tag 5 wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt (Holzblock mit Sandpapier) ersetzt (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Abbildung 5: Calcium-Dynamik von oberflächlichen und tiefen Schichten des somatosensorischen Cortex einer repräsentativen Maus mit dem Mikroskop abgebildet. ( A ) Zusammengeführtes Bild von neuronalen Raumfiltern (grüne Blobs) und mittlere Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufnahme durch Prismensondenfeld. Grenze zwischen supragranularen und infragranulären Schichten, die durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt sind. Maßstab = 100 μm. ( B ) Calciumspuren aus fünf beispielhaften oberflächlichen und tiefen Schichtzellen (gefüllt blau und rot cElls in Panel A), Angabe von Einheiten der Standardabweichung der Fluoreszenz nach prinzipieller und unabhängiger Komponentenanalyse. Horizontale Skalenstange 50 s und vertikale Skalenleiste 10 SD ( C ) Rasterplot von Zellen aus oberflächlichen (Schichten 2/3) und tiefen Schichten (Schicht 5) gezeigt über offenes Feld, Objekt-Vertrautmachung und neuartige Objekt-Exploration. Maßstab = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K Aufrufe.  Inscopix Inc..  Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden. 

Serie: Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and molecular approaches allow the investigation of either different stimuli on few neurons, or one stimulus in large parts of the brain, blood oxygenation level dependent (BOLD) functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) allows combining both advantages, i.e. compare the neural activation induced by different stimuli in the entire brain at once. fMRI in songbirds is challenging because of the small size of their brains and because their bones and especially their skull comprise numerous air cavities, inducing important susceptibility artifacts. Gradient-echo (GE) BOLD fMRI has been successfully applied to songbirds 1-5 (for a review, see 6). These studies focused on the primary and secondary auditory brain areas, which are regions free of susceptibility artifacts. However, because processes of interest may occur beyond these regions, whole brain BOLD fMRI is required using an MRI sequence less susceptible to these artifacts. This can be achieved by using spin-echo (SE) BOLD fMRI 7,8 . In this article, we describe how to use this technique in zebra finches (Taeniopygia guttata), which are small songbirds with a bodyweight of 15-25 g extensively studied in behavioral neurosciences of birdsong. The main topic of fMRI studies on songbirds is song perception and song learning. The auditory nature of the stimuli combined with the weak BOLD sensitivity of SE (compared to GE) based fMRI sequences makes the implementation of this technique very challenging.

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

This article shows an optimized procedure for imaging of the neural substrates of auditory stimulation in the songbird brain using functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI). It describes the preparation of the sound stimuli, the positioning of the subject and the acquisition and subsequent analysis of the fMRI data.

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Forschung

Verhalten

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential cellular mechanism underlying learning and information storage, have long been used to elucidate the physiology of various neuronal circuits in the hippocampus, amygdala, and other limbic and cortical structures. With this in mind, transgenic mouse models of neurological diseases represent useful platforms to conduct long-term&#160;potentiation (LTP) studies to develop a greater understanding of the role of genes in normal and abnormal synaptic communication in neuronal networks involved in learning, emotion and information processing. This article describes methodologies for reliably inducing LTP in the freely behaving mouse. These methodologies can be used in studies of transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neurodegenerative diseases.

Transgenic and knockout mouse models of neurological diseases are useful for studying the role of genes in normal and abnormal neurophysiology. This article describes methodologies which can be used to study long-term potentiation, a cellular mechanism which may underlie learning and memory, in transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neuropathology.

Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology to quantitatively assess children&#39;s cortical processing of light touch, speech sounds and the multisensory processing of the 2 stimuli, without requiring active subject participation or causing children discomfort. To accomplish this we developed a dual channel, time and strength calibrated air puff stimulator that allows both tactile stimulation and sham control. We combined this with the use of event-related potential methodology to allow for high temporal resolution of signals from the primary and secondary somatosensory cortices as well as higher order processing. This methodology also allowed us to measure a multisensory response to auditory-tactile stimulation.

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology to quantitatively assess infants and children&#39;s cortical processing of light touch, speech sounds, and the multisensory processing of the 2 stimuli, without requiring active subject participation or causing discomfort in vulnerable patients.

Quantitative Bewertung der kortikalen Auditory-taktile Verarbeitung bei Kindern mit Behinderungen

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with schizophrenia who are at familial high risk (FHR) may show similar cognitive and emotional changes. However, the neurological changes underlying the emergence of these symptoms remain unclear. This study sought to identify differences in frontal, striatal, and limbic regions in children and adolescents with FHR using functional magnetic resonance imaging. Groups of 21 children and adolescents at FHR and 21 healthy controls completed an emotional oddball task that relied on selective attention and the suppression of task-irrelevant emotional information. The standard oddball task was modified to include aversive and neutral distractors in order to examine potential group differences in both emotional and executive processing. This task was designed specifically to allow for children and adolescents to complete by keeping the difficulty and emotional image content age-appropriate. Furthermore, we demonstrate a technique for suitable fMRI registration for children and adolescent participants. This paradigm may also be applied in future studies to measure changes in neural activity in other populations with hypothesized developmental changes in executive and emotional processing.

This paper describes how to use the emotional oddball task and fMRI to measure brain activation in children and adolescents at familial high risk for schizophrenia (FHR).&#160;FMRI was used to measure differences in fronto-striato-limbic regions during an emotional oddball task. Children with FHR exhibited abnormal functional activation during adolescence.

Die Messung der Fronto-limbischen Aktivität unter Verwendung einer emotionalen Oddball Aufgabe bei Kindern mit familiärer High Risk for Schizophrenia

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure multiple dimensions of unconditioned behavior in small laboratory mammals (e.g., mice, rats, tree shrews and small primates). This paradigm is a valuable alternative for the use of a behavioral test battery, since a broad behavioral spectrum of an animal&#8217;s behavioral profile can be investigated in one single test.
The apparatus consists of a box, representing the &#8216;protected&#8217; area, separated from a group compartment. A board, on which small cylinders are staggered in three lines, is placed in the center of the box, representing the &#8216;unprotected&#8217; area of the set-up. The cognitive abilities of the animals can be measured by baiting some cylinders on the board and measuring the working and reference memory. Other unconditioned behavior, such as activity-related-, anxiety-related- and social behavior, can be observed using this paradigm. Behavioral flexibility and the ability to habituate to a novel environment can additionally be observed by subjecting the animals to multiple trials in the mHB, revealing insight into the animals&#8217; adaptive capacities.
Due to testing order effects in a behavioral test battery, na&#239;ve animals should be used for each individual experiment. By testing multiple behavioral dimensions in a single paradigm and thereby circumventing this issue, the number of experimental animals used is reduced. Furthermore, by avoiding social isolation during testing and without the need to food deprive the animals, the mHB represents a behavioral test system, inducing if any, very low amount of stress.

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

Der modifizierte Loch Board - Mess Verhalten, Kognition und Sozialinteraktion an Mäusen und Ratten

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs frequency-specific stimulation of the human brain through current applied to the scalp with surface electrodes. Most current knowledge of the technique is based on behavioral studies; thus, combining the method with brain imaging holds potential to better understand the mechanisms of tACS. Because of electrical and susceptibility artifacts, combining tACS with brain imaging can be challenging, however, one brain imaging technique that is well suited to be applied simultaneously with tACS is functional magnetic resonance imaging (fMRI). In our lab, we have successfully combined tACS with simultaneous fMRI measurements to show that tACS effects are state, current, and frequency dependent, and that modulation of brain activity is not limited to the area directly below the electrodes. This article describes a safe and reliable setup for applying tACS simultaneously with visual task fMRI studies, which can lend to understanding oscillatory brain function as well as the effects of tACS on the brain.

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations, though its effects are not completely understood. This article describes a safe and reliable setup for applying tACS simultaneously with functional magnetic resonance imaging, which can increase understanding oscillatory brain function and effects of tACS.

Gleichzeitige transkranielle Wechselstromstimulation und funktionelle Magnetresonanztomographie

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For example, in the cat, visual information about an impending obstacle can modulate stepping for avoidance. Locomotor adaptation can also occur independent of vision, as sudden tactile inputs to the leg by an expected obstacle can modify the stepping of all four legs for avoidance. Such complex locomotor coordination involves supraspinal structures, such as the parietal cortex. This protocol describes the use of reversible, cooling-induced cortical deactivation to assess parietal cortex contributions to memory-guided obstacle locomotion in the cat. Small cooling loops, known as cryoloops, are specially shaped to deactivate discrete regions of interest to assess their contributions to an overt behavior. Such methods have been used to elucidate the role of parietal area 5 in memory-guided obstacle avoidance in the cat.

Complex locomotion in naturalistic environments requiring careful coordination of the limbs involves regions of the parietal cortex. The following protocol describes the use of reversible cooling-induced deactivation to demonstrate the role of parietal area 5 in memory-guided obstacle avoidance in the walking cat.

Reversible Kühlung-induzierte Deaktivierungen kortikalen Beiträge zum Hindernis Speicher in der zu Fuß Katze zu studieren

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and human studies to investigate the cortical processing of nociceptive information. These laser-evoked brain potentials (LEPs) consist of several transient responses that are time-locked to the onset of laser stimuli. However, the functional properties of the LEP responses are still largely unknown, due to the lack of a sampling technique that can simultaneously record neural activities at the surface of the cortex (i.e., electrocorticogram [ECoG] and scalp electroencephalogram [scalp EEG]) and inside the brain (i.e., local field potential [LFP]). To address this issue, we present here an animal protocol using freely moving rats. This protocol is composed of three main procedures: (1) animal preparation and surgical procedures, (2) a simultaneous recording of ECoG and LFP in response to nociceptive laser stimuli, and (3) data analysis and feature extraction. Specifically, with the help of a 3D-printed protective shell, both ECoG and LFP electrodes implanted on the rat&#39;s skull were securely held together. During data collection, laser pulses were delivered on the rat&#39;s forepaws through gaps in the bottom of the chamber when the animal was in spontaneous stillness. Ongoing white noise was played to avoid the activation of the auditory system by the laser-generated ultrasounds. As a consequence, only nociceptive responses were selectively recorded. Using the standard analytical procedures (e.g., band-pass filtering, epoch extraction, and baseline correction) to extract stimulus-related brain responses, we obtained results showing that LEPs with a high signal-to-noise ratio were simultaneously recorded from ECoG and LFP electrodes. This methodology makes the simultaneous recording of ECoG and LFP activities possible, which provides a bridge of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, thereby facilitating the investigation of nociceptive information processing in the brain.

We developed a technique that simultaneously records both electrocorticography and local field potentials in response to nociceptive laser stimuli from freely moving rats. This technique helps establish a direct relationship of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, which facilitates the investigation of nociceptive information processing in the brain.

Gleichzeitige Aufnahmen von kortikalen lokales Feld Potentialen und Electrocorticograms in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and ...

Mehrschicht-Cortical Ca

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